專利名稱：：具有增加的游離賴氨酸的轉(zhuǎn)基因玉米種子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：在此公開的是由轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞中的重組DNA所導(dǎo)致的含有提高的游離賴氨酸7jC平的轉(zhuǎn)基因玉米種子，以及生產(chǎn)和4柳該種子的方法。
背景技術(shù)：
：Dizigen等在US1005/0132437Al中公開了高賴氨,米組合物，含有表達(dá)二氫吡啶甲酸合酶的重組DNA，其作為營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)的動(dòng)物飼料是有用的。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因Ht種子具有至少1300ppm的游離賴氨酸，例如在1300和4000ppm的游離賴氨酸之間，由轉(zhuǎn)基因，細(xì)胞中重組DNA的表達(dá)所導(dǎo)致，該重組DNA包含與抑制內(nèi)源LKR-SDH蛋白產(chǎn)生的DNA可操作性連接的胚特異性啟動(dòng)子和與抑制內(nèi)源LKR-SDH蛋白產(chǎn)生的DNA可操作性連接的胚乳特異性啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因玉米種子進(jìn)一步包含編碼氨酸生物合成中有活性的蛋白的DNA，該DNA與胚乳特異性啟動(dòng)子可操作性連接。本發(fā)明的幾個(gè)方面是玉米細(xì)胞，其具有的重組DNA包含pMON99142的T-DNA邊界間的DNA或者pMON99143的T-DNA邊界間的DNA。本發(fā)明的另一方面提供了重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體對(duì)于提供游離賴氨酸水平提高的轉(zhuǎn)基因玉米種子是有效的。該重組DNA構(gòu)建體包含與抑制內(nèi)源LKR-SDH蛋白產(chǎn)生的DNA可操作性連接的胚特異性啟動(dòng)子和與抑制內(nèi)源LKR-SDH蛋白產(chǎn)生的DNA可操作性連接的胚乳特異性啟動(dòng)子。該重組DNA的實(shí)施方式進(jìn)一步包含編碼在賴氨酸生物合成中有活性的蛋白的DNA，該DNA與胚乳特異性啟動(dòng)子可操作性連接。該重組DNA的幾個(gè)方面由pMON99142或pMON99143的T-DNA邊界間的DNA說(shuō)明。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)游離賴氨酸7K平提高的玉米籽粒的方法，通過(guò)繁殖具有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的玉米植物進(jìn)fi1，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是用本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建,化的玉米細(xì)胞的后代。附圖簡(jiǎn)述圖1和圖2闡述了質(zhì)粒圖。圖3是重組DNA構(gòu)建體的示意圖。發(fā)明詳述在此使用的LKR-SDH意指賴氨酸分解代謝蛋白賴氨酸酮戊二酸還原,lysinecatabolicproteinlysineketoglutaratereductase)膽^M翻兌氫酶(saccharopinedehydrogenase)。針對(duì)LKR結(jié)構(gòu)域或者SDH結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)用于本發(fā)明的有效基因抑制元件。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠利用可商購(gòu)的材料和公知的、己公開的方法容易地制備重組DNA構(gòu)建體。用于基因抑制的重組DNA構(gòu)建體可根據(jù)US2004-0029283Al所闡述和公開的來(lái)制備。制備用于轉(zhuǎn)化的重組DNA構(gòu)建體和載體的實(shí)用技術(shù)是GATEWAY克隆技術(shù)(可獲自InvitrogenLifeTechnologies,Carlsbad^California)，禾,來(lái)自噬菌體人載鵬建的齡酶誠(chéng)系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性重組酶LR克隆反應(yīng)，而不是限制性內(nèi)切酶和連接酶。該LR克隆反應(yīng)公開于美國(guó)專利5,888,732和6,277,608以及美國(guó)專利公開US2001-283529Al、US2001匿282319Al、US2002-0007051Al和US2004一0115642Al中。Invitrogen也提供GATEWAY克隆技術(shù)j頓手肌提供了用于榭壬何目的DNA克隆入含有可操作性植物表達(dá)元f牛的載體的常規(guī)方法的簡(jiǎn)要說(shuō)明。另一種載體的制備方法^^用AslandisC.等，W議:toc尺e&,18,6069-6074，1990和Rashtchian,A.等，說(shuō)ocAem.,206,91-97,1992公開的不娜連接的克隆(ligation-independentclomng)方法，其中具有單鏈5，和3'端的DNA片段接入目的載體內(nèi)，其然后育灘在體內(nèi)擴(kuò)增。將DNA分子按預(yù)定次序鄉(xiāng)且裝入0忖八構(gòu)建體內(nèi)的方法也公開于公布的美國(guó)專利申請(qǐng)1^2006-_(系列號(hào)11/298,234)中。在植物細(xì)胞中具有活性的許多啟動(dòng)子已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述。可用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子中的有用啟動(dòng)^括從種子基因中獲取的啟動(dòng)子，如napin(美國(guó)專利5,420,034)、comL3油質(zhì)蛋白(comL3oleosin)(美國(guó)專利6,433,252)、玉米蛋白Z27(zeinZ27)(Russell等(1997)『rara伊w/c6(2):157-166)、球蛋白l(globulinl)(Belanger等(1991)Ge"efc129:863-872)、谷蛋白l(glutelin1)(Russell(1997)同上)、過(guò)氧化物氧化還原酶的抗氧化劑(Perl)(peroxiredoxinantioxidant)(Stacy等(1996)尸/o^Mo/說(shuō)o/.31(6):1205-1216)、以及B32(Hartings等(1990)尸/o^A^/說(shuō)o/，14:1031-1040)。實(shí)踐中，在任一轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，DNA僅導(dǎo)入很小百分比的靶細(xì)胞中。^i己基因用于提供鑒定已穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的有效系統(tǒng)，所述細(xì)胞己經(jīng)接收了轉(zhuǎn)基因DNA構(gòu)建體并且已將其^入它們的基因組。優(yōu)選的標(biāo)記基因提供了選華性標(biāo)記，其賦予對(duì)選擇劑的抗性，如抗生素或除草劑抗性。對(duì)于選擇性標(biāo)記，本發(fā)明的植物可能所抗的任何除草劑都是有用的試劑。將可能轉(zhuǎn)化的細(xì)胞暴該選擇劑中。幸存下來(lái)的細(xì)胞糊各是這樣的一些細(xì)胞，其通常齡了賦予抗性的基因并且以足以允許細(xì)胞存活的水平表達(dá)。細(xì)胞可以被進(jìn)一步檢驗(yàn)，以證實(shí)己穩(wěn)定整合了外源DNA。通常使用的選擇性標(biāo)記基因包括那些賦予抗生素抗性的基因，如卡那霉素("^//)、潮霉素B(a一/F)和慶大霉素和"acC4)，或者賦予除草劑抗性的基因，如草銨膦(6w^/^)以及草甘膦(EPSPS)。這樣的選擇性標(biāo)記的實(shí)例在美國(guó)專利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中有述。還可以JOT篩選標(biāo)記，其提供了肉眼鑒定轉(zhuǎn)化體的能力，例如表達(dá)有色蛋白或熒光蛋白如熒光素酶或綠色熒光蛋白(GFP)的基因，或者表達(dá)P-葡萄糖醛酸酶的基因，或者w必基因(GUS)，其不同的顯色底物是已知的。本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因種子，在它的基因組內(nèi)具有重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含(a)可操作性連接至少一個(gè)第一基因抑制元件的植物胚乳特異性啟動(dòng)子，所述基因抑制元《柳制賴氨酸分解代謝蛋白例如LKR陽(yáng)SDH的產(chǎn)生，(b)與所述植物胚乳特異性啟動(dòng)子方向相反的植物胚,寺異性啟動(dòng)子，j立于所述的至少一個(gè)第一基因抑制元件的3端。該植物胚特異性啟動(dòng)子可操作性連接第二基因抑制元件，以抑制賴氨酸分解代謝蛋白LKR-SDH的產(chǎn)生。第二基因抑制元件可以包含與第一個(gè)基因抑制元件相同的或不同的DNA，例如靶向LKR-SDH基因不同結(jié)構(gòu)域?；蛞种圃?以例如與鄰近的啟動(dòng)子(頭接頭)或與鄰近的終止子(尾部接尾部)相同的或相反的方向組裝入重組DNA構(gòu)建體內(nèi)。在轉(zhuǎn)基因種子的一些實(shí)施方式中，重組DNA構(gòu)建體進(jìn)一步包含編碼賴氨酸生物合成酶的DNA，該DNA與胚乳特異性啟動(dòng)子連接。在一些實(shí)施方式中，基因抑制元件和表達(dá)蛋白的表達(dá)元件與一個(gè)啟動(dòng)子可操作性連接，該基因抑制元件可以被嵌入到內(nèi)含子中，在許多實(shí)施方式中所述內(nèi)含子為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)內(nèi)含子，例如，"增強(qiáng)子"諸如水稻肌動(dòng)蛋白1基因、水稻肌動(dòng)蛋白2基因、玉米乙醇脫氫酶基因、玉米熱激蛋白70基因和玉米鈹縮1基因(comshrunken1gene)的5'端內(nèi)含子。編碼賴氨酸生物合成酶的有用DNA來(lái)自于夕卜源賴氨酸不敏感的二氫吡啶甲H(dihydrodipicoMcacid)合酶(DHDPS)基因，例如公開于美國(guó)專利5,773,691和6,459,019中的棒桿菌(Coo^&cfenwm)DHDPS基因。當(dāng)表達(dá)編碼DHDPS酶的DNA時(shí)，將它與編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA連接是有用的，如玉米DHDPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞具有本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體已穩(wěn)定S^入它們基因組內(nèi)，以致于該重組DNA遺傳給后代植物和種子。這樣的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞重的某些實(shí)施方式中，組DNA是純合的。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的重組DNA構(gòu)建體、它們的使用方法，以及含有這樣構(gòu)建體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。這樣的重組DNA構(gòu)建體可以在質(zhì)粒pMON99142和pMON99143上找到，以下有更詳細(xì)地描述。用重組DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的許多方法在本領(lǐng)域是已知的，并且可用來(lái)制備轉(zhuǎn)基因玉米。通常使用的兩個(gè)植物轉(zhuǎn)化方法是土壤農(nóng)桿菌(Agrobactenum)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和微粒轟擊。用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞的微粒轟擊方法描述于美國(guó)專利5,550,318、5,538,880、6,160,208和6,399，861中，用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞的土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法描述于美國(guó)專利5,591,616中。基于根癌土壤農(nóng)桿菌C4gra&ctenww^^/coera)的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化構(gòu)建體上存在的其它元件包括根癌土壤農(nóng)桿菌T-DNA的左和/或右邊界序列(通常包括左右兩個(gè)邊界序列，但劍腿的是至少一個(gè)邊界序列，例如至少右邊界序列)，以利于重組多核苷1M合入植物基因組中。玉米的轉(zhuǎn)化,在受控環(huán)境下的培養(yǎng)基上在組織培養(yǎng)中進(jìn)行。"培養(yǎng)基"是指用于細(xì)胞體外生長(zhǎng)的多種養(yǎng)分混合物，體外也就是指完整活生物體以夕卜。受體細(xì)胞耙包括，但不局限于，分生組織細(xì)胞、愈傷組織、未成冉的胚，以及配子細(xì)胞如小孢子(microspores)、花粉、精子和卵細(xì)胞?？紤]到可由其再生出，可育植物的任何細(xì)胞均可用作受體細(xì)胞。愈傷組織可以源自于組織來(lái)源(tissuesources),包括但不限于，未成熟的胚、幼苗頂端分生組織、小包子等等。會(huì),增歹誠(chéng)為愈傷組織的細(xì)胞也是用于遺傳轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的實(shí)用的轉(zhuǎn)化方法和材料，例如不同的培養(yǎng)基和受鵂巴細(xì)胞，未成熟胚的轉(zhuǎn)化和1W轉(zhuǎn)基因植物的隨后再生，已公開于美國(guó)專利6,194,636和6,232,526和美國(guó)專利申請(qǐng)公開US2004-0216189Al中。轉(zhuǎn)基因植物的種子可以從可育轉(zhuǎn)基因植物收獲，并且用于生長(zhǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的后代，包括含表達(dá)基因抑制元件的重組DNA構(gòu)建體的雜交植物品系。本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米種子的不同方法，該轉(zhuǎn)基因玉米種子具有提高的賴氣酸水平，即至少1300ppm的游離賴氨酸或更多，例如至少1500ppm或更高，至少2000ppm或300ppm，高達(dá)4000ppm的游離賴氨酸。這樣的方^&括轉(zhuǎn)化玉米植物品系，并將本發(fā)明的重組DNA從細(xì)胞內(nèi)含有該重組DNA的玉米植物滲入(Wragmro"g)到另一玉米植物品系。這樣方法的一個(gè)方面包括(a)選擇第一轉(zhuǎn)基因玉米植物，它的細(xì)胞內(nèi)包含本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體；(b)將重組DNA構(gòu)建條入到第二玉米植物；(c)種植第二玉米植物的種子，產(chǎn)生后代玉米植物群體；(d)篩選后代玉米植物群體，獲得與非轉(zhuǎn)基因玉米植物相比其產(chǎn)生的玉米種子中具有提高的賴氨酸水平的后代玉米植物；(e)從所述群體中選擇與非轉(zhuǎn)基因玉米植物相比，其產(chǎn)生的玉米種子具有提高的賴氮酸水平的一種或多種后代玉米植物；(f)驗(yàn)證重組DNA構(gòu)建體已穩(wěn)定地整合入中選的后代玉米植物中；(g)驗(yàn)證中選的后代玉米植物與缺少重組DNA構(gòu)建體的玉米植物相比，其體內(nèi)的LKR-SDH賴氨酸分解代謝基因(lysinecatabolismgene)己被沉默；(h)從中選的后代玉米植物中收集轉(zhuǎn)基因玉米種子。實(shí)施例1本實(shí)施例詳述重組DNA構(gòu)建體的制備，該構(gòu)建體用于制備含有本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因玉米植物和種子。參考圖l和SEQIDNO:l(其是質(zhì)粒pMON99142上的DNA的一^!連的核苷歹1」)，將兩個(gè)基因抑制重組DNA構(gòu)建i射菌入根癌土壤農(nóng)桿菌的左和右T-DNA邊界之間來(lái)制備植物轉(zhuǎn)lh質(zhì)禾立。T-DNA的邊界之間是(a)LKR基因抑制重組DNA構(gòu)建體，是將玉米L3啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列(即美國(guó)專利6,433,252公開的來(lái)自于玉米L3油質(zhì)蛋白基因的玉米胚特異性啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列)的DNA可操作性與"LKR抑制元件"(穩(wěn)定的反義構(gòu)建體，其包含來(lái)自玉米LKR-SDH基因LKR結(jié)構(gòu)域的DNA的大約947M^對(duì)作為反義向的片段排列)的DNA連接，隨后連接有義向的片段并且以小麥hspl7終止子(即小麥(7h力a^ae勸'vwm)熱激蛋白17基因的多聚腺苷酸化位點(diǎn)(polyadenylationsite)和信號(hào))的DNA終止來(lái)制備的。(b)SDH基因抑制重組DNA構(gòu)建體，是將玉米B32啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列(即玉米B32基因的玉米胚乳特異性啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列，該基因?yàn)镚enBank登錄號(hào)X70153公開的848-1259間的核苷酸)的DNA可操作性與"SDH抑制元件"(穩(wěn)定的反義構(gòu)建體，包含玉米LKR-SDH基因SDH結(jié)構(gòu)域DNA的大約1254ii^對(duì)作為反義向排列的片段，并隨后連接有義向的片段)的DNA連接，并且以玉米GM終止子(即玉米球蛋白l基因(Zeamq>globulin1gene)的多聚腺苷酸化位點(diǎn)(polyadenylationsite)和信號(hào))的DNA終止來(lái)制備的。該質(zhì)粒還含有T-DNA邊界外的DNA，用作草甘Wt性選擇性標(biāo)記、土壤農(nóng)桿菌復(fù)制起點(diǎn)、大腸桿菌抑制蛋白、大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)CoEl和殺菌性抗生素選擇性標(biāo)記(用于大觀霉素(spectromycin)/f連霉素)。用于草甘膦抗'性f示記的DNA包含水稻肌動(dòng)蛋白1的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列和內(nèi)含子，可操作性連接編碼葉綠,運(yùn)肽和EPSPS基因的嵌合DNA、和具有根癌土壤農(nóng)桿菌胭脂堿合酶的聚腺苷酸化位點(diǎn)和信號(hào)的終止子元件DNA。表1顯示了在SEQIDNO:1中該質(zhì)粒關(guān)鍵元件的位置。SDH基因抑制重組DNA構(gòu)建體和LKR基因抑制重組DNA構(gòu)建體是尾部對(duì)尾部連接。這樣，在下文的表l中，SEQIDNO:1中針對(duì)LKR基因抑制重組DNA構(gòu)建體元件鑒定的DNA，包含那些元件編碼,連的反向互補(bǔ)序列中的核苷酸。質(zhì)粒pMON99142于2006年5月12日保藏于ATCC，保藏號(hào)PTA-7595。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2本實(shí)施例闡述了重組DNA構(gòu)建體的制備，其用于制備具有本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因玉米植物和種子。參考實(shí)施例l、圖2和3、SEQIDNa2(其是質(zhì)粒pMON99143上的DNA的一^l連的核苷f(shuō)r游列)，將兩個(gè)基因抑制重組DNA構(gòu)建^ffi入根癌土壤農(nóng)桿菌的左和右T-DNA邊界間制備植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。T-DNA邊界之間是(a)SDH基因抑制重組DNA構(gòu)建體，是將玉米B32胚乳特異性啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列可操作性與其中i^A"SDH抑制元件"的玉米Hsp70內(nèi)含子(即來(lái)自于玉米熱激蛋白70基因(7eam^>heatshockprotein70gene))順序i^接，該內(nèi)含子與編碼玉米DHDPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA(即來(lái)自于玉米的二氫吡啶甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因)連接，編碼玉米DHDPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA與編碼棒桿菌(Corynebacterium)DHDPS的DNA(即來(lái)自于賴氨酸不敏感的棒桿菌DHDPS基因)連接，并以小麥HSP17終止子DNA終止來(lái)制備的；和(b)LKR基因抑制重組DNA構(gòu)建體，是將玉米L3胚特異性啟動(dòng)子和前導(dǎo)序列可操作性地與"LKR抑制元件'順序連接，并以玉米GIb1終止子DNA終止^^制備的。該質(zhì)粒還含有T-DNA邊界外的DNA，用作草甘膦抗ttt擇性標(biāo)記、土壤農(nóng)桿菌復(fù)制起點(diǎn)、大腸桿菌抑制蛋白、大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)ColEl和殺菌性抗生素選擇性標(biāo)記(用于大觀霉素/鏈霉素)。表2顯示了在SEQIDNO:2中，i亥質(zhì)粒各元件的位置。SDH基因抑制重組DNA構(gòu)建體和LKR基因抑制重組DNA構(gòu)建體是尾部對(duì)尾部連接。這樣，在下文的表2中，SEQIDNO:2中針對(duì)LKR基因抑制重組DNA構(gòu)建體元件鑒定的DNA，包含那些元件編碼鏈的反向互補(bǔ)序列中的核苷酸。質(zhì)粒pMON99143于2006年5月12日保藏于ATCC，保藏號(hào)PTA-7596。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實(shí)施例3本實(shí)施例闡述實(shí)施例1的質(zhì)粒的用逡用于生產(chǎn)具有提高的游離賴氨酸7JC平的轉(zhuǎn)基因玉^ffl胞、植物和可育的轉(zhuǎn)基因玉米的種子。禾U用土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒pMON99142插入玉米愈傷組織，以產(chǎn)生玉米細(xì)胞的多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件，這些事件被選擇為草甘膦除草齊航性(基于在T-DNA邊界的一側(cè)插入草甘離十腿擇性標(biāo)記的DNA)。轉(zhuǎn)基因植物(RO)由多個(gè)轉(zhuǎn)基因事件中的每一個(gè)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)而來(lái)。用與質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增片段雜交的熒光標(biāo)記探針?lè)治鯮O轉(zhuǎn)基因玉米植物，以確定草甘膦抗性標(biāo)記DNA和基因抑制重組DNA構(gòu)建體的存在。從fW轉(zhuǎn)基因事件的多個(gè)植物中選擇以下植物，其在單一位點(diǎn)上具有草甘JW[fti^擇性標(biāo)記DNA以及在另一單一位點(diǎn)上具有T-DNA的單一拷貝，所述T-DNA包含SDH和LKR基因抑制重組DNA構(gòu)建體。單一拷貝一單一位點(diǎn)T-DNA植物與非轉(zhuǎn)基因近交(inbred)玉米品系雜交，生產(chǎn)分離的后代種子,分析所述的種子以鑒定具有基因抑制重組體DNA并且沒有草甘膦抗腿擇性標(biāo)記DNA的種子。用胚孚L切片的DNA進(jìn)行種子分析。被鑒定的種子長(zhǎng)成植物，與幾個(gè)近交玉米品系雜交幾代，以將包含SDH和LKR基因抑制重組DNA構(gòu)建體的T-DNA滲入到所皿^5米品系中，以生產(chǎn)在胚乳和胚中均具有抑制賴氨酸分解代謝蛋白LKR/SDH的DNA的近交玉米品系。分析該近CT米品系的轉(zhuǎn)基因玉米植物的種子中游離賴氨f給量，所述的玉米自交品系在胚乳和胚中均具有抑制賴氨酸分解代謝蛋白LKR/SDH的DNA，并且確定賴氨酸含量大于1300ppm。具有選中的轉(zhuǎn)基因事件細(xì)胞的近交玉米品系植物的種子被鑒定為含有大于1500ppm的游離賴氨酸、大于2000ppm的游離賴氨酸、大于3000ppm的游離賴氨酸和大于4000ppm的游離賴氨酸。實(shí)施例4本實(shí)施例闡述實(shí)施例2的質(zhì)粒的用逡用于生產(chǎn)游離賴氮酸7jC平提高的轉(zhuǎn)基因玉米細(xì)胞、植物和可育的轉(zhuǎn)基因玉米的種子。使用質(zhì)粒pMON99143基本上重復(fù)實(shí)施例3的轉(zhuǎn)化、分析、選擇和滲入(in加gressing)，以提供在胚乳和胚中均含有抑制賴氨酸^l軍代謝蛋白LKR/SDH的DNA并表達(dá)棒桿菌DHDPS酶的近交玉米品系。具有選中的轉(zhuǎn)基因事件細(xì)胞的近交玉米品系植物的種子，被鑒定為含有大于1500ppm的游離賴氨酸、大于2000ppm的游離賴氨酸、大于3000ppm的游離賴氨酸和大于4000ppm的游離賴氨酸。權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)基因玉米種子，具有至少1300ppm的游離賴氨酸和重組DNA，該重組DNA包含與抑制內(nèi)源LKR-SDH蛋白產(chǎn)生的DNA可操作性連接的胚特異性啟動(dòng)子和與抑制內(nèi)源LKR-SDH蛋白產(chǎn)生的DNA可操作性連接的胚乳特異性啟動(dòng)子，其中所述重組DNA包含pMON99142或pMON99143的T-DNA邊界間的DNA。2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因玉米種子，進(jìn)一步包含編碼在賴氨酸生物合成中有活性的蛋白的DNA，該DNA與所述的胚乳特異性啟動(dòng)子可操作性連接。3.如權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米種子，其中所述的重組DNA包含pMON99143的T-DNA邊界間的DNA。4.一種重組DNA構(gòu)建體，其對(duì)于提供具有至少1300ppm的游離賴氨酸的轉(zhuǎn)基因玉米種子是有效的，其中所述的重組DNA構(gòu)建體包含與抑制內(nèi)源LKR-SDH蛋白產(chǎn)生的DNA可操作性連接的胚特異性啟動(dòng)子和與抑制內(nèi)源LKR-SDH蛋白產(chǎn)生的DNA可操作性連接的胚乳特異性啟動(dòng)子，并且其中所述的重組DNA包含pMON99142或pMON99143的T-DNA邊界之間的DNA。5.如權(quán)利要求4所述的重組DNA構(gòu)建體，進(jìn)一步包含編碼S^氨酸生物合成中有活性的蛋白的DNA，該DNA與所述的胚乳特異性啟動(dòng)子可操作性連接。6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因玉米種子，其中所述的重組DNA包含pMON99143的T-DNA邊界間的DNA。7.—種生產(chǎn)游離賴氨酸高于1300ppm的玉^T子粒的方法，包括繁殖玉米植物，該玉米植物是用權(quán)利要求4所述的重組DNA構(gòu)建條化的玉米植物細(xì)胞的后代。全文摘要含有高水平游離賴氨酸的轉(zhuǎn)基因玉米種子，由重組DNA構(gòu)建體所致，該構(gòu)建體具有與抑制內(nèi)源賴氨酸分解代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的基因抑制元件可操作性連接的胚乳特異性啟動(dòng)子和胚特異性啟動(dòng)子。文檔編號(hào)A01H5/10GK101389212SQ200680047649公開日2009年3月18日申請(qǐng)日期2006年10月23日優(yōu)先權(quán)日2005年12月19日發(fā)明者S·黃,T·M·馬爾瓦,W·E·布朗申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司