專利名稱：一種抗果蔬病原菌活性肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及復(fù)合酶分段定向酶解牡蠣制取抗果蔬病原菌活性肽的方法。本發(fā)明產(chǎn)品以海洋生物為原料進(jìn)行酶解制備，安全、無毒、抗菌性強(qiáng)，可用于果蔬采后病害的生物防治。
背景技術(shù)：
新鮮果蔬采收以后，病害引起的腐爛損失是導(dǎo)致果蔬品質(zhì)下降的最主要因素。據(jù)果蔬產(chǎn)業(yè)資料統(tǒng)計(jì)，由于我國保鮮產(chǎn)業(yè)落后，每年約有8000萬噸的果蔬腐爛，總價(jià)值近750億元，采后損失非常嚴(yán)重。為減輕果蔬腐爛，目前多采用冷藏結(jié)合化學(xué)殺菌劑處理，但化學(xué)殺菌劑的大量使用，導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生耐藥性，并引發(fā)環(huán)境污染、食品安全、致畸致癌等多種問題，且部分化學(xué)殺菌劑在一些國家已被禁用，因此尋求安全無毒的生物防治技術(shù)顯得十分必要。
抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)是生物體內(nèi)存在的自然抗病物質(zhì)，是宿主免疫防御系統(tǒng)的組成部分。AMPs的廣譜抗菌性、不易導(dǎo)致微生物耐藥性及對(duì)生物體本身無毒等特性正日益引起生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。AMPs串珠鐮刀菌(Fusarium Moniliforme)、青霉菌(Penicillium sp.)、木霉菌(Trichoderma sp.)、灰霉葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、疫霉菌(Phytophthora infestans)等多種植物真菌均具有抗性。對(duì)果蔬采后病原菌青霉菌(Penicillium digitatum、Penicilliumitalicum)、葡萄孢霉菌(Botryis cinerea)等也顯著的抑制作用。雖然AMPs具有廣譜抗菌性，但其來源不足限制了對(duì)其抗菌特性的進(jìn)一步研究。海洋生物資源豐富，不但蘊(yùn)含著豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且蘊(yùn)含著豐富的活性物質(zhì)。近年來，隨著海洋生物技術(shù)的發(fā)展，已有不少關(guān)于從海洋生物中提取抗菌肽的報(bào)道。牡蠣是世界上的第一大養(yǎng)殖貝類，也是我國四大養(yǎng)殖貝類之一，資源較為豐富。因此，以牡蠣為原料酶解制備抗菌肽，不但為果蔬采后病害防治提供新的途徑，還可提高養(yǎng)殖貝類的附加值，促其可持續(xù)發(fā)展。
目前，尚未見到酶解海洋貝類制備抗果蔬病原菌活性肽的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的本發(fā)明提供一種安全無毒、抗菌性強(qiáng)、可防治果蔬采后青霉病和灰霉病的海洋生物抗菌肽。
本發(fā)明的技術(shù)方案(1)酶解液的制備。本發(fā)明以新鮮牡蠣肉為原料，去殼取肉勻漿，用Tris-HCl緩沖液調(diào)pH值至8.5，加入600 UAlcalase 2.4L/g肉，底物與提取液比為1∶3，50℃條件下水解3h，后調(diào)節(jié)pH值至5.5，加入700U菠蘿蛋白酶/g肉，相同條件下繼續(xù)水解3h。然后在100℃滅酶10min，酶解液在9000r/min條件下離心15min，收集上清液即為酶解粗提液。(2)酶解液中抗菌肽的分離純化。采用分子量為5K，10K的超濾膜對(duì)酶解粗提液進(jìn)行超濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，收集活性成分，冷凍干燥即為本發(fā)明產(chǎn)品。經(jīng)抗菌和抗病試驗(yàn)表明，此產(chǎn)品對(duì)果蔬采后病原菌青霉菌、灰霉菌具有顯著的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為140μg·mL-1和120μg·mL-1。常溫條件下，油桃青霉病和草莓灰霉病發(fā)病率分別比對(duì)照低21％和32％。
有益效果因?yàn)楸景l(fā)明是以食用牡蠣為原料經(jīng)酶法水解制備而成，安全，無毒，抗菌性強(qiáng)，可替代化學(xué)殺菌劑用于果蔬的病害防治，避免了化學(xué)殺菌劑引發(fā)的環(huán)境污染、食品安全、致畸致癌等多種問題，而且提高了牡蠣的附加值，促進(jìn)了養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展。
具體實(shí)施例方式新鮮牡蠣→去殼取肉→勻漿→緩沖液調(diào)pH至8.5→加入Alcalase 2.4L，50℃水解3h→調(diào)節(jié)pH至5.5→加入菠蘿蛋白酶，50℃水解3h→滅酶(100℃，5min)→離心(4000r/min，15min)→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮→超濾(膜孔經(jīng)5K，10K)→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮→冷凍干燥→產(chǎn)品。
本產(chǎn)品為白色至淡黃色粉末狀物質(zhì)，使用時(shí)可配制成一定濃度的抗菌肽溶液對(duì)新鮮水果或蔬菜進(jìn)行噴施或浸泡處理，自然風(fēng)干后冷庫貯藏。
權(quán)利要求
1.一種抗果蔬病原菌活性肽的制備方法。以新鮮牡蠣肉為原料，去殼取肉勻漿，用Alcalase2.4L和菠蘿蛋白酶分段酶解，離心，收集上清液濃縮。后采用分子量為5K和10K的超濾膜進(jìn)行超濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥后即為抗菌肽產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于酶解原料為海洋貝類。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于酶解過程中先加Alcalase 2.4L，再加菠蘿蛋白酶進(jìn)行分段酶解。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于Alcalase 2.4L的酶解條件為pH值8.5，加酶量600UAlcalase 2.4L/g肉，底物與提取液比為1∶3，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間3h；菠蘿蛋白酶的酶解條件為pH值5.5，加酶量700U菠蘿蛋白酶/g肉，底物與提取液比為1∶3，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間3h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于制備過程中以抗果蔬病原菌青霉菌和灰霉菌為靶標(biāo)，實(shí)施定向酶解和純化。
全文摘要
一種抗果蔬病原菌活性肽的制備方法，其產(chǎn)品具有抗果蔬病原菌特性，可替代化學(xué)殺菌劑用于果蔬采后病害的生物防治。其特征是以青霉菌和灰霉菌為靶標(biāo)，采用Alcalase 2.4L和菠蘿蛋白酶定向酶解牡蠣，經(jīng)分離純化制備而成。該抗菌肽對(duì)果蔬病原菌青霉菌和灰霉菌具有顯著的體外抗菌作用，對(duì)油桃青霉病和草莓灰霉病具有顯著的抑制作用。采用本發(fā)明制備的天然抗菌劑，成本低，安全性高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01P3/00GK101020916SQ200610136478
公開日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2006年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月23日
發(fā)明者劉尊英, 曾名湧, 董士遠(yuǎn), 徐杰, 宋宏霞 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)