專利名稱：獲自水稻的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種獲自水稻的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子及其使用方法。
背景技術(shù)：
植物體本身具有耐受機(jī)制以應(yīng)付自然界中不同類型的環(huán)境脅迫例如，脫水，高溫，冷凍或者鹽脅迫。近年來，因?yàn)槊{迫耐受機(jī)制得以在分子水平描述，因此可以利用生物技術(shù)的方法生產(chǎn)脅迫耐受植物。例如，研究表明當(dāng)細(xì)胞暴露于脅迫條件下，細(xì)胞中會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生脅迫蛋白例如LEA蛋白，水通道蛋白，或能夠溶解于溶質(zhì)中的合成酶，從而保護(hù)細(xì)胞免于脅迫的影響。因此，有人曾嘗試過基因例如大麥LEA蛋白的或煙草解毒酶的基因，或者是用于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(例如，糖，脯氨酸，或甜菜堿)的合成酶的基因被導(dǎo)入到宿主植物的研究。也有人嘗試過利用編碼擬南芥(Arabidopsis thalina)w-3脂肪酸脫氫酶的基因，藍(lán)-綠藻D9-脫氫酶的基因，或類似的細(xì)胞膜脂類修飾酶的基因的研究。在上述研究中，一個(gè)基因被與花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子連接并導(dǎo)入植物體中。然而，重組植物體的脅迫耐受水平不穩(wěn)定，并且導(dǎo)入的基因的表達(dá)水平也很低。因此這些研究均未應(yīng)用到實(shí)際應(yīng)用中。
此外，研究發(fā)現(xiàn)，脅迫耐受機(jī)制與很多基因錯(cuò)綜復(fù)雜地相關(guān)(Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K.“在水脅迫反應(yīng)中的基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)”，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)1997年10月；115(2)p327-334)。相應(yīng)地，有人嘗試研究了編碼轉(zhuǎn)錄因子并且同時(shí)激活基因表達(dá)的基因被連接到一個(gè)組成型啟動(dòng)子上并被導(dǎo)入到植物體中，從而增強(qiáng)植物體的脅迫耐受能力(Liu等，(1998)植物細(xì)胞(The Plant Cell)，101391-1406)。然而，當(dāng)幾個(gè)基因被同時(shí)激活，宿主植物體的能量被導(dǎo)向基因產(chǎn)物的合成或者由基因產(chǎn)物產(chǎn)生的胞內(nèi)代謝。相應(yīng)地，植物體本身的生長(zhǎng)被延緩或者生長(zhǎng)矮小。
相反，本發(fā)明人從擬南芥分離出編碼與脅迫反應(yīng)元件結(jié)合并且特異性激活該元件下游基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的基因DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB2A，和DREB2B(JP專利公開(未審查申請(qǐng))No.2000-60558)。他們報(bào)道在一個(gè)植物體中導(dǎo)入與一個(gè)脅迫誘導(dǎo)的rd-29A啟動(dòng)子連接的基因能夠產(chǎn)生不影響植物生長(zhǎng)的脅迫耐受植物(JP專利公開(未審查申請(qǐng))No.2000-116260)。
rd-29A啟動(dòng)子獲自雙子葉植物擬南芥。其也能夠在單子葉植物中起作用，但是活性水平較低。相應(yīng)地，在單子葉植物中具有高水平活性的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子已經(jīng)成為很多研究的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是發(fā)現(xiàn)一種在單子葉植物例如水稻中能有效發(fā)揮作用的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子并且提供一種利用該啟動(dòng)子的新的環(huán)境脅迫耐受植物。
本發(fā)明者進(jìn)行了集中的研究以求達(dá)到上述目的。結(jié)果，他們從水稻基因組中成功分離了一種強(qiáng)型脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子。他們還發(fā)現(xiàn)單子葉植物的環(huán)境脅迫耐受能力通過使用該啟動(dòng)子被顯著提高。從而完成了本發(fā)明。
優(yōu)選地，本發(fā)明涉及一種來源于水稻的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子。更具體地，該啟動(dòng)子由如下(a)或(b)的DNA組成(a)具有顯示于SEQ ID NO1或者2的核苷酸序列的DNA；或(b)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與具有互補(bǔ)于具有顯示于SEQ ID NO1或者2的核苷酸序列的核苷酸序列的DNA雜交并且表達(dá)脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性的DNA。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“脅迫”是指脫水脅迫，低溫脅迫，或鹽脅迫。
本發(fā)明提供了一種包含該啟動(dòng)子的重組載體。在本發(fā)明涉及的啟動(dòng)子的控制下，該載體可以含有其他的結(jié)構(gòu)基因或者調(diào)節(jié)基因。特別優(yōu)選的情況是，該載體包含用于增強(qiáng)脅迫耐受的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因。
用于增強(qiáng)脅迫耐受的優(yōu)選的結(jié)構(gòu)基因的實(shí)例包括，P5CS基因，其是脯氨酸合成的一種關(guān)鍵酶(Yoshiba Y.等(1999)BBRC261)和肌醇半乳糖苷合成的AtGo1S3基因(Taji T.等(2002)植物學(xué)雜志(PlantJ)，29417-426)。
用于增強(qiáng)脅迫耐受的優(yōu)選的調(diào)節(jié)基因的例子包括，Arabidopsisthalina來源的DREB轉(zhuǎn)錄因子基因(JP專利公開(未審查的申請(qǐng))No.2000-60558)，水稻來源的OsDREB轉(zhuǎn)錄因子基因(JP專利申請(qǐng)No.2001-358268，Dubouzet等，植物學(xué)雜志(Plant J)，出版中)，以及NCED基因，其是植物激素ABA生物合成的一種關(guān)鍵酶(Iuchi S.等(2001)植物學(xué)雜志(Plant J).27325-333)。
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化子，其通過將本發(fā)明的載體導(dǎo)入到適宜的宿主中而獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化子是一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物體，其通過將本發(fā)明的載體導(dǎo)入到一個(gè)宿主植物體中而獲得。在這種情況下，該宿主植物優(yōu)選的是單子葉植物，該單子葉植物優(yōu)選的為水稻。
通過將本發(fā)明的啟動(dòng)子導(dǎo)入到植物體中，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種方法用于加強(qiáng)植物體的脅迫耐受。本發(fā)明的啟動(dòng)子表現(xiàn)了一種潛在的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性，該活性從未在單子葉植物中被觀察到，因此本發(fā)明的啟動(dòng)子更加適于加強(qiáng)單子葉植物的脅迫耐受。
下面具體描述本發(fā)明。
附圖的簡(jiǎn)要說明


圖1表示各種脅迫被實(shí)施時(shí)a0528(OsNAC6)和a2660(SalT)Northern分析的結(jié)果。
圖2表示a2660(SalT)其啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列。
圖3表示a0528(OsNAC6)其啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列。
圖4表示Gus表達(dá)構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)，其中Tg7代表g7終止子，HPT代表潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，Pnos代表Nos啟動(dòng)子，Tnos代表Nos終止子。
圖5是一個(gè)表示當(dāng)脫水脅迫實(shí)施時(shí)，通過導(dǎo)入不同的啟動(dòng)子連接到GUS基因制備的轉(zhuǎn)基因煙草或水稻的GUS活性的圖。
圖6是一個(gè)顯示當(dāng)鹽脅迫實(shí)施時(shí)，通過導(dǎo)入SalT啟動(dòng)子連接到GUS基因制備的轉(zhuǎn)基因水稻的GUS染色結(jié)果的圖。
圖7是一個(gè)表示當(dāng)脫水脅迫實(shí)施時(shí)，通過導(dǎo)入OsNAC6啟動(dòng)子連接到GUS基因制備的轉(zhuǎn)基因煙草和水稻的GUS活性的圖。
圖8表示每種脅迫實(shí)施時(shí)，GUS基因連接到OsNAC6啟動(dòng)子而制備的轉(zhuǎn)基因水稻中用于觀察GUS表達(dá)的組織染色結(jié)果。
發(fā)明的具體實(shí)施方案本發(fā)明的啟動(dòng)子是一種分離的水稻來源的啟動(dòng)子，其特異性地由例如，低溫，脫水，鹽脅迫等環(huán)境脅迫誘導(dǎo)。
1.本發(fā)明啟動(dòng)子的鑒定本發(fā)明的啟動(dòng)子可以通過如下方法進(jìn)行鑒定。比較那些被實(shí)行脅迫和那些沒有被實(shí)行脅迫的植物體，以顯著差異水平表達(dá)的基因(脅迫誘導(dǎo)的基因)被首先篩選出來。隨后，基于基因組的信息，被認(rèn)定為基因啟動(dòng)子的序列被篩選出來。
本發(fā)明啟動(dòng)子的鑒定過程在后面描述。
1.1mRNA的制備首先制備用于篩選脅迫誘導(dǎo)的基因的mRNA。
作為mRNA的來源，植物體的局部例如，葉子，莖，根，花朵，乃至植物體作為整體都可以使用。可選擇地，由播種到例如GM培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基，或#3培養(yǎng)基這樣的固體培養(yǎng)基上并無(wú)菌生長(zhǎng)而獲得的植物體可以被使用。來源可以是胼胝體或者是無(wú)菌生長(zhǎng)的植物體的組培細(xì)胞。
在這個(gè)篩選過程當(dāng)中，觀察那些給予脅迫的植物體和那些沒有給予脅迫的植物體之間基因表達(dá)水平的差異。因此，有必要為每種植物體制備mRNA。實(shí)施脅迫的適宜方法是由所利用的植物體的類型來決定的。通常，脫水脅迫能夠通過2-4星期不給植物體澆水來實(shí)施。低溫和冷凍脅迫能通過在15至-10℃培養(yǎng)植物體1-10天來實(shí)施。鹽脅迫能通過在100到600mMNaCl中培養(yǎng)植物體一小時(shí)到7天來實(shí)施。例如，水稻的實(shí)施例中，水培的水稻被暴露于低溫脅迫(10至-4℃)，鹽脅迫(150到250mMNaCl中)，和脫水脅迫(干燥的狀態(tài))。
被施于脅迫和沒有被施于脅迫的植物體用液氮凍融，并在研臼中研磨，等等。從研磨后的材料中，采用乙二醛的方法，硫氰酸胍和氯化銫的方法，氯化鋰和尿素的方法，蛋白酶K和脫氧核糖核酸酶的方法，或者類似的方法，提取粗RNA組分。從粗RNA組分中，可以通過采用寡dT-纖維素，瓊脂糖2B攜帶多U-瓊脂糖親和柱的方法，或者類似方法或者分批的方法，能獲得poly(A)+RNA(mRNA)。如果需要，獲得的mRNA可以通過蔗糖密度梯度離心或者類似的方法進(jìn)一步分級(jí)分離。
1.2脅迫誘導(dǎo)基因的篩選脅迫誘導(dǎo)基因的篩選基于那些被實(shí)行脅迫和那些沒有被實(shí)行脅迫的植物體基因表達(dá)水平差異的比較?；虮磉_(dá)水平的比較方法沒有特別的限定，而且，可使用的方法的具體例子包括傳統(tǒng)方法，例如RT-PCR，實(shí)時(shí)(real-time)-PCR，消減，差異顯示，示差雜交，以及交叉雜交。
利用例如基因芯片以及cDNA微陣的固相樣品的方法特別適用于實(shí)施篩選過程，因?yàn)樵摲椒軌蛲瑫r(shí)定性并定量檢測(cè)出幾千到幾萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)。
(1)cDNA微陣的制備在篩選程序中使用的cDNA微陣沒有特殊的限制，只要是單子葉植物(比如水稻)的cDNA，即，啟動(dòng)子的檢測(cè)靶點(diǎn)點(diǎn)在其上?？梢杂矛F(xiàn)成的微陣列，或者可以采用常規(guī)方法制備點(diǎn)陣(比如，參見“植物細(xì)胞”(The Plant Cell)(2001)1361-72，Seki等)。
制備cDNA微陣列時(shí)，首先應(yīng)該制備目的植物體的cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)可以通過常規(guī)方法構(gòu)建，采用方法(1)制備的mRNA作為模板。被點(diǎn)加的cDNA沒有特殊限制，只要其來源于單子葉植物。從后面基因組數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)化的觀點(diǎn)考慮，來源于像水稻這樣具有高級(jí)基因組分析的單子葉植物的那些是優(yōu)選的。植物體可以是在正常狀態(tài)下(沒有處理)。然而，植物體優(yōu)選被暴露于像脫水，鹽，或低溫這樣的脅迫下。
建立cDNA文庫(kù)時(shí)，首先利用一個(gè)商售的試劑盒(比如，ZAP-cDNA合成試劑盒Stratagene)進(jìn)行mRNA的反轉(zhuǎn)錄和單鏈cDNA的合成。然后利用合成的單鏈cDNA作為模板合成雙鏈cDNA。隨后，一個(gè)含有合適限制位點(diǎn)的連接物被插入到合成的雙鏈cDNA中，然后將該雙鏈cDNA插入到λ噬菌體載體的克隆位點(diǎn)。合成的DNA利用商售試劑盒(例如，GigapackIII金屬包裝提取物(Stratagene))在體外進(jìn)行包裝，然后感染E.coli宿主，再進(jìn)行擴(kuò)增。因此獲得目的cDNA文庫(kù)。
一旦制備了cDNA文庫(kù)，就用PCR擴(kuò)增該cDNA或者其具有高度特異性的區(qū)域(比如，在3’端沒有重復(fù)序列的UTR區(qū))來產(chǎn)生固定在微陣列上的探針。當(dāng)通過重復(fù)該過程獲得所有目的基因的探針時(shí)，利用商售分配器(例如，由Amersham制造的)將這些探針分配到光滑的玻璃板上。這樣就獲得了目的cDNA微陣列。
(2)基因表達(dá)水平的檢測(cè)當(dāng)標(biāo)記有適宜反應(yīng)物的樣品mRNA(或cDNA)在微陣列上與cDNA探針雜交時(shí)，可以通過cDNA微陣獲得的信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)基因表達(dá)的水平。一般情況下，基因表達(dá)的水平優(yōu)選確定為與適宜對(duì)照比較的一個(gè)相對(duì)值，或者是考慮到微陣上分配的cDNA探針量的差異，被檢測(cè)的兩個(gè)樣品之間的表達(dá)水平的比率。在本發(fā)明篩選過程的實(shí)施例中，來自未被實(shí)施脅迫(沒有處理)的植物體的mRNA作為對(duì)照，相應(yīng)地，獲自實(shí)施脅迫的植物體的mRNA的表達(dá)水平通過比率值來反映。
檢測(cè)按如下進(jìn)行。對(duì)照和樣品的mRNAs(或者其cDNA)分別用不同的熒光染料(例如Cy3和Cy5)進(jìn)行標(biāo)記，并且與點(diǎn)陣上的cDNA探針雜交。譬如，從實(shí)施脅迫的植物體中提取mRNA并在Cy5標(biāo)記的dCTP存在的條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄來制備Cy5標(biāo)記的cDNA。隨后，從未實(shí)施脅迫(未被處理)的植物體中提取mRNA，并用同樣的方法制備Cy3標(biāo)記的cDNA。將等比例的Cy5標(biāo)記的cDNA樣品和Cy3標(biāo)記的cDNA(對(duì)照)彼此混合，然后與點(diǎn)陣上的cDNA雜交。作為標(biāo)記染色劑，Cy3可以用于樣品，Cy5可以用于對(duì)照物?？蛇x擇地，其他的適宜標(biāo)記染色劑也可以被應(yīng)用。
利用熒光信號(hào)檢測(cè)儀讀取獲得的熒光強(qiáng)度并隨后被轉(zhuǎn)化為數(shù)值。該數(shù)值等同于樣品的基因表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照的比率。任選地，將掃描儀讀取的熒光強(qiáng)度對(duì)于每個(gè)樣品進(jìn)行錯(cuò)誤校正或者方差的標(biāo)準(zhǔn)化?；谠诿糠N樣品中都普遍表達(dá)的基因例如管家基因，可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化過程。此外，用于評(píng)價(jià)可靠性的闕值曲線可以被確定從而去除低相關(guān)性的數(shù)據(jù)。
(3)脅迫誘導(dǎo)基因的篩選基于點(diǎn)陣的分析結(jié)果，脅迫誘導(dǎo)基因被指定為被施以脅迫和未施以脅迫的植物體中以顯著差異水平表達(dá)的基因。此處所用的術(shù)語(yǔ)“顯著差異”是指，例如，在1000或者更高的強(qiáng)度水平基礎(chǔ)上，兩種植物體之間的差異在3倍或3倍以上。
(4)通過Northern印跡法分析表達(dá)如上被選擇的基因被進(jìn)一步進(jìn)行Northern分析和類似的分析。因此，基因的表達(dá)水平的增強(qiáng)被證實(shí)與脅迫耐受水平的增強(qiáng)相關(guān)。例如，植物體被暴露于如上所描述的方式進(jìn)行的例如鹽，脫水，溫度的不同水平的脅迫下。從植物體中提取RNA并通過電泳進(jìn)行分離。分離的RNA被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后與特異于該基因的標(biāo)記cDNA探針雜交。這樣，表達(dá)水平可以被檢測(cè)。
如果被選擇的基因的表達(dá)水平以脅迫依賴的方式加強(qiáng)，可以確定該基因是脅迫誘導(dǎo)的。從水稻cDNA文庫(kù)篩選的脅迫誘導(dǎo)基因的例子包括a2660(SalTSEQ ID NO3)和a0528(OsNAC6SEQ ID NO4)。a2660和a0528是固定在微陣列上的cDNA的標(biāo)示號(hào)(ID No.)。
1.3啟動(dòng)子序列的篩選(1)從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選隨后，利用檢測(cè)軟件(例如Blast)，在已經(jīng)存在的基因數(shù)據(jù)庫(kù)(例如，DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù))中尋找脅迫誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子序列。對(duì)于像水稻這樣的植物體，其基因組大多數(shù)已被解碼，所有的控制特異性脅迫誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子序列，可以利用已存在的數(shù)據(jù)庫(kù)尋找。從高度同源于脅迫誘導(dǎo)基因(cDNA)的基因組基因的上游區(qū)域中被認(rèn)作啟動(dòng)子的區(qū)域選擇作為啟動(dòng)子序列。例如，基于脅迫誘導(dǎo)基因的基因組信息，被假定為這些基因的一個(gè)起始密碼子位點(diǎn)的上游大約1到2kb區(qū)域被推測(cè)是一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域。
一些傳統(tǒng)脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子在它們的序列中含有cis元件參與啟動(dòng)子的活性，例如，脫水反應(yīng)元件(DRE)，脫落酸反應(yīng)元件(ABRE)，以及低溫脅迫反應(yīng)元件。當(dāng)一個(gè)脅迫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子與cis元件結(jié)合時(shí)，前面提到的啟動(dòng)子被激活，在啟動(dòng)子控制下的脅迫耐受傳授基因被允許表達(dá)。相應(yīng)地，如果尋找到包含在上游區(qū)域的cis元件，該區(qū)域很有可能是脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
因此，一個(gè)推測(cè)的SalT啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO1)從高度相似于上述提到的a2660(SalTSEQ ID NO3)的基因的上游1.6kb區(qū)域中找到，一個(gè)推測(cè)的OsNAC6啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO2)從高度相似于a0528(OsNAC6SEQ ID NO4)的基因的上游1.5kb區(qū)域中找到。
(2)脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子的功能確定隨后，推測(cè)的啟動(dòng)子序列的功能通過脅迫實(shí)施時(shí)啟動(dòng)子活性的變化被確定。
最初，基于上述部分推測(cè)的啟動(dòng)子的序列制備引物。利用基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR，啟動(dòng)子被克隆。隨后，一個(gè)報(bào)告基因被連接到啟動(dòng)子下游產(chǎn)生一個(gè)報(bào)告質(zhì)粒。產(chǎn)生的報(bào)告質(zhì)粒隨后被導(dǎo)入到一個(gè)植物體中，然后檢測(cè)對(duì)植物體(優(yōu)選的是其T2代)實(shí)施脅迫時(shí)報(bào)告基因的表達(dá)。報(bào)告基因的例子包括β葡糖醛酸酶(例如，GUSpBY121，Clontech，)，熒光素酶基因，以及綠熒光蛋白基因。GUS是優(yōu)選的，因?yàn)槠浠钚钥梢酝ㄟ^數(shù)值來顯示并且其表達(dá)可以通過染色肉眼觀察。
1.4本發(fā)明的啟動(dòng)子基于上述，水稻基因組來源的SalT啟動(dòng)子(SEQ ID NO1)和OsNAC6啟動(dòng)子(SEQ ID NO2)被發(fā)現(xiàn)是脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，他們以脫水，低溫，或鹽脅迫依賴的方式進(jìn)行高度表達(dá)。
因此，SalT啟動(dòng)子和OsNAC6啟動(dòng)子被所有脅迫特異性誘導(dǎo)。OsNAC6啟動(dòng)子包含cis序列，ABA反應(yīng)元件(ABRE)；然而，SalT啟動(dòng)子的序列不包含特異性cis序列。
OsNAC6啟動(dòng)子被脫水脅迫迅速誘導(dǎo)，SalT啟動(dòng)子被低溫脅迫迅速誘導(dǎo)。
本發(fā)明的啟動(dòng)子并不局限于具有SEQ ID NO1或2所顯示的核苷酸序列的DNA。本發(fā)明的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與具有互補(bǔ)于具有SEQ ID NO1或2所顯示的核苷酸序列的DNA的核苷酸序列的DNA雜交的DNA，只要該DNA具有脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性。此處所用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的參數(shù)。嚴(yán)謹(jǐn)條件是序列依賴性的并且在不同條件下不同。更長(zhǎng)序列特異性地在更高溫度下雜交。一般情況下，對(duì)于特異序列在確定的離子強(qiáng)度和pH下選擇比熱溶解點(diǎn)(Tm)低大約5℃的嚴(yán)謹(jǐn)條件。Tm是指，在平衡條件下，50％互補(bǔ)于目的序列的探針與目的序列雜交時(shí)的溫度(在限制性的離子強(qiáng)度，pH值和核酸濃度條件下)。核酸的雜交參數(shù)可以在編纂如下方法的參考書中找到，例如，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，J.Sambrook，等，編著.，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，N.Y.，1989。更特殊地，此處所用的嚴(yán)謹(jǐn)條件一詞是指，例如，甲酰胺的濃度為30-50％，溫度為37-50℃，以及6×SSC的條件。優(yōu)選地，甲酰胺的濃度為50％，溫度為42℃，以及6×SSC。
2.重組載體本發(fā)明的重組載體包括本發(fā)明的啟動(dòng)子。該載體可能包括其他的功能性結(jié)構(gòu)基因或者本發(fā)明的啟動(dòng)子下游的調(diào)節(jié)基因。優(yōu)選的基因?qū)嵗ㄓ糜诩訌?qiáng)脅迫耐受的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因?！肮δ苄浴币辉~是指在本發(fā)明啟動(dòng)子的控制下，其他的結(jié)構(gòu)基因或者調(diào)節(jié)基因適宜表達(dá)的一種狀態(tài)。
加強(qiáng)脅迫耐受的結(jié)構(gòu)基因編碼一種蛋白，該蛋白在加強(qiáng)植物體對(duì)于像脫水，低溫，或鹽脅迫的環(huán)境脅迫耐受中發(fā)揮作用。這些蛋白的例子包括LEA蛋白，水通道蛋白，溶解于溶質(zhì)中的合成酶；煙草的解毒酶；用于滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(例如，糖，脯氨酸，或甜菜堿)的合成酶；編碼Arabidopsis thalina w-3脂肪酸脫氫酶和藍(lán)-綠藻D9-脫氫酶的基因，它們是細(xì)胞膜脂類修飾酶；P5CS是脯氨酸合成的一個(gè)關(guān)鍵酶；而且AtGo1S3基因用于肌醇半乳糖苷的合成。
加強(qiáng)脅迫耐受的一個(gè)調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性和用于產(chǎn)生脅迫耐受的基因的表達(dá)，從而加強(qiáng)植物體中的脅迫耐受。這樣的例子包括Arabidopsis thalina來源的例如DREB1A，DREB2A，DREB1B，和DREB1C基因轉(zhuǎn)錄因子(參見JP專利公開(未審查的申請(qǐng))No.2000-60558)；水稻來源的例如OsDREB1A，OsDREB1B，OsDREB1C，OsDREB1D，和OsDREB2A基因轉(zhuǎn)錄因子(參見JP專利公開No.2001-358268)；以及NCED基因，其是植物激素ABA生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶。
當(dāng)本發(fā)明的啟動(dòng)子含有一個(gè)特異性的cis元件時(shí)，結(jié)合于cis元件并加強(qiáng)其啟動(dòng)子活性的轉(zhuǎn)錄因子的基因特別優(yōu)選地被連接于啟動(dòng)子的下游。
本發(fā)明的載體的構(gòu)建是功能性的，其通過連接(插入)本發(fā)明的啟動(dòng)子或者啟動(dòng)子和其它的調(diào)節(jié)基因或結(jié)構(gòu)基因到適宜的載體上。被插入啟動(dòng)子的載體沒有特殊限制，只要其能夠在宿主中復(fù)制。例如，質(zhì)粒DNA，噬菌體DNA或類似可被使用的。質(zhì)粒DNA包括用于大腸桿菌(E.coli)宿主的質(zhì)粒，例如，pBR322，pBR325，pUC118，和pUC119；用于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)宿主的質(zhì)粒，例如pUB110和pTP5；用于酵母宿主的質(zhì)粒，例如，YEp13，YEp24，和YCp50；和用于植物細(xì)胞宿主的質(zhì)粒，例如，pBI221和pBI121。噬菌體DNA包括λ噬菌體和類似的噬菌體。此外，也可以使用動(dòng)物病毒載體例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒或牛痘病毒，或者，昆蟲病毒載體例如桿狀病毒。
本發(fā)明的啟動(dòng)子通過用合適的限制酶切割純化的DNA然后插入到用于連接的合適載體的限制性位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)。
如果需要，本發(fā)明的重組載體可以含有一個(gè)剪接信號(hào)，poly(A)添加信號(hào)，選擇標(biāo)記，核糖體結(jié)合序列(SD序列)等等。選擇性標(biāo)記的實(shí)施例為二氫葉酸還原酶基因，氨芐青霉素耐受基因，新霉素耐受基因，等等。
3.轉(zhuǎn)化子本發(fā)明的轉(zhuǎn)化子可以通過將本發(fā)明所述重組載體導(dǎo)入宿主以便啟動(dòng)子活性能夠得以表達(dá)來制備。宿主并無(wú)具體限制，只要本發(fā)明所述啟動(dòng)子在其中能夠發(fā)揮作用即可。優(yōu)選地，宿主為植物體，特別優(yōu)選水稻等單子葉植物體。
當(dāng)用植物體或植物細(xì)胞作宿主時(shí)，例如，使用從水稻、玉米、小麥、擬南芥，煙草或胡蘿卜建立的細(xì)胞或者從這些植物制備的原生質(zhì)體。將重組載體導(dǎo)入植物體的方法包括Abel等一文[Abel，H.等，PlantJ.5421-427(1994))中使用聚乙二醇的方法，以及電穿孔。
4.脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植物(1)制備轉(zhuǎn)基因植物將用于增強(qiáng)耐受脅迫的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)節(jié)基因?qū)胫参矬w，使得其置于本發(fā)明所述啟動(dòng)子的調(diào)控之下。從而，能夠制備出對(duì)環(huán)境脅迫耐受性增強(qiáng)了的功能性轉(zhuǎn)基因植物，所述環(huán)境脅迫是例如低溫、冷凍或脫水的脅迫。特別優(yōu)選的宿主植物為單子葉植物。
用于將本發(fā)明啟動(dòng)子等導(dǎo)入宿主植物體的方法包括間接導(dǎo)入如農(nóng)桿菌感染法以及直接導(dǎo)入如粒子槍法、聚乙二醇法、脂質(zhì)體法以及微注射法。到目前為止，用農(nóng)桿菌感染法從水稻這樣的單子葉植物制備轉(zhuǎn)基因植物是很難的。但是，加入acetosyringon可使農(nóng)桿菌感染水稻。從而，使得農(nóng)桿菌感染法可用于單子葉植物。
本發(fā)明下文中將描述用農(nóng)桿菌制備轉(zhuǎn)基因植物。
導(dǎo)入植物的重組載體可以通過下述方法制備而成用合適的限制性酶對(duì)包含本發(fā)明啟動(dòng)子和用于加強(qiáng)脅迫耐受的一結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)控基因的DNA進(jìn)行切割，如有必要，在切割后的DNA上連接一合適的接頭，然后將該DNA插入可用于植物細(xì)胞宿主的克隆載體中。二元載體型質(zhì)粒，如pBI2113Not，pBI2113、pBI101、pBI121、pGA482、pGAH和pBIG，或者中間載體型質(zhì)粒如pLGV23Neo、pNCAT和pMON200，可用作克隆載體。
當(dāng)使用二元載體型質(zhì)粒時(shí)，目的基因要插入到二元載體的兩鄰接序列(LB、RB)之間。得到的重組載體在大腸桿菌中擴(kuò)增。然后通過凍融、電穿孔等方法將擴(kuò)增后的重組載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌C58(Agrobacterium tumefaciens C58)、LBA4404、EHA101、C58C1RifR、EHA105等。將得到的農(nóng)桿菌用來轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明中，除上述方法外，還可以用三成員偶聯(lián)法[Nucleic AcidsResearch，128711(1984)]來制備要導(dǎo)入植物體中的農(nóng)桿菌。具體地說，將包括目的基因的含質(zhì)粒大腸桿菌、輔助性含質(zhì)粒大腸桿菌(例如，pRK2013)以及農(nóng)桿菌混合并在含利福平和卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。從而，可以得到待感染到植物體中的結(jié)合子農(nóng)桿菌。
對(duì)于在植物體內(nèi)表達(dá)外源基因等而言，應(yīng)該將植物終止子等置于結(jié)構(gòu)基因的下游?？捎糜诒景l(fā)明的終止序列的具體實(shí)例包括花椰菜花葉病毒來源的終止子以及胭脂氨酸合成酶基因來源的終止子。終止子不僅限于上述的終止子，只要已知它們?cè)谥参矬w中能夠發(fā)揮作用即可。
為了有效地篩選目的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，優(yōu)選使用可有效篩選的標(biāo)記基因?？梢杂眠x自下列基因的1個(gè)或多個(gè)基因作為篩選標(biāo)記卡那霉素耐受性(NPTII)基因、可賦予植物對(duì)抗生素潮霉素耐受性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(htp)基因、可賦予bialaphos耐受性的phosphinothricin acetyl轉(zhuǎn)移酶(bar)基因，等。本發(fā)明中的啟動(dòng)子和篩選標(biāo)記基因可以一同插入到同一載體中。替代地，可以分別引入不同的載體中。
如果用上述方法制備的農(nóng)桿菌感染植物體，那么就制得目的轉(zhuǎn)基因植物。
將該轉(zhuǎn)基因植物播種在含足量抗生素的培養(yǎng)基上，然后就可以選擇得到含目的啟動(dòng)子和基因的植株。將篩選得到的植株轉(zhuǎn)移到含Bonsol No.1、黑泥土(black dirt)或類似成分的盆中，并進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)。通常，基因都是以類似的方式導(dǎo)入宿主植物的基因組中。但是，由于導(dǎo)入的基因在基因組上排列的位置不同，會(huì)使得導(dǎo)入基因的表達(dá)情況隨之變化。這種現(xiàn)象稱之為“位置效應(yīng)”。用來自導(dǎo)入基因的DNA片段作為探針通過Northern印跡方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析，有可能篩選出那些其中導(dǎo)入基因更高表達(dá)的轉(zhuǎn)化子。
(2)脅迫耐受性的確認(rèn)已經(jīng)導(dǎo)入了本發(fā)明所述基因的轉(zhuǎn)基因植株及其后代中是否整合了本發(fā)明所述啟動(dòng)子或結(jié)構(gòu)基因和/或用于增強(qiáng)脅迫耐受性的調(diào)節(jié)基因，可以采用下述方法對(duì)其確認(rèn)從這些植株的細(xì)胞及組織提取DNA，并用本領(lǐng)域常規(guī)方法PCR或Southern分析對(duì)導(dǎo)入的基因進(jìn)行檢測(cè)。
基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平及表達(dá)器官可以通過下述方法分析從植株的細(xì)胞及組織中提取RNA，通過本領(lǐng)域常規(guī)方法RT-PCR或Northern分析檢測(cè)導(dǎo)入的基因的mRNA。替代地，導(dǎo)入基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)水平及表達(dá)位點(diǎn)可以使用抗該產(chǎn)物的抗體通過Western印跡或類似方法直接分析。
已經(jīng)導(dǎo)入了本發(fā)明所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于環(huán)境脅迫的耐受性可以通過下述方法評(píng)估將該轉(zhuǎn)基因植物栽培在一裝有土壤的盆中，所述土壤中含有蛭石、perlite、Bonsol、等或者水生植物，將該植物暴露于不同的環(huán)境脅迫下，然后檢測(cè)植物的存活情況。環(huán)境脅迫包括低溫、脫水及高鹽脅迫。例如，對(duì)脫水脅迫的耐受性可以通過讓植株無(wú)水生長(zhǎng)2～4周，然后檢測(cè)生存情況來評(píng)價(jià)。對(duì)低溫和冷凍脅迫的耐受性可以通過讓植物在15～-10℃下生長(zhǎng)1～10天，在20～35℃下生長(zhǎng)2天到3周，然后測(cè)定存活比例來評(píng)價(jià)。對(duì)鹽脅迫的耐受性可以通過，例如，讓植物在100～600mM NaCl中生長(zhǎng)1小時(shí)到7天，在20～35℃下生長(zhǎng)1～3周，然后測(cè)定存活比例來評(píng)價(jià)。
因此，使用本發(fā)明所述啟動(dòng)子能夠顯著增強(qiáng)脅迫耐受性而不阻礙植物的生長(zhǎng)(特別是單子葉植物)。
實(shí)施例參照下列實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但是，本發(fā)明的范圍絕不僅限于這些實(shí)施例。
脅迫誘導(dǎo)的水稻基因的鑒別通過cDNA微陣列及Northern分析搜索脅迫-誘導(dǎo)水稻基因。
1.水稻cDNA微陣列的制備將在水生環(huán)境下生長(zhǎng)2-3周的水稻種籽(Nihonbase)遭受脫水、鹽或低溫的脅迫。通過室溫下空氣干燥實(shí)施脫水脅迫，通過在250mMNaCl溶液中培養(yǎng)實(shí)施鹽脅迫，通過在4℃下培養(yǎng)實(shí)施低溫脅迫。把用每一種脅迫處理過的水稻用液氮冷凍。用硫氰酸胍及氯化銫法從冷凍樣品中提取總RNA，用寡聚(dt)-纖維素柱制備mRNA。用得到的mRNA作模板用HybriZAP-2.1 two-hybrid cDNA Gigapack克隆試劑盒(Stratagene)合成cDNA，將得到的cDNA插入并克隆到HybriZAP-2.1噬菌粒載體的EcoRI-XhoI切割位點(diǎn)。用Gigapack IIIGold包裝提取物(Stratagene)包裝這種噬菌粒DNA。用得到的含隨后要擴(kuò)增的cDNA的λ噬菌體顆粒感染入宿主大腸桿菌，然后回收這些噬菌體作為噬菌體懸液。
測(cè)出cDNA克隆的核苷酸序列，篩選出大約1500個(gè)單個(gè)克隆。PCR擴(kuò)增這些篩選到的克隆并用GTMASS系統(tǒng)(Nippon Laser andElectronic Laboratory)將其印在聚-L-賴氨酸-包被的顯微載玻片(型號(hào)S7444，Matsunami)上。然后，通過UV交聯(lián)將這些克隆固定制備成水稻cDNA微陣列(The Plant Cell(2001)1361-72Seki等)。
2.微陣列分析用與上述相同的方法給與水稻植株脫水、鹽或低溫脅迫或者用100μM脫落酸對(duì)其處理(5小時(shí)或10小時(shí))，分別從這些植株以及未受脅迫的水稻植株中提取mRNA。來自未經(jīng)處理水稻植株的mRNA用作對(duì)照，用來自經(jīng)每種脅迫或脫落酸處理的水稻植株的mRNA用作樣品。通過用Cy3和Cy5雙重?zé)晒鈽?biāo)記的方法進(jìn)行cDNA微陣列分析。作為微陣列分析的結(jié)果，強(qiáng)度為1000或更高的基因稱之為表達(dá)水平比對(duì)照高3倍的基因，這些基因可以選用為侯選的脅迫-誘導(dǎo)基因。
3.Northern雜交表達(dá)分析上述部分選擇的基因的特征性表達(dá)用Northern雜交分析。首先，將水稻植株暴露于脫落酸、脫水、低溫、鹽或水脅迫，然后每隔0、1、2、5和10小時(shí)從施加了脅迫的水稻完成取樣。脫落酸、脫水、低溫和鹽脅迫分別以與1中相同的方式施加，用將植株浸沒純水中的方式施加水脅迫。從每一樣本中制備總RNA，電泳，用Northern方法觀察每一基因的表達(dá)。結(jié)果見
圖1。
圖1清楚可見，a0528基因(OsNAC6SEQ ID NO3)和a2660基因(SalTSEQ ID NO4)的表達(dá)受脫落酸-、脫水-、低溫-、鹽-、或水-脅迫誘導(dǎo)的情況。具體而言，a0528的表達(dá)被脫水脅迫快速誘導(dǎo)，a2660基因的表達(dá)被低溫脅迫快速誘導(dǎo)。
啟動(dòng)子序列的篩選1.水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選用blast，從DDBJ水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索實(shí)施例1中選用為脅迫-誘導(dǎo)基因a0528基因(OsNAC6SEQ ID NO3)和a2660(SalTSEQ ID NO4)cDNA的同源位點(diǎn)。結(jié)果，在觀察到同源性的基因中，位于該基因從起始密碼子上游向5’端方向的1.5kb序列選作為a0528基因的啟動(dòng)子序列，位于該基因上游的1.6kb序列選作為a2660的啟動(dòng)子序列(分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。
每一啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)構(gòu)見圖2和圖3。盡管OsNAC6具有順式序列ABA效應(yīng)元件(ABRE)，但是SalT在啟動(dòng)子序列中不具有特異性順式序列。
2.克隆以篩選到的啟動(dòng)子序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)引物，用水稻基因組DNA作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行克隆。引物序列及PCR使用的條件如下引物序列OsNAC正向ctcccctacgaagcttaggtagt(SEQ ID NO5)OsNAC反向aaggatcctctctcccccttctccggt(SEQ ID NO6)SalT正向gccagaagcttaggaacacctgtacccg(SEQ ID NO7)SalT反向cagcgggatcctctgtttagtaaatac(SEQ ID NO8)PCR條件95℃、1分鐘，55℃、1分鐘，68℃、2分鐘，共30個(gè)循環(huán)。
SalT啟動(dòng)子的功能分析用玉米的泛素啟動(dòng)子取代pBIG29APHSNot的啟動(dòng)子位點(diǎn)制備G-ubi質(zhì)粒。用BamH I-Hind III切割G-ubi質(zhì)粒，與用同一方式切割后的SalT啟動(dòng)子的片段連接，將已引入了SalT啟動(dòng)子的質(zhì)粒用BamHI-EcoR I切割，同樣，將其與從pBI221(Clontech)中用BamH I-EcoR I切出的Gus基因連接制備成GUS-表達(dá)構(gòu)建體G-SalTGUS(圖4)。電穿孔將質(zhì)粒G-SalTGUS導(dǎo)入培養(yǎng)后用10％甘油洗滌后的農(nóng)桿菌EHA105，從而制備出產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子的農(nóng)桿菌EHA105(G-SalTGUS)。
將水稻種籽浸沒在70％乙醇中1分鐘，然后浸沒在2％次氯酸鈉中1小時(shí)消毒。然后用無(wú)菌水洗滌消毒后的種籽，每一種種籽各取9粒播種在N6D固體培養(yǎng)基(每升中含3.98g CHU[N6]Basal SaltMixure(Sigma)，30g蔗糖、100mg肌醇、300mg酪蛋白氨基酸、2,878mgL-脯氨酸、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、1mg鹽酸硫胺素、2mg 2，4-D以及4g Gellite，pH5.8)平板上，然后培養(yǎng)24天。因此，愈傷組織被誘導(dǎo)。從大約20個(gè)種籽形成的胼胝體轉(zhuǎn)移到新的N6D固體培養(yǎng)基上，然后再培養(yǎng)3天。
將農(nóng)桿菌EHA105(G-SalTGUS)分別在含100mg/l利福平和含20mg/l卡那霉素的5ml YEP培養(yǎng)基(每升中含細(xì)菌培養(yǎng)用蛋白胨10g、細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物10g，NaCl 5g、MgCl2·6H2O 406mg，pH7.2)中28℃下培養(yǎng)24小時(shí)。用含20mg/l acetosyringon的AAM培養(yǎng)基(每升中含有10mg MnSO4·5H2O、3mg H3BO3、2mg ZnSO4·7H2O、250μgNa2MoO4·2H2O、25μg CuSO4·5H2O、25μg CoCl2·6H2O、750μg KI、150mgCaCl2·2H2O、250mg MgSO4·7H2O、40mg Fe-EDTA、150mgNaH2PO4·2H2O、1mg煙酸、10mg鹽酸硫胺素、1mg鹽酸吡哆醇、100mg肌醇、176.7mg L-精氨酸、7.5mg甘氨酸、900mg L-谷酰胺、300mg天門冬氨酸和3g KCl、pH5.2)稀釋該農(nóng)桿菌至O.D.660值為0.1。因此，制備得到20ml農(nóng)桿菌懸液。
隨后，將農(nóng)桿菌懸液加入培養(yǎng)了3天后的胼胝體，然后混合1分鐘。然后，將該胼胝體放置在消毒后的紙巾上去除多余的農(nóng)桿菌懸液，然后在其上已放置了消毒后的濾紙的2N6-AS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，(每升中含3.98g CHU[N6]Basal Salt Mixure，30g蔗糖、10g葡萄糖、100mg肌醇、300mg酪蛋白氨基酸、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、1mg鹽酸硫胺素、2mg 2，4-D、10mg acetosyringon以及4g Gellite，pH5.2)黑暗處25℃下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)3天后，用含有500mg/l羧芐青霉素的3％蔗糖水溶液徹底洗滌該培養(yǎng)產(chǎn)物直至該產(chǎn)物不變白。將洗滌后的培養(yǎng)產(chǎn)物在含500mg/l羧芐青霉素和10mg/l潮霉素的N6D培養(yǎng)基上再培養(yǎng)1周。然后，將得到的培養(yǎng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到含500mg/l羧芐青霉素和50mg/l潮霉素的N6D固體培養(yǎng)基上再培養(yǎng)18天。然后，把該胼胝體轉(zhuǎn)移到再分化培養(yǎng)基(每升含有4.6g Murashige and Skoog Plant SaltMixture(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd)，30g蔗糖、30g山梨醇、2g酪蛋白氨基酸、100mg肌醇、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、0.1mg鹽酸硫胺素、2mg NAA、2mg激動(dòng)素、250mg羧芐青霉素、50mg潮霉素及8g瓊脂糖，pH5.8)。每隔一周將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行再分化。將那些芽體長(zhǎng)到大約1cm長(zhǎng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到無(wú)激素培養(yǎng)基(每升含有4.6g Murashige and Skoog Plant SaltMixture(Nihon Pharmaceutical Co.，Ltd)，30g蔗糖、2mg甘氨酸、0.5mg煙酸、0.5mg鹽酸吡哆醇、0.1mg鹽酸硫胺素、50mg潮霉素以及2.5gGellite，pH5.8)。將那些在無(wú)激素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)到約8cm的植物體轉(zhuǎn)移到裝有合成顆粒狀盆用土壤(Bonsol No.1，Sumitomo Chemical Co.，Ltd.)的盆中讓轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生種籽。
得到的GUS-表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的T2代在水生環(huán)境下生長(zhǎng)2周，并以與實(shí)施例1相同方式暴露在脫水脅迫下。
類似地，將rd29A啟動(dòng)子(SEQ ID NO9Nature Biotechnology(1999)17287-291)或35S啟動(dòng)子(SEQ ID NO10)連接到GUS基因的上游得到構(gòu)建體。將得到的該構(gòu)建體引入水稻和/或煙草。
就表達(dá)GUS的轉(zhuǎn)基因煙草而言，讓從T1代植株再生得到的植株在植物生長(zhǎng)錐體中生長(zhǎng)3～5周，將生長(zhǎng)的葉片一分為二。其中一個(gè)作為對(duì)照測(cè)定，另一個(gè)在室溫下空氣干燥，然后暴露于脫水脅迫下。
4-methylumbellifery-β-D-葡萄糖苷酸降解導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的變化，據(jù)此來分析每一轉(zhuǎn)基因水稻及煙草的GUS活性。圖5顯示了在施加脫水脅迫時(shí)已導(dǎo)入不同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性。
圖5中清楚可見，脅迫-誘導(dǎo)的SalT啟動(dòng)子在單子葉植物即水稻中的活性水平比rd29A啟動(dòng)子要高。相比較而言，盡管SalT啟動(dòng)子在雙子葉植物煙草中也表現(xiàn)出了脅迫-誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性，但是其活性比水稻中的活性弱。
另外，將其中已導(dǎo)入SalT啟動(dòng)子-GUS構(gòu)建體的水稻整個(gè)植株浸沒入鹽水中，進(jìn)行GUS染色。結(jié)果，整個(gè)植株都被染色(圖6)。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)SalT啟動(dòng)子在給予了脅迫的整個(gè)植株中能夠發(fā)揮作用。
OsNAC6啟動(dòng)子的功能分析用玉米的泛素啟動(dòng)子取代pBIG29APHSNot的啟動(dòng)子位點(diǎn)制備G-ubi質(zhì)粒。用BamH I-Hind III切割G-ubi質(zhì)粒，與用同一方式切割后的OsNAC6啟動(dòng)子片段連接，將已引入了OsNAC6啟動(dòng)子的質(zhì)粒用BamH I-EcoR I切割，同樣，將其與從pBI221(Clontech)中用BamH I-EcoR I切出的Gus基因連接制備成GUS-表達(dá)構(gòu)建體(圖4)。用農(nóng)桿菌將制備的構(gòu)建體導(dǎo)入水稻或煙草中制成轉(zhuǎn)化子。
按照實(shí)施例1的方法將轉(zhuǎn)基因的水稻和煙草暴露于脫水脅迫下，用實(shí)施例3的方法分析GUS活性。結(jié)果，脫水誘導(dǎo)的OsNAC6啟動(dòng)子活性水平很高(圖7)。OsNAC6啟動(dòng)子活性水平在水稻中比在煙草中更高。按照實(shí)施例1的方法將轉(zhuǎn)基因水稻的T2代暴露于脫水、鹽或低溫脅迫下，用組織染色法來探測(cè)施加脅迫后植物中GUS的表達(dá)狀況。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)OsNAC6啟動(dòng)子使得以脫水、鹽、或低溫脅迫依賴性模式在整個(gè)植株中表達(dá)GUS(圖8)。
因此，發(fā)現(xiàn)SalT啟動(dòng)子和OsNAC6啟動(dòng)子是以脅迫-誘導(dǎo)模式被激活的，并且它們使得脅迫耐受基因在其控制下被表達(dá)。此外，該啟動(dòng)子的脅迫-誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性的水平是如此的高，該水平此前還從未在單子葉植物中觀察到。因此，如果用于增強(qiáng)脅迫耐受性的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)控基因被這樣連接使得位于本發(fā)明所述啟動(dòng)子的控制下，并被導(dǎo)入植物，那么就可以在包括水稻在內(nèi)的重要的谷類植物的單子葉植物中制備出高脅迫耐受性的轉(zhuǎn)基因植物。
pBE35SOsDREB1A、G-ubiOsDREB1A和G35S-ShΔOsDREB1A的制備按下述方法制備G-ubi和G35S-ShΔ。首先，用BamHI切割pBIG質(zhì)粒(Nucleic Acids Research 18203(1990))，平端化，并連接，從而刪除該BamHI切割位點(diǎn)。然后，用Hind III和EcoR I切割該質(zhì)粒。將得到的片段和一個(gè)通過相同方式切割pBE2113Not質(zhì)粒得到的長(zhǎng)約1.2kb的片段彼此連接，從而制備出pBIG2113Not質(zhì)粒。
隨后，用Hind III和BamHI切割pBIG2113Not，并與以相同方式切割rd29A啟動(dòng)子得到的一個(gè)片段(約0.9kb，Nature Biotechnology17287-291(1999))連接，從而制備出pBIG29APHSNot質(zhì)粒。接著，用Hind III和Sal I切割該pBIG29APH SNot質(zhì)粒，然后與玉米的泛素基因(Ubi-1)啟動(dòng)子的一個(gè)片段(約2.0.kb，Plant MolecularBiology 18675-689(1992))或者一個(gè)其中含有p35S-shΔ-stop的CaMV35S啟動(dòng)子和玉米蔗糖合成酶基因(Sh1)一部分內(nèi)含子的片段(約1.6kb，Proceeding National Academy of Science USA 9615348-15353(1999))連接，這些片段是以同一方式切割得到的。從而，制得G-ubi質(zhì)粒和G35S-ShΔ質(zhì)粒。
用BamHI切割上述的pBE2113Not、G-ubi和G35S-ShΔ，并用Ligation High(Toyobo Co.，Ltd.)與同樣切割得到的OsDREB1A基因(SEQ ID NO11)中編碼水稻轉(zhuǎn)錄因子的片段連接。用以此得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子后，從中純化出質(zhì)粒pBE35SOsDREB1A、G-ubiOsDREB1A和G35S-ShΔOsDREB1A。
發(fā)明效果本發(fā)明提供了一種脅迫-誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可以在單子葉植物中發(fā)揮功效。使用該啟動(dòng)子，可以賦予包括水稻等谷類類植物在內(nèi)的單子葉植物以極強(qiáng)的脅迫耐受性。
SEQ ID NO5-人工序列描述引物SEQ ID NO6-人工序列描述引物SEQ ID NO7-人工序列描述引物SEQ ID NO8-人工序列描述引物序列表<110>獨(dú)立行政法人 國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心<120>來自水稻的脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子<130>PH-1725<140>
<141>
<150>JP 2002-377316<151>2002-12-26<160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1608<212>DNA<213>水稻<220>
<223>發(fā)明人筱崎和子，桂幸次，伊藤裕介<400>1
caacaaccac tactgaacac ggctaagtgt gtttcctctc ctcgaagatg tcgttattgc 60gttcttttct gctattccat acatatcaat ctctagagga acaccttact ctagctttca 120gacaagggac ggtggtaaat cacgtcgtat cctccatggg gtgtgctccg aaaaaccttc 180cctcatgcat tagagatcat gggtggaatt tagcgatggc acaccttatt tataatttag 240ttactctccg gcggtaccat ctgcttccgt ttgttgatcg atgctggcga tgatgtgtgt 300gagtatcgat caacagaatg atcggacgct atttttgggg tcgttttttt tcagcattga 360ggagggatga ggattgcttg caacatgcag gtgctgctca aaacaacggt taagcagata 420tccgtcaatt tgatagtaag atctgtaacg cgtggtcttt cgagctgaaa actatggact 480ctttgaaaca aagataatat tatattaaat tctattattc aaagatatct aaatatttag 540aaagatatta ataatgttat taaactttga cttacttaaa acaagtccaa aactgcatgt 600ccctaaatcg ccagaagata aggaacacct gtacccgtga taacagaggg gtatgaaatt 660tggacacgag gcttctttgg cagacgtggc gctgagtgag cttggctcgc ttggtcaaac 720tccgtgcagg gacattcagt tagctagcta gcagcattgt cgacaataag atagccttta 780aatgttagca ctcaccagct tgtcaaaaac caaggcttgg tgacggcggc ttcagaatga 840aggatagatg gataaatgtc tagaatatta taaagtccaa caaaagatgg agcacatgca 900tgaaagatta cgtacacgaa tgcagttgat acagtggatg ttaggcataa gaagcactat 960aaatagaggg tgcaatcccc attgccctac acaactacac aagtcgacta tcattacaag 1020gaaatttaag cgaccacgaa ggtatgaaag catagcagta ctctgcattt tttttttttg 1080atgttgttct agctagctct gcttaaggtt ttcctttctt tcgttctttg tttttttttt 1140gtaagctcaa ctagttgcat gcaatttaga ttttatcctt ttacagttgg aaaaacatcc 1200ctataaatat taccatgaat gcatagagat tcgaggaagc tacaaattgg acgactgatt 1260ccaaaaaaaa aaaaaaaatc agatggtcac atcattgcta ttgttttgtg aaagtacaaa 1320agcactcgtt cggattcaaa ttacttgtgc aaattaatta aaaaccatag aaatgatcat 1380gttaccccta cacatttcgg aaacaatacc atatatgtta gtgtgcgatc attcaaattg 1440atttatatct gaacaaaact gagtgggaat acggtgagca aacttgacga ttccaaaata 1500atttatattt aggcaaaatt ttacaacttc aaagttcaaa caagctaacc tgaaaaatca 1560tgtttgaatt tactaagatg tgcttttgta tttactaaac agagtatg 1608
<210>2<211>1520<212>DNA<213>水稻<400>2ctcccctacg aagcttaggt gtagtgataa gaaaaatcga gaaggattgg tacaagttaa 60caacttaatc aatagattgt gcatatagca aacaagtcta tataataaca caaagagaaa 120gaaagaagac ccattttagt tgatagtggt attattaccc aaaaattaaa aatacgttca 180atttagacct acttttataa gcatcatgcc agctacagct acagtcacag cctctttcat 240ccctttttct ttcttccaaa aaacgctcac ctgtagtgat ggatctatgt gaaagttgtg 300aggtcgaatg tcgaatgacc ctacagcttc ttcacattca ttcttgagta ctaaattttt 360catggaaatc cattcaaatc tacacaaata atcccactga aatatttaat aataataatc 420gatctcacaa agtaacttta tctaataatt tattgactcc gccactgaat ttaagtgtag 480tgataaaaaa tcgagaagaa ggtttggtgc aaattaacaa cttaaacatg aaattaaatt 540gtacatgtag caaacaacct ttataataac acaaaaaaaa ccattttagt tgaaagtggt 600attgctaaaa gagttaaaag tatttcaatt tagagcaaca tgccagctac ggctacagtc 660acaacccctt tatccttttt ctttcttcca aaatacaaac gcttacctta cagtgatggt 720tctatgtcaa agctgtgggg tccgttgacc ccatagtttc ttaccatcat cgtttagagt 780ttcttaaatt ttctatattt atccgttgaa atttacacaa ataatcccac taaaatatat 840agtaatgata atcgatgtca cagagtaaat ttgctggctc tgccactact cacctgtaac 900cccccaacta tgccaccaaa cacacataac tcatcgcctc atcatcgtca tctatctccg 960catgagaccg catccttatc ccaccacgtc cccctcgcgc tcacgcgcac agcaacaaag 1020aaaaaaaaaa aaacccgtcc cttttccctc gccgccccac cgctccccca ccccacgtgt 1080cgccggccca tcggcggcgg cgcctgcgtg ggccgtgtgg cccaccctgc ggccccttcc 1140cgaaaacgga acgccccccc cctcctcccc tctccacgtc actgcgcggt gggcccgcgc 1200gtgcgtccaa gaagcgtgac gtaagcagtg acagaatccg cgccgcctct cggggcgccc 1260acgtgtcgcg gtcaaacggt cagcgcgggg cgggggctcg catcgcatct gctccacgtg 1320tgcgctatcg cggctgcggc cgcacgggcc acacgtgtcg cttgcccccg gctctataaa 1380
tgcccggctc ctcacccgga acaagtttca agccctcctc tcctcttccc aacactagta 1440ggataaagcc acagagagag cagtagtagt agcgagctcg ccggagaacg gacga tcacc 1500ggagaagggg gagagagatg 1520<210>3<211>545<212>DNA<213>水稻<400>3cgactatcat tacaaggaaa tttaagcgac cacgaagagt atgacgctgg tgaagattgg60tccgtggggc ggaaatggag ggtcagctca ggacatcagt gtgccaccca agaagctgtt 120aggcgtgaca atctacagct cagatgcaat cagatccatt gccttcaact acatcggtgt 180ggatggacag gaatatgcca ttggtccatg gggtgggggc gaaggcacct ctacagagat 240taaactgggc tcctctgagc agatcaagga gatttctgga acccatggcc cagtctatga 300tctggctgac attgtcacct atcttaagat tgtgacaagt gctaataata catacgaggc 360tggagtccca aatggaaagg aattcagcat tccactgcaa gactctggcc atgtcgttgg 420attctttgga aggtctggaa cgcttatcga cgcaattggc atctacgtcc acccttgatt 480cccagtggtc aaagaattac tacctactac catatctacg aaataatgtt ccatggtgtt 540gttgt 545<210>4<211>1423<212>DNA<213>水稻<400>4
tcgacccacg cgtccgctct tcccaacact agtaggataa agccacagag agagcagtag 60tagtagcgag ctcgccggag aacggacgat caccggagaa gggggagaga gatgagcggc 120ggtcaggacc tgcagctgcc gccggggttc cggttccacc cgacggacga ggagctggtg 180atgcactacc tctgccgccg ctgcgccggc ctccccatcg ccgtccccat catcgccgag 240atcgacctct acaagttcga tccatggcag cttccccgga tggcgctgta cggagagaag 300gagtggtact tcttctcccc gcgagaccgc aagtacccga acgggtcgcg gccgaaccgc 360gccgccgggt cggggtactg gaaggcgacc ggcgccgaca agccggtggg ctcgccgaag 420ccggtggcga tcaagaaggc cctcgtcttc tacgccggca aggcgcccaa gggcgagaag 480accaactgga tcatgcacga gtaccgcctc gccgacgtcg accgctccgc ccgcaagaag 540aacagcctca ggttggatga ttgggtgctg tgccggattt acaacaagaa gggcgggctg 600gagaagccgc cggccgcggc ggtggcggcg gcggggatgg tgagcagcgg cggcggcgtc 660cagaggaagc cgatggtggg ggtgaacgcg gcggtgagct ccccgccgga gcagaagccg 720gtggtggcgg ggccggcgtt cccggacctg gcggcgtact acgaccggcc gtcggactcg 780atgccgcggc tgcacgccga ctcgagctgc tcggagcagg tgctgtcgcc ggagttcgcg 840tgcgaggtgc agagccagcc caagatcagc gagtgggagc gcaccttcgc caccgtcggg 900cccatcaacc ccgccgcctc catcctcgac cccgccggct ccggcggcct cggcggcctc 960ggcggcggcg gcagcgaccc cctcctccag gacatcctca tgtactgggg caagccattc 1020tagacgacca aaaaaaaaaa aaaacaaccg cattggcagc aatggtgtca ctgaacaccg 1080tgcaggctag ctagcttcat ggccggtgaa ctttgactca ggcgagccgc cggagttgac 1140tcaaagataa ttaaaagaag tgttttaagt ggattggatt ggattagaca gaggagatga 1200ggactcgaga aaggcggcga tgagaccgtg gttgggggga ccctggcctg gactgaacga 1260cgacgaggca gcagcagaaa gatggtgcaa ttgcatcggg tggcatgtca gtgtgtgtgt 1320atagtggcat gtacatagta catggtgatt gattcggtat acagggggct agctttcctg 1380tttctgttta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1423<210>5<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>5ctcccctacg aagcttaggt agt23<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>6aaggatcctc tctccccctt ctccggt27<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>7gccagaagct taggaacacc tgtacccg 28<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>8cagcgggatc ctctgtttag taaatac 27<210>9<211>940<212>DNA<213>擬南芥<400>9gccatagatg caattcaatc aaactgaaat ttctgcaaga atctcaaaca cggagatctc 60aaagtttgaa agaaaattta tttcttcgac tcaaaacaaa cttacgaaat ttaggtagaa 120cttatataca ttatattgta attttttgta acaaaatgtt tttattatta ttatagaatt 180ttactggtta aattaaaaat gaatagaaaa ggtgaattaa gaggagagag gaggtaaaca 240ttttcttcta ttttttcata ttttcaggat aaattattgt aaaagtttac aagatttcca 300tttgactagt gtaaatgagg aatattctct agtaagatca ttatttcatc tacttctttt 360atcttctacc agtagaggaa taaacaatat ttagctcctt tgtaaataca aattaatttt 420
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agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacg 835<210>11<211>927<212>DNA<213>水稻<220>
<221>CDS<222>(69)..(782)<400>11cacactcgag cagagcaaat acagttcagg aatcaggagc aagcagaaac acacacacaa 60atccgaag atg tgc ggg atc aag cag gag atg agc ggc gag tcg tcg ggg 110Met Cys Gly Ile Lys Gln Glu Met Ser Gly Glu Ser Ser Gly1 5 10tcg ccg tgc agc tcg gcg tcg gcg gag cgg cag cac cag acg gtg tgg 158Ser Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ala Glu Arg Gln His Gln Thr Val Trp15 20 25 30acg gcg ccg ccg aag agg ccg gcg ggg cgg acc aag ttc agg gag acg 206Thr Ala Pro Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr35 40 45agg cac ccg gtg ttc cgc ggc gtg cgg cgg agg ggc aat gcc ggg agg 254
Arg His Pro Val Phe Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Asn Ala Gly Arg50 55 60tgg gtg tgc gag gtg cgg gtg ccc ggg cgg cgc ggc tgc agg ctc tgg302Trp Val Cys Glu Val Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Cys Arg Leu Trp65 70 75ctc ggc acg ttc gac acc gcc gag ggc gcg gcg cgc gcg cac gac gcc350Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ala Glu Gly Ala Ala Arg Ala His Asp Ala80 85 90gcc atg ctc gcc atc aac gcc ggc ggc ggc ggc ggc ggg gga gca tgc398Ala Met Leu Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Cys95 100 105 110tgc ctc aac ttc gcc gac tcc gcg tgg ctc ctc gcc gtg ccg cgc tcc446Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Trp Leu Leu Ala Val Pro Arg Ser115 120 125tac cgc acc ctt cgc cga cgt ccg cca cgc cgt gcc gag gcc gtc gag494Tyr Arg Thr Leu Arg Arg Arg Pro Pro Arg Arg Ala Glu Ala Val Glu130 135 140gac ttc ttc cgg cgc cgc ctc gcc gac gac gcg ctg tcc gcc acg tcg542Asp Phe Phe Arg Arg Arg Leu Ala Asp Asp Ala Leu Ser Ala Thr Ser145 150 155tcg tcc tcg acg acg ccg tcc acc cca cgc acc gac gac gac gag gag590Ser Ser Ser Thr Thr Pro Ser Thr Pro Arg Thr Asp Asp Asp Glu Glu
160 165 170tcc gcc gcc acc gac ggc gac gag tcc tcc tcc ccg gcc agc gac ctg638Ser Ala Ala Thr Asp Gly Asp Glu Ser Ser Ser Pro Ala Ser Asp Leu175 180 185 190gcg ttc gaa ctg gac gtc ctg agt gac atg ggc tgg gac ctg tac tac686Ala Phe Glu Leu Asp Val Leu Ser Asp Met Gly Trp Asp Leu Tyr Tyr195 200 205gcg agc ttg gcg cag ggg atg ctc atg gag cca cca tcg gcg gcg ctc734Ala Ser Leu Ala Gln Gly Met Leu Met Glu Pro Pro Ser Ala Ala Leu210 215 220ggc gac gac ggt gac gcc atc ctc gcc gac gtc cca ctc tgg agc tac782Gly Asp Asp Gly Asp Ala Ile Leu Ala Asp Val Pro Leu Trp Ser Tyr225 230 235tagagctcaa tcaactgtac aattttgcct cttttttctc tcttttctgg cttccgatgc 842caaaattttg gtactgtacg gacactactt tcggtaatgt gatggaacaa gttgcaaaac 902aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa92權(quán)利要求
1.一種分離的水稻來源的啟動(dòng)子，其如下述下列DNA(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA；或者(b)如下特征的DNA即，能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與互補(bǔ)于(a)中所示DNA的DNA雜交，并表達(dá)脅迫-誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性。
2.權(quán)利要求1中的啟動(dòng)子，其中所述的脅迫為脫水脅迫、低溫脅迫或鹽脅迫。
3.一種重組載體，其中含有權(quán)利要求1或2所述的啟動(dòng)子。
4.權(quán)利要求3中的載體，其中包含用于增強(qiáng)脅迫耐受性的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)控基因，從而使其在權(quán)利要求1或2的啟動(dòng)子控制下發(fā)揮作用。
5.權(quán)利要求4中的載體，其中所述的用于增強(qiáng)脅迫耐受性的結(jié)構(gòu)基因和/或調(diào)控基因選自作為脯氨酸合成中的一種關(guān)鍵酶的P5CS基因、用于肌醇半乳糖苷合成的AtGolS3基因、擬南芥來源的DREB轉(zhuǎn)錄因子基因、水稻來源的OsDREB轉(zhuǎn)錄因子基因和作為ABA合成中關(guān)鍵酶的NCED基因。
6.一種轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子是將權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述載體導(dǎo)入單子葉植物制得的。
7.一種通過將權(quán)利要求1或2所述的啟動(dòng)子導(dǎo)入單子葉植物體從而增強(qiáng)植物脅迫耐受性的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的脅迫－誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠在水稻等單子葉植物中有效發(fā)揮作用，本發(fā)明還提供了使用該啟動(dòng)子的環(huán)境脅迫耐受植物。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1912125SQ20061008995
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月26日
發(fā)明者筱崎和子, 桂幸次, 伊藤裕介 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人國(guó)際農(nóng)林水產(chǎn)業(yè)研究中心, 獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)·食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究機(jī)構(gòu)