專利名稱：菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑及其制備方法，屬于植物源農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，專用于菊芋葉片開發(fā)為植物源殺菌劑。
背景技術(shù)：
近年來，雖然化學(xué)農(nóng)藥的使用在防治病蟲草害中占主導(dǎo)地位，但其弊端也越來越引起國際社會關(guān)注。大量使用化學(xué)農(nóng)藥，特別是高毒農(nóng)藥，使病菌害蟲等產(chǎn)生抗藥性，大量殺死病菌害蟲天敵，造成人畜中毒，也增加了農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)成本，破壞生態(tài)環(huán)境等等。
克服化學(xué)農(nóng)藥的種種缺點(diǎn)，以及無公害農(nóng)產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)，迫切需要低毒、低殘留、無污染、環(huán)境和諧的新型農(nóng)藥。植物是生物活性化合物的天然寶庫，含有多種抗菌、殺蟲活性成分，研究植物源殺菌劑也已成為新型農(nóng)藥開發(fā)的熱點(diǎn)。植物源農(nóng)藥具有對人畜和有益生物的安全性，對作物無藥害，無殘留、不污染環(huán)境，病原菌和害蟲不易產(chǎn)生抗藥性，且開發(fā)研究生產(chǎn)資源豐富等特點(diǎn)。目前通過菊科植物開發(fā)植物源殺菌劑也有一些研究，但大多集中于菊屬等，對于向日葵屬的研究鮮有報(bào)道。
菊芋是菊科(Compositae)向日葵屬中能形成地下塊莖的栽培種，又稱洋生姜、洋姜、鬼子姜等，學(xué)名Helianthus tuberosus L。菊芋喜溫暖，但耐寒；喜濕潤，但耐旱；喜肥沃，但耐貧瘠，耐鹽堿，在我國大多地區(qū)都有種植，也可在濱海鹽土栽培開用海水灌溉。菊芋的地上莖葉和地下塊莖都是優(yōu)良的飼料，地下塊莖含豐富菊糖，可作蔬菜，也可以用于生產(chǎn)果糖糖漿和開發(fā)酒精，是未來的能源植物之一。菊芋因其具有良好的生物學(xué)特性以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，國內(nèi)外對菊芋的研究工作主要集中在食品，飼料，栽培，生產(chǎn)果糖糖漿以及生態(tài)方面。而其能夠經(jīng)霜打和抵御多種病害，無須施用農(nóng)藥的特點(diǎn)易為人所忽視，因此國內(nèi)外對其植株內(nèi)成分抑制病原菌的研究至今仍是空白。本發(fā)明是在對菊芋葉片內(nèi)化學(xué)物質(zhì)抑菌活性研究的基礎(chǔ)上，利用菊芋葉片中化學(xué)物質(zhì)開發(fā)植物源殺菌劑，國內(nèi)外尚屬首例。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本研究的目的在于提供了一種安全、有效、經(jīng)濟(jì)、無公害的天然植物源殺菌劑及其制備方法，同時(shí)充分開發(fā)利用菊芋這一植物資源。
技術(shù)方案1、菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑，其特征在于，該植物源殺菌劑是通過以下方法制備而成的(1)粉碎菊芋的新鮮葉片烘干，粉碎后過40目篩，獲得菊芋葉干粉；
(2)提取稱量制備好的菊芋葉干粉，配以質(zhì)量為5-10倍的石油醚、乙醚、乙酸乙酯或去離子水作為提取溶劑提取，提取混合液減壓過濾后獲得菊芋葉提取液；(3)濃縮、干燥、貯存將提取液真空蒸發(fā)溶劑濃縮，即得膏狀提取物，放在干燥器內(nèi)干燥后獲得提取物干樣，置于4℃冰箱保存；(4)稱取提取物干樣，用上述一種提取溶劑或幾種提取溶劑溶解，即可配成所需濃度的植物源殺菌劑。
上述菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑的制備方法中提取方法包括室溫振蕩提取法、索氏提取法或間歇振蕩提取法，其中室溫振蕩提取法為把裝有菊芋葉干粉和提取溶劑的容器置于振蕩器內(nèi)振蕩1-3天，進(jìn)行振蕩提取，獲得提取混合液；索氏提取法為菊芋葉干粉用濾紙包扎好，裝入索氏提取器中，加入提取溶劑，溫度控制在溶劑的沸點(diǎn)±5℃提取，待提取器支管中流下的液體為無色時(shí)，即為獲得的提取混合液；間歇振蕩提取法為將菊芋葉干粉置于容器中，加入提取溶劑，室溫下振蕩提取4h后靜置8h，重復(fù)4次，總提取時(shí)間為48h，獲得提取混合液。
上述制備方法中最佳提取溶劑是乙酸乙酯。
有益效果本發(fā)明所提供的菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑及其制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果(1)以常見植物菊芋為原料，原料來源廣，價(jià)格低廉，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)工藝簡單，適合各種規(guī)模生產(chǎn)。
(2)抑菌綜合防治效果好。實(shí)驗(yàn)證明，本藥劑能防治真菌、細(xì)菌引起的植物病害，能防治水稻紋枯病、小麥白粉病等作物病害。
(3)生產(chǎn)中無環(huán)境污染，低殘留，對作物無害，對人畜安全，是一種無公害植物源殺菌劑，可用于有機(jī)產(chǎn)品的生產(chǎn)。
(4)充分開發(fā)利用了菊芋這一植物資源。


圖120mg/ml菊芋葉片乙酸乙酯提取物藥劑處理24h對水稻紋枯菌的抑制作用圖220mg/ml菊芋葉片乙酸乙酯提取物藥劑處理36h對水稻紋枯菌的抑制作用圖320mg/ml菊芋葉片乙酸乙酯提取物藥劑處理48h對水稻紋枯菌的抑制作用圖4菊芋葉片乙酸乙酯提取物藥劑不同濃度處理24h對水稻紋枯菌的抑制作用圖5菊芋葉片乙酸乙酯提取物藥劑不同濃度處理36h對水稻紋枯菌的抑制作用圖6菊芋葉片乙酸乙酯提取物藥劑不同濃度處理48h對水稻紋枯菌的抑制作用具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
供試菊芋(中國)，以菊芋葉片為原料，分別以石油醚、乙酸乙酯、乙醚或去離子水為提取溶劑，按照以上方法配成藥劑實(shí)施如下(1)原料處理菊芋的新鮮葉片采于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)山東萊州863中試基地，然后置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，控溫在(40±1)℃烘干至發(fā)脆。用微型植物試樣粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，得到菊芋葉干粉，密封于塑料袋中備用。
(2)索氏提取法提取稱量25g菊芋葉干粉，用濾紙包扎好，裝入250ml索氏提取器中，加入200ml提取溶劑提取，溫度控制在溶劑的沸點(diǎn)±5℃提取，待提取器支管中流下的液體為無色時(shí)，約3小時(shí)，即停止提取。所得提取混合液減壓過濾后即獲得菊芋葉片提取液。
(3)濃縮、干燥、貯存將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空濃縮，即得膏狀提取物，放在干燥器內(nèi)干燥后獲得提取物干樣，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 各溶劑提取率的計(jì)算公式如下提取率(％)＝提取物干樣質(zhì)量(g)/菊芋葉干粉質(zhì)量(g)×100％各溶劑索氏提取法對菊芋葉片的提取率參見表1，各溶劑索氏提取法對菊芋葉片的提取率差異明顯。石油醚、乙醚、乙酸乙酯和水的提取率分別是1.6％、2.1％、3.5％和6.7％；水提取率最高，達(dá)到6.69％，石油醚提取率最低，只有1.56％。
實(shí)施例2供試菊芋(中國)，以菊芋葉片為原料，分別以石油醚、乙酸乙酯、乙醚或去離子水為提取溶劑，按照以上方法配成藥劑實(shí)施如下(1)原料處理菊芋的新鮮葉片采于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)山東萊州863中試基地，然后置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，控溫在(40±1)℃烘干至發(fā)脆。用微型植物試樣粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，得到菊芋葉干粉，密封于塑料袋中備用。
(2)間歇振蕩提取法提取稱量10g菊芋葉干粉，裝入250ml三角瓶中，加入100ml提取溶劑，置于振蕩器內(nèi)，室溫下振蕩提取4小時(shí)后靜置8小時(shí)，重復(fù)4次，總提取時(shí)間為48小時(shí)。所得提取混合液減壓過濾后即獲得菊芋葉片提取液。
(3)濃縮、干燥、貯存將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空濃縮，即得膏狀提取物，放在干燥器內(nèi)干燥后獲得提取物干樣，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 各溶劑提取率的計(jì)算公式如下提取率(％)＝提取物干樣質(zhì)量(g)/菊芋葉干粉質(zhì)量(g)×100％各溶劑間歇振蕩提取法對菊芋葉片的提取率參見表2，各溶劑間歇振蕩提取法對菊芋葉片的提取率差異明顯。石油醚、乙醚、乙酸乙酯和水的提取率分別是1.1％、1.5％、2.3％和1.6％；乙酸乙酯提取率最高，達(dá)到2.3％，石油醚提取率最低，只有1.1％。
實(shí)施例3室內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)采用生長速率法測定菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑對水稻紋枯菌生長量的抑制作用。在無菌條件下，取0.60g的制備的菊芋葉片乙醚提取物干樣，加3ml乙醚溶解，加入到融化的27ml PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊膠)培養(yǎng)基中搖勻后，平均倒入三個(gè)滅菌培養(yǎng)皿中(d＝8.5cm)，即3個(gè)重復(fù)，菊芋葉片提取物干樣在PDA中的濃度為20mg/ml，凝固后分別接入水稻紋枯菌菌株(代號NN1，拉丁學(xué)名Rhizoctonia solani Kühn，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)專業(yè)分離，本實(shí)驗(yàn)室保存)。以3ml乙醚溶劑加入到培養(yǎng)基中作為對照。接入的菌株25-27℃培養(yǎng)，分別在接入菌株后24h、36h和48h觀察測量。每個(gè)菌落按十字交叉法測量直徑兩次，以其平均值代表菌落的大小。抑菌率的計(jì)算公式如下校正直徑(cm)＝菌落平均直徑(cm)-菌餅直徑(0.5cm)抑菌率(％)＝(對照校正直徑-處理校正直徑)/對照校正直徑×100實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)參見表3，藥劑處理的水稻紋枯菌菌落直徑顯著小于對照，24h時(shí)對照水稻紋枯菌落校正直徑為2cm，而乙醚提取物藥劑處理的菌落校正直徑為0.13cm，藥劑抑菌率為93.75％；36h時(shí)對照水稻紋枯菌落校正直徑為4.11cm，而乙醚提取物藥劑處理的菌落校正直徑為0.97cm，藥劑抑菌率為76.47％；48h時(shí)對照水稻紋枯菌落校正直徑為6.30cm，而乙醚提取物藥劑處理的菌落校正直徑為2.14cm，藥劑抑菌率為66.01％。因此，在48h內(nèi)藥劑處理抑菌率均達(dá)到66％以上，藥劑抑菌效果明顯。
實(shí)施例4不同濃度藥劑的室內(nèi)抑菌實(shí)驗(yàn)采用平板二倍稀釋法測定菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑不同濃度下對水稻紋枯菌生長量的抑制作用，從而確定其最低抑菌濃度(MIC)。在無菌條件下，稱取菊芋葉片乙酸乙酯提取物干樣2.4g，加12ml溶劑溶解后，提取物濃度為200mg/ml；取出其中6ml用滅菌水稀釋一倍，則提取物濃度為100mg/ml，類似稀釋方法配制成系列提取物濃度50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.3mg/ml、3.1mg/ml、1.6mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml的藥液。分別取各濃度藥液6ml加入到融化的24ml PDA培養(yǎng)基中搖勻后，平均倒入三個(gè)滅菌培養(yǎng)皿中(d＝8.5cm)，即3個(gè)重復(fù)，由此制備含有系列提取物濃度的PDA培養(yǎng)基平板，濃度分別為40mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.63mg/ml、0.31mg/ml、0.16mg/ml、0.08mg/ml、0.04mg/ml，待平板凝固后分別接入水稻紋枯菌菌株(代號NN1，拉丁學(xué)名Rhizoctoniasolani Kühn，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)專業(yè)分離，本實(shí)驗(yàn)室保存)。以加入相應(yīng)量濟(jì)劑的培養(yǎng)基作為對照。接入的菌株25-27℃培養(yǎng)，分別在接入菌株后24h、36h和48h觀察測量。每個(gè)菌落按十字交叉法測量直徑兩次，以其平均值代表菌落的大小。抑菌率的計(jì)算公式如下校正直徑(cm)＝菌落平均直徑(cm)-菌餅直徑(0.5cm)抑菌率(％)＝(對照校正直徑-處理校正直徑)/對照校正直徑×100
實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)參見表4，20mg/ml的菊芋葉片乙酸乙酯提取物濃度處理對水稻紋枯菌的抑制率在48h內(nèi)均在80％以上，40mg/ml的濃度處理抑菌率在48h內(nèi)均為100％，而0.04mg/ml的濃度處理已幾乎沒有抑制作用，所以乙酸乙酯提取物藥劑處理最低抑菌濃度是40mg/ml。圖1、圖2和圖3直觀地顯示20mg/ml乙酸乙酯提取物藥劑的試驗(yàn)結(jié)果，圖中上行為處理，下行為對照。圖4、圖5和圖6，圖中PDA培養(yǎng)基中提取物濃度，下行開始由左至右分別是0、1.25、2.5、5、10、20mg/ml，最右為40mg/ml。
實(shí)施例5大田作物抑菌試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)在江蘇省農(nóng)科院小麥試驗(yàn)田內(nèi)，試驗(yàn)小區(qū)栽培條件均勻一致，小麥長勢基本一致，自然感染小麥白粉病。設(shè)藥劑濃度20倍和40倍，和空白對照共3個(gè)處理，3次重復(fù)，小區(qū)面積2m2。藥劑濃度的均采用菊芋葉片乙酸乙酯提取物干樣質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算，換算方法如下20倍＝50mg/ml，40倍＝25mg/ml。試驗(yàn)于2006年4月26日進(jìn)行；采用工農(nóng)-16型背負(fù)手動式噴霧器進(jìn)行低容量噴霧，藥液均勻噴施在小麥植株上。
調(diào)查分三次，藥前(4月25日)、施藥后2天(4月28日)和9天(5月5日)，在各小區(qū)內(nèi)，采取兩點(diǎn)取樣，每點(diǎn)查0.2m2的植株，調(diào)查每株的旗葉及旗葉下第一片葉的發(fā)病程度，計(jì)算病情指數(shù)和防效。
小麥白粉病葉片病情分級標(biāo)準(zhǔn)為0級葉無病斑；1級病斑面積占全葉面積的5％以下；3級病斑面積占全葉面積的6％～15％；5級病斑面積占全葉面積的16％～25％；7級病斑面積占全葉面積的26％～50％；9級病斑面積占全葉面積的50％以上。
病情指數(shù)和防治效果的計(jì)算公式如下病情指數(shù)(％)＝∑(各級病葉數(shù)×發(fā)病級數(shù))/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)×100防治效果(％)＝[1-CK0×Pt1/(CK1×Pt0)]×100上述公式中，CK0空白對照區(qū)施藥前病情指數(shù)；CK1空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)；Pt0藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù)；Pt1藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。
通過試驗(yàn)觀察和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(表5)，發(fā)現(xiàn)藥后兩天和9天，各藥劑處理病情指數(shù)與對照相比均有顯著差異，20倍藥后兩天和9天病情指數(shù)分別為32.2％和20.4％，而對照病情指數(shù)分別為56.9％和38.7％，防效分別為42.6％和68.3％；各藥劑處理間也存在明顯的差異，20倍和40倍藥劑處理9天防效分別為68.％和41.9％。從整體試驗(yàn)效果看，高濃度藥劑處理對小麥白粉病田間防治效果較為理想。
表1各溶劑索氏提取法對菊芋葉片的提取率

表2各溶劑間歇振蕩提取法對菊芋葉片的提取率

表320mg/ml菊芋葉片乙醚提取物藥劑對水稻紋枯菌的抑制效果

表4不同濃度菊芋葉片乙酸乙酯提取物藥劑對水稻紋枯菌的抑制效果

表5菊芋葉片乙酸乙酯提取物藥劑對小麥白粉病田間實(shí)驗(yàn)效果

權(quán)利要求
1.菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑，其特征在于，該植物源殺菌劑是通過以下方法制備而成的(1)粉碎菊芋的新鮮葉片烘干，粉碎后過40目篩，獲得菊芋葉干粉；(2)提取稱量制備好的菊芋葉干粉，配以質(zhì)量為5-10倍的石油醚、乙醚、乙酸乙酯或去離子水作為提取溶劑提取，所得提取混合液減壓過濾后獲得菊芋葉提取液；(3)濃縮、干燥、貯存將提取液真空蒸發(fā)溶劑濃縮，即得膏狀提取物，放在干燥器內(nèi)干燥后獲得提取物干樣，置于4℃冰箱保存；(4)稱取提取物干樣，用上述一種提取溶劑或幾種提取溶劑溶解，即可配成所需濃度的植物源殺菌劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑，其特征在于，制備方法中提取方法包括室溫振蕩提取法、索氏提取法或間歇振蕩提取法，其中室溫振蕩提取法為把裝有菊芋葉干粉和提取溶劑的容器置于振蕩器內(nèi)室溫振蕩1-3天，進(jìn)行振蕩提取，獲得提取混合液；索氏提取法為菊芋葉干粉用濾紙包扎好，裝入索氏提取器中，加入提取溶劑，溫度控制在溶劑的沸點(diǎn)±5℃提取，待提取器支管中流下的液體為無色時(shí)，即獲得提取混合液；間歇振蕩提取法為把裝有菊芋葉干粉和提取溶劑的容器置于振蕩器內(nèi)，室溫下振蕩提取4h后靜置8h，重復(fù)4次，總提取時(shí)間為48h，獲得提取混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑，其特征在于，制備方法中最佳提取溶劑是乙酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以菊芋葉片開發(fā)的植物源殺菌劑，以菊芋葉片為原料，粉碎烘干獲得菊芋葉干粉，配以質(zhì)量為5－10倍的石油醚、乙醚、乙酸乙酯或去離子水作為提取溶劑提取，減壓過濾、濃縮、干燥獲得提取物干樣，再用提取溶劑溶解，即可配成所需濃度的植物源殺菌劑。本發(fā)明原料來源廣，生產(chǎn)成本低，抑菌綜合防治效果好，生產(chǎn)中無環(huán)境污染，低殘留，對作物無害，對人畜安全，是一種無公害植物源殺菌劑。
文檔編號A01P3/00GK1883276SQ20061008964
公開日2006年12月27日 申請日期2006年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月7日
發(fā)明者劉兆普, 劉海偉, 隆小華, 劉玲 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)