專利名稱：一種骨材料保存液及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物材料領域，具體涉及一種骨材料保存液及其制備方法和用途。
背景技術：
對于創(chuàng)傷、感染、腫瘤或先天性疾病所導致的骨缺損，采用異體骨或異種骨移植修復骨缺損是臨床常用方法。對骨材料的保存方法，目前報導的主要有兩大類一類是濕法保存，即使用保存液浸泡保存；另一類是低溫保存，第三類是凍干后常溫保存。
目前報道過的濕法保存所用的保存液有蜂蜜、全血或血漿、硫酸汞、酒精、福爾馬林、洗必泰甘油液、二甲基亞砜等，其中一部分需要和低溫保存法配合使用，使用繁瑣，也不能克服低溫保存法的缺點?，F(xiàn)有的這些保存液還存在保存時間短，無法在保證其無菌狀態(tài)、生物活性、力學強度的同時很好地維持骨材料生物相容性、表面活性和生物降解性等性能，在實際使用中只能用于短暫保存，難于單獨用于30天以上長期保存。
低溫保存是目前對異體骨、異種骨等骨材料進行較長期保存的通常方法。常用步驟為異體骨干、半關節(jié)骨段和全關節(jié)骨段保存于-80℃深低溫環(huán)境中或凍干后保存于室溫下的無菌真空容器中；異體骨粒和骨板經(jīng)脫鈣或脫蛋白處理后凍干，4℃冰箱冷藏保存。但是，被選用的冷凍骨必須在使用前1小時從深低溫環(huán)境中取出，于45℃格林氏液中快速復溫；凍干骨必須在術前24小時取出，于格林氏液中重新水合。使用未完全復溫的冷凍骨和未完全水合的凍干骨，有可能造成骨移植材料的斷裂；同時，繁瑣的操作容易引起骨移植材料污染，導致骨移植失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是提供一種便宜易得，并能很好地維持骨材料性能的骨材料保存液。
該骨材料保存液由如下配比的組分制備而成成骨細胞培養(yǎng)基10～15g/Lβ-甘油磷酸鈉 8～12mmol/L地塞米松 0.02～0.08mmol/L維生素C 10～100mg/L抗生素，所述抗生素為妥布霉素104～106U/L或四環(huán)素4～12mg/L
溶劑為水。
優(yōu)選的，該骨材料保存液由如下配比的組分制備而成成骨細胞培養(yǎng)基 13～14g/Lβ-甘油磷酸鈉 8～12mmol/L地塞米松0.04～0.06mmol/L維生素C 40～60mg/L抗生素，所述抗生素為妥布霉素5×104～5×105U/L或四環(huán)素6～10mg/L溶劑為水。
進一步優(yōu)選的，該骨材料保存液由如下配比的組分制備而成DMEM 13.37g/Lβ-甘油磷酸鈉 8～12mmol/L地塞米松 0.05mol/L維生素C 50mg/L抗生素，所述抗生素為妥布霉素105U/L或四環(huán)素8mg/L溶劑為水。
或者，該骨材料保存液由如下配比的組分制備而成F-12 Nutrient Mixture培養(yǎng)基 10.6g/L氨基糖甙類抗生素 105U/Lβ-甘油磷酸鈉 8～12mmol/L地塞米松 0.05mol/L維生素C 50mg/L抗生素，所述抗生素為妥布霉素105U/L或四環(huán)素8mg/L溶劑為水。
本發(fā)明所要解決的第二個技術問題是提供一種簡單方便的制備上述骨材料保存液的方法。該方法為先將成骨細胞培養(yǎng)基溶解于水中，再加入抗生素、維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉，攪拌均勻后在無菌條件下過濾分裝。
進一步的，上述骨材料為骨干、半關節(jié)骨段、全關節(jié)骨段、骨粒、骨板或生物衍生骨材料。
本發(fā)明所要解決的第三個技術問題是提供一種用上述骨材料保存液保存骨材料的方法。該方法包括下步驟a、將骨材料于室溫下用10％過氧化氫處理48～72小時，蒸餾水洗凈；b、將經(jīng)步驟a處理后的骨材料在室溫下用氯仿或乙醇處理8小時，蒸餾水洗凈，加工至所需規(guī)格；
c、將經(jīng)步驟b處理后的骨材料冷凍干燥，再行輻照滅菌，然后裝入可密閉的無菌容器，在無菌環(huán)境中向容器中加入權利要求1～6任一項所述骨材料保存液浸泡骨材料，密封后在4℃下保存。
本發(fā)明所要解決的第四個技術問題是提供一種理化性能不明顯降低，長期保存后抗菌性能、細胞相容性、異位成骨和修復骨缺損效果好的骨材料。該骨材料是由上述的方法所保存得到的。
本發(fā)明骨材料保存液是將一些常見的試劑創(chuàng)造性地配合在一起，用于常溫或低溫保存骨材料，使用時一般是將骨材料滅菌后，在無菌環(huán)境中置于裝有本發(fā)明骨材料保存液的容器中，密封后，在4℃下保存，至少可保存3個月至1年。
同時本發(fā)明骨材料保存液可用于保存自體骨，同種異體骨，生物衍生骨等各種用于組織工程領域的骨材料。并且，由本發(fā)明骨材料保存液浸泡保存后得到的骨材料的機械強度和細胞相容性等指標更優(yōu)。
本發(fā)明骨材料保存液所用的成骨細胞培養(yǎng)基起提供細胞生長所需營養(yǎng)物質(zhì)的作用，優(yōu)選為DMEM(Dulbecco minimum essential medium)或(Ham)F-12 Nutrient Mixture培養(yǎng)基。其中(Ham)F-12 Nutrient Mixture培養(yǎng)基單獨使用的優(yōu)選濃度為10.6g/L，也可將DMEM與(Ham)F-12 Nutrient Mixture按重量比1∶1或3∶2混合使用。
抗生素在本發(fā)明中主要起抗菌作用，本發(fā)明中使用的抗生素為妥布霉素(Tobramycin)或四環(huán)素，但顯然本領域技術人員可以選用其他種類的抗生素來解決本發(fā)明所要解決的技術問題。
β-甘油磷酸鈉是骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞分化和體外成骨的必要條件。在本發(fā)明中還可以提供磷元素參與骨質(zhì)的形成，磷元素還與許多代謝中的酶活性有關，在能量代謝中起重要作用；同時還能以磷脂形式參與細胞膜的組成。
地塞米松具有抗炎、抗內(nèi)毒素、免疫抑制、抗休克及增強應激反應等作用。在本發(fā)明中還具有促進成骨細胞增殖和功能表達，促進骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞分化和體外成骨等作用。
維生素C在本發(fā)明中主要起促進成骨細胞增殖，促進骨髓基質(zhì)干細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化和體外成骨等作用。
本發(fā)明中所使用的水一般應為醫(yī)用級的雙蒸水或去離子水。
本發(fā)明所提供的骨材料保存液配方簡單，成本低廉，通過本發(fā)明的骨材料保存液保存的骨材料可保持骨材料的天然孔隙系統(tǒng)和力學性能，增加骨材料抗菌性能，提高材料生物相容性。使用本發(fā)明骨材料保存液保存的骨材料在異位成骨和骨缺損修復實驗中表現(xiàn)出了很好的效果，組織相容性好、成骨速度快，其成骨和修復效果優(yōu)于目前普遍采用的凍干保存骨材料，同時還克服了現(xiàn)有產(chǎn)品使用時處理步驟繁瑣，容易導致移植失敗等缺陷，具有很好的市場前景。


圖1表示掃描電鏡觀察到的本發(fā)明的骨材料(SEM×20)?？梢娖涮烊痪W(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)無破壞，保留了原有的骨小梁、小梁間隙和骨內(nèi)管腔系統(tǒng)。
圖2表示掃描電鏡觀察到的本發(fā)明骨材料與成骨細胞復合培養(yǎng)7天后的生長情況(SEM×500)。可見細胞在材料表面黏附，呈梭形或多角形，相鄰細胞間有突起相互連接，細胞周圍有網(wǎng)狀膠原附著。材料表面黏附大量細胞，并有較多膠原形成。
以下通過具體實施方式
對本發(fā)明作進一步說明，但這并非對本發(fā)明的限制，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種變型或改進，只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實施例一 本發(fā)明骨材料保存液的制備表1 骨材料保存液的制備配方

按表1的配方配置本發(fā)明骨材料保存液A、B、C、D、E。
配置步驟如下1、分別取配方量的能促進成骨細胞生長增殖的培養(yǎng)基于容器中，用純凈水溶解；2、分別取配方量的妥布霉素溶解于其中；3、分別取配方量的維生素C溶解于其中；4、分別取配方量的地塞米松溶解于其中；5、分別取配方量的β-甘油磷酸鈉溶解于其中；6、分別用濾膜孔徑為0.22um的Millipall減壓過濾器過濾滅菌后，密封保存?zhèn)溆谩?br> 實施例二 本發(fā)明骨材料的制備骨材料的制備取新鮮同種異體骨或異種骨(如牛骨、豬骨等)，去除附著的軟組織、軟骨、骨髓，蒸餾水沖洗，于室溫下用10％過氧化氫處理48～72小時，每24小時換液1次，蒸餾水沖洗干凈，室溫下用乙醇處理8小時，蒸餾水沖洗干凈，按所需規(guī)格加工成6×0.5×0.5cm骨材料，-40℃10-5Pa冷凍干燥24小時，25KGyγ射線輻照滅菌，每兩塊材料用雙層醫(yī)用塑料袋密封為1個包裝，在無菌環(huán)境中向在醫(yī)用塑料袋內(nèi)加入本發(fā)明實施例一所制備的骨材料保存液A、B、C、D、E至將材料完全浸泡，熱合密封，在4℃下保存。
試驗例一 本發(fā)明不同配方保存液保存骨材料體外實驗結(jié)果使用本發(fā)明實施例一5種配方配制的骨修復材料保存液保存生物衍生骨材料3個月，與兔成骨細胞復合培養(yǎng)，以同保存時間的凍干保存骨材料為對照組(下同)，比較成骨細胞在材料上的粘附增殖，結(jié)果見表2。
表2不同配方保存液保存骨材料對成骨細胞活力的影響(n＝4，x±s)

*與相同時間凍干保存對照組組間比較，p＜0.05本實驗結(jié)果表明成骨細胞與本發(fā)明骨材料復合培養(yǎng)1天和3天時，各組材料黏附細胞活力無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)，培養(yǎng)5和7天，黏附于保存液保存的骨材料細胞活力大于凍干保存骨材料的細胞的活力(p＜0.05)，說明本發(fā)明骨材料更能促進成骨細胞的黏附和增殖，各配方配制的保存液保存的骨材料組組間無顯著差異。
培養(yǎng)細胞ALP活性的檢測將成骨細胞與本發(fā)明的各配方保存液保存3月的骨材料復合培養(yǎng)7天，以同保存時間的凍干保存骨材料為對照，檢測成骨細胞堿性磷酸酶活性，結(jié)果見表3。
表3本發(fā)明骨材料對成骨細胞ALP的影響(n＝5，x±s)

*與對照組比較，p＜0.05以上實驗表明采用本發(fā)明的骨材料保存液保存的骨材料與凍干保存的骨材料相比，可促進成骨細胞的生長增殖，增強堿性磷酸酶活性，同時各配方組間無顯著差異。
結(jié)果表明本發(fā)明骨材料更能增強復合培養(yǎng)的成骨細胞堿性磷酸酶活性。
試驗例二 本發(fā)明骨材料的理化性能檢測取保存了3個月的用本發(fā)明實施例一制備的骨材料保存液C所保存的骨材料作為實驗組(下同)，以同保存3個月的凍干骨材料為對照組，檢測理化性能。結(jié)果如下材料大體形態(tài)和掃描電鏡觀察結(jié)果保存液保存3個月的骨材料與凍干保存的骨材料大體形態(tài)和掃描電鏡結(jié)果基本相同。保存期內(nèi)，保存液顏色透明、色澤清亮，無沉淀或絮狀物，大小無明顯變化，材料天然網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)無破壞，仍保留有原有的骨小梁、小梁間隙和骨內(nèi)管腔系統(tǒng)(見圖1)，其孔隙率和孔徑大小未見明顯變化(結(jié)果見表4)。
表4保存后材料孔徑大小和孔隙率測定結(jié)果(n＝5，x±s)

組間比較，P＞0.05不同時象點材料的細菌培養(yǎng)取保存2、4、8、16、24、36周的本發(fā)明骨材料作常規(guī)需氧菌和厭氧菌培養(yǎng)，結(jié)果表明均無細菌生長。
材料力學性能檢測取本發(fā)明保存液保存3個月的骨材料(實驗組)和凍干保存的骨材料(對照組)各5根，用Instron萬能測試機(Instron Co.USA)進行扭轉(zhuǎn)實驗測試其最大扭轉(zhuǎn)強度，實驗結(jié)果見表5。
表5保存后材料最大扭轉(zhuǎn)強度測定結(jié)果(n＝5，x±s)

*組間比較，p＜0.05結(jié)果表明本發(fā)明骨材料最大扭轉(zhuǎn)強度明顯高于凍干保存對照組。
試驗例三 采用本發(fā)明骨材料的細胞相容性檢測用常規(guī)方法分離兔成骨細胞，傳代培養(yǎng)至3代備用。
將本發(fā)明的保存液保存的骨材料作為試驗組，凍干保存骨材料為對照組。按2×106個/ml濃度的成骨細胞懸液與材料復合培養(yǎng)。
實驗結(jié)果如下1、倒置相差顯微鏡和組織學觀察結(jié)果成骨細胞與本發(fā)明的骨材料復合培養(yǎng)24小時后，細胞在材料表面和孔隙內(nèi)均可黏附和分布。隨著培養(yǎng)時間延長，細胞進一步生長、分化和增殖。復合培養(yǎng)7天，倒置相差顯微鏡下見細胞與材料緊密黏附，聚集成團，相互連接成網(wǎng)狀。HE染色顯示細胞在材料孔隙內(nèi)生長和增殖，并分泌基質(zhì)。材料孔隙內(nèi)黏附大量成骨細胞，細胞生長和增殖情況良好。
2、掃描電鏡察(SEM×500)結(jié)果可見細胞在材料表面均可黏附，呈梭形或多角形，相鄰細胞間有突起相互連接，細胞周圍有網(wǎng)狀膠原附著(見圖2)。
用MTT法檢測培養(yǎng)細胞的活力方法為常規(guī)方法，實驗結(jié)果見表6。
表6本發(fā)明骨材料對成骨細胞活力的影響(n＝4，x±s)

*與相同時間點凍干保存對照組組間比較，p＜0.05本實驗結(jié)果表明成骨細胞與本發(fā)明骨材料復合培養(yǎng)1天和3天時，各組材料黏附細胞活力無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)，細胞倍增時間為3天，培養(yǎng)5和7天，黏附于保存液保存骨材料細胞活力大于凍干保存骨材料的細胞(p＜0.05)，說明本發(fā)明骨材料更能促進成骨細胞的黏附和增殖。
培養(yǎng)細胞堿性磷酸酶(ALP)活性的檢測將成骨細胞與本發(fā)明骨材料復合培養(yǎng)7天，以凍干保存骨材料為對照，檢測成骨細胞堿性磷酸酶活性，結(jié)果見表7。
表7本發(fā)明骨材料對成骨細胞ALP的影響(n＝5，x±s)

*組間比較，p＜0.01實驗結(jié)果表明本發(fā)明骨材料能增強復合培養(yǎng)的成骨細胞堿性磷酸酶活性。
培養(yǎng)細胞骨鈣素(BGP)活性檢測將成骨細胞與本發(fā)明骨材料復合培養(yǎng)7天，以凍干保存骨材料為對照，檢測成骨細胞BGP活性，結(jié)果見表8。
表8本發(fā)明骨材料對成骨細胞BGP的影響(n＝5，x±s)

*組間比較，p＜0.001結(jié)果表明本發(fā)明骨材料更能增強復合培養(yǎng)的成骨細胞BGP活性。
流式細胞儀檢測成骨細胞與本發(fā)明骨材料在培養(yǎng)板中復合培養(yǎng)7天，以凍干保存骨材料為對照，各組分別取細胞材料復合物4塊，消化細胞收集并計數(shù)，PI染液染色后，用流式細胞儀檢測材料對細胞周期和DNA含量的影響，計算細胞的DNA指數(shù)(DI值)，結(jié)果見表9。
表9本發(fā)明骨材料對成骨細胞周期和倍體水平的影響

組間比較，p＞0.05結(jié)果表明保存液保存的材料對細胞周期無影響，不會導致細胞產(chǎn)生異倍體。
另外，細胞計數(shù)實驗結(jié)果表明(結(jié)果見表10)保存液保存的骨材料可促進細胞黏附生長，效果顯著優(yōu)于凍干對照組。
表10本發(fā)明骨材料與成骨細胞復合培養(yǎng)7天后細胞計數(shù)

*組間比較，p＜0.01試驗例四 本發(fā)明骨材料構(gòu)建組織工程骨異位成骨試驗本實驗是用本發(fā)明骨材料在體外培養(yǎng)構(gòu)建組織工程骨細胞為兔成骨細胞，將2×106個/ml濃度的成骨細胞懸液與本發(fā)明骨材料或凍干保存的骨材料復合，體外培養(yǎng)7天，構(gòu)建組織工程骨。
異位成骨手術按下列步驟進行將新西蘭白兔全身麻醉，常規(guī)消毒頸背部，沿脊柱脊突兩側(cè)各作長約2cm切口，依次切開皮膚和皮下組織，暴露肌組織，分開肌間隙，將組織工程骨植入肌腹內(nèi)，逐層縫合切口，實驗分組為A組(本發(fā)明骨材料構(gòu)建組織工程骨)、C組(凍干保存的骨材料構(gòu)建組織工程骨)兩組。
術后4周和8周處死動物行相關檢查。
大體觀察各組植入物周圍軟組織未見壞死、化膿、積液等現(xiàn)象，可見組織植入物有大量纖維組織和血管等軟組織包裹和長入。
BrdU標記細胞檢測1、免疫組化檢測結(jié)果采用免疫組化染色方法檢測術后4周植入物細胞，實驗組和對照組的各組植入物邊沿均可檢測到BrdU標記呈陽性的成骨細胞，成骨細胞為陽性反應，陽性物質(zhì)為棕黃色細顆粒，分布于成骨細胞內(nèi)，以PBS代替一抗的陰性對照中細胞內(nèi)和細胞外基質(zhì)未見陽性信號，表明組織工程骨的種子細胞在宿主體內(nèi)存活、生長、增殖和分化，并行使細胞功能。
2、組織學觀察結(jié)果術后4周A組標本可見有軟骨帶形成，其中有少量鈣化的骨組織，周圍可見梭形的間充質(zhì)細胞向軟骨細胞分化；C組標本可見有多個散在的軟骨細胞團塊，周圍也可見向軟骨細胞分化的間充質(zhì)細胞。
術后8周A組標本可見有編織骨形成，并可見髓腔形成，其內(nèi)見有島狀骨小梁，周邊仍可見軟骨細胞，C組標本見有片塊狀或條索狀新骨形成，邊緣仍可見軟骨組織。隨植入時間延長，各組材料逐漸被降解吸收，且新骨或軟骨形成增多，并有血管、纖維組織、脂肪、肌肉組織長入材料間隙內(nèi)。
異位成骨定量分析按表11標準對保存3月實驗組和3月對照組HE組織學切片進行組織學評分，定量比較實驗組與對照組異位成骨的結(jié)果，結(jié)果見表12。
表11植入物組織塊組織學評分標

表12異位成骨定量分析

*與凍干保存對照組組間比較，p＜0.01上述實驗結(jié)果表明采用本發(fā)明的骨材料和凍干保存的骨材料構(gòu)建組織工程骨，種子細胞均可在材料存活、生長和分化；均可異位成骨，成骨定量分析表明本發(fā)明的骨材料構(gòu)建的組織工程骨成骨優(yōu)于凍干保存的骨材料構(gòu)建的組織工程骨，本發(fā)明的骨材料保存液有促進異位成骨的作用。
試驗例五 采用本發(fā)明的保存液保存的骨材料修復兔橈骨節(jié)段性骨缺損將新西蘭大白兔全身麻醉，常規(guī)消毒雙前肢，沿前肢前外側(cè)做縱行切口，長25mm，逐層切開、分離、顯露橈骨，于橈骨中上1/3交界處截骨，去除橈骨和骨膜，制造15mm長的雙側(cè)橈骨節(jié)段性骨缺損模型。用本發(fā)明的保存液保存的骨材料和凍干保存的骨材料以及分別構(gòu)建的組織工程骨修復骨缺損，實驗分組如下A-1組(本發(fā)明的保存液保存的骨材料)、C-1組(凍干骨材料)、A-2(由本發(fā)明的保存液保存的骨材料構(gòu)建的組織工程骨)、C-2組(由凍干骨材料構(gòu)建的組織工程骨)。實驗結(jié)果如下大體標本觀察結(jié)果各組動物術后前肢均有不同程度腫脹，1周后癥狀消失，術后4周，各組植入物與宿主骨界線不清，結(jié)合牢固，推之不動，有骨痂向材料中央延伸。術后8周，各組植入物與宿主骨牢固融合，材料表面有堅硬外骨痂形成，骨痂開始塑形。術后16周，各組植入物材料被骨痂完全包圍，移植材料與宿主骨界線消失。
術后各時期，移植材料周圍軟組織未見變性、壞死和囊性變。
X線檢查結(jié)果A-1及C-1組術后4周，截骨端有新骨形成，移植材料紋理模糊；術后8周，大量新骨形成，移植材料邊界不清，部分髓腔再通；A-2及C-2組術后4周，截骨端有骨痂形成，移植材料紋理清晰；術后8周，大量新生骨向材料中心生長，移植材料邊界不清；X線評分結(jié)果評分結(jié)果見表13表13移植材料修復骨缺損放射學評分(n＝6，x±s)

與C-2組比較，**p＜0.05，*p＜0.001A-1組術后各時期評分均高于C-2組(P＜0.001)，A-2組術后8周評分高于C-2組(P＜0.001)，C-1組術后4和8周評分高于C-2組(P＜0.05)。
組織學觀察結(jié)果A-1組術后4周，移植物周圍和材料內(nèi)部出現(xiàn)軟骨細胞和成骨細胞，呈島狀生長的新生骨組織貫穿整個移植物；移植材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)軟骨細胞和成骨細胞，呈島狀生長的新生骨組織貫穿整個移植材料。
術后8周，新生骨小梁周圍可見大量成骨細胞和破骨細胞，編織骨向板層骨過渡，移植物逐漸被新生骨取代，骨髓腔出現(xiàn)；術后16周，移植物完全被新生骨取代，骨小梁排列整齊，皮質(zhì)骨形成，骨髓腔再通。
A-2組術后4周，移植物周圍有軟骨細胞和成骨細胞形成，新生骨橋了解移植材料和宿主骨；移植材料周圍有軟骨細胞和成骨細胞形成，新生骨橋接移植材料和宿主骨。
術后8周，骨小梁周圍出現(xiàn)大量成骨細胞和破骨細胞，移植材料內(nèi)部出現(xiàn)交錯排列的編織骨，骨髓腔出現(xiàn)；術后16周，新生骨逐漸改建為板層骨，但尚不完善，骨缺損大部分被修復，仍存留少量移植材料。
C-1組術后4周，移植材料周圍和材料內(nèi)部出現(xiàn)軟骨細胞和成骨細胞，新生骨組織貫穿整個移植材料物；術后8周，新生骨小梁周圍可見大量成骨細胞和破骨細胞，移植材料逐漸被新生骨取代，骨髓腔出現(xiàn)；術后16周，移植材料被新生骨取代，骨小梁排列整齊，皮質(zhì)骨形成，骨髓腔再通。
C-2組術后4周，移植材料周圍有軟骨細胞和成骨細胞形成，材料周圍形成大量新生骨，新生骨呈明顯的梯度生長，靠近界面端成骨細胞活躍，遠離界面的部位成骨細胞較少；術后8周，移植材料周圍和內(nèi)部成骨細胞和破骨細胞聚集，材料內(nèi)部出現(xiàn)交錯排列的編織骨，新生骨逐漸取代移植材料；術后16周，移植材料被新生骨取代，骨髓腔出現(xiàn)。
I型膠原免疫組化檢測
I型膠原免疫組化觀察(免疫組化×200)并檢測灰度值(結(jié)果見表14)A-1組術后2周，I型膠原在移植材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)的成纖維細胞和成骨細胞中高表達，呈陽性反應的新生骨組織貫穿整個移植材料；A-2組術后2周，I型膠原在移植材料周圍形成的成纖維細胞和成骨細胞中表達，橋接移植材料和宿主骨的新生骨呈陽性反應。
C-1組術后2周，I型膠原在移植材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)的成纖維細胞和成骨細胞中表達，呈陽性反應的新生骨組織貫穿移植材料；C-2組術后2周，I型膠原在移植材料周圍形成的成纖維細胞和成骨細胞中表達，材料周圍形成大量新生骨呈陽性反應。
術后2周，A-1、A-2組I型膠原灰度值明顯高于C-2組(p＜0.001)，C-1組I型膠原灰度值高于C-2組(p＜0.05)。
表14骨材料修復骨缺損I型膠原免疫組化結(jié)果分析(n＝6，x±s)

與C-2組間比較，**p＜0.001，*p＜0.05BMP-2免疫組化檢測結(jié)果BMP-2免疫組化觀察(免疫組化×200)并檢測BMP-2灰度值(結(jié)果見表15)A-1組術后2周新生軟骨及骨痂內(nèi)呈陽性反應，陽性物質(zhì)為棕黃色顆粒，分布于間充質(zhì)細胞、成軟骨細胞和成骨細胞內(nèi)，BMP-2在材料周圍和內(nèi)部出現(xiàn)的成軟骨細胞和成骨細胞中高表達，呈陽性反應的新生骨組織貫穿材料；A-2組術后2周，BMP-2在材料周圍的成軟骨細胞和成骨細胞中表達，橋接移植材料和宿主骨的新生骨呈陽性反應。
C-1組術后2周，BMP-2在材料周圍和內(nèi)部的成軟骨細胞和成骨細胞中表達，陽性反應的新生骨組織貫穿移植材料；C-2組術后2周，BMP-2在材料周圍的成軟骨細胞和成骨細胞中表達，材料周圍形成大量新生骨呈陽性反應，靠近界面端呈陽性反應的成骨細胞較多，遠離界面部位較少。
BMP-2免疫組化結(jié)果分析術后2周，A-1組BMP-2灰度值明顯高于C-2組(p＜0.001)，C-1組術后2周BMP-2灰度值高于C-2組(p＜0.05)。
表15骨材料修復骨缺損BMP-2膠原免疫組化結(jié)果分析(n＝6，x±s)

與C-2組間比較，**p＜0.001，*p＜0.05生物力學測定結(jié)果實驗結(jié)果見表16。
表16骨材料修復骨缺損生物力學結(jié)果分析(n＝5，x±s)

與正常尺橈骨比較，*p＞0.05
A-1組和A-2組術后16周尺橈骨力學強度明顯高于C-2組(p＜0.001)，A-1組術后16周橈骨力學強度接近正常尺橈骨(p＞0.05)。
實驗結(jié)果表明采用本發(fā)明的骨材料構(gòu)建的組織工程骨(A-1)、凍干保存的骨材料構(gòu)建組織工程骨(C-1)、本發(fā)明的骨材料(A-2)、凍干保存的骨材料(C-2)修復兔橈骨節(jié)段性缺損，放射學及組織學評估，各組成骨能力為A-1＞C-1＞A-2＞C-2；本發(fā)明的骨材料保存液有促進成骨、加快骨缺損修復的作用。
上述實驗結(jié)果表明本發(fā)明骨材料保存液配方簡單，成本低廉，能有效的延長骨材料保存時間，保持骨材料的天然孔隙系統(tǒng)，增加抗菌性能，增強材料細胞相容性和機械強度。采用本發(fā)明的骨修復材料保存液保存的骨材料在異位成骨和骨缺損修復實驗中均有更好的成骨和修復效果，其多方面性能優(yōu)于目前普遍采用的凍干保存骨材料，同時克服了現(xiàn)有凍干骨修復材料使用時處理步驟繁瑣，容易導致移植失敗等缺陷，具有很好的市場前景。
顯然，上述實例只是對本發(fā)明作進一步說明，而并非對本發(fā)明進行限制，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想和本發(fā)明說明書公開的內(nèi)容，可以做出各種變型或改進。比如，改用其他具體種類的成骨細胞培養(yǎng)基或其他具體種類的氨基糖甙類抗生素或四環(huán)素類抗生素，如未脫離本發(fā)明的基本思想，則均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種骨材料保存液，其特征在于由如下配比的組分制備而成成骨細胞培養(yǎng)基 10～15g/Lβ-甘油磷酸鈉8～12mmol/L地塞米松 0.02～0.08mmol/L維生素C 10～100mg/L抗生素，所述抗生素為妥布霉素104～106U/L或四環(huán)素4～12mg/L溶劑為水。
2.根據(jù)權利要求1所述的骨材料保存液，其特征在于由如下配比的組分制備而成成骨細胞培養(yǎng)基 13～14g/Lβ-甘油磷酸鈉8～12mmol/L地塞米松 0.04～0.06mmol/L維生素C 40～60mg/L抗生素，所述抗生素為妥布霉素5×104～5×105U/L或四環(huán)素6～10mg/L溶劑為水。
3.根據(jù)權利要求2所述的骨材料保存液，其特征在于由如下配比的組分制備而成DMEM 13.37g/Lβ-甘油磷酸鈉8～12mmol/L地塞米松 0.05mol/L維生素C 50mg/L抗生素，所述抗生素為妥布霉素105U/L或四環(huán)素8mg/L溶劑為水。
4.根據(jù)權利要求2所述的骨材料保存液，其特征在于由如下配比的組分制備而成F-12 Nutrient Mixture培養(yǎng)基10.6g/L氨基糖甙類抗生素 105U/Lβ-甘油磷酸鈉 8～12mmol/L地塞米松 0.05mol/L維生素C50mg/L抗生素，所述抗生素為妥布霉素105U/L或四環(huán)素8mg/L溶劑為水。
5.根據(jù)權利要求1所述的骨材料保存液，其特征在于，所述的骨材料為骨干、半關節(jié)骨段、全關節(jié)骨段、骨粒、骨板或生物衍生骨材料。
6.一種制備權利要求1所述的骨材料保存液的方法，其特征在于先將成骨細胞培養(yǎng)基溶解于水中，再加入抗生素、維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉，攪拌均勻后在無菌條件下過濾分裝。
7.一種保存骨材料的方法，其特征在于包括下步驟a、將骨材料于室溫下用10％過氧化氫處理48～72小時，蒸餾水洗凈；b、將經(jīng)步驟a處理后的骨材料在室溫下用氯仿或乙醇處理8小時，蒸餾水洗凈，加工至所需規(guī)格；c、將經(jīng)步驟b處理后的骨材料冷凍干燥，再行輻照滅菌，然后裝入可密閉的無菌容器，在無菌環(huán)境中向容器中加入權利要求1～6任一項所述骨材料保存液浸泡骨材料，密封后在4℃下保存。
8.一種由權利要求7所述的保存骨材料的方法所保存得到的骨材料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種骨材料保存液及其制備方法和用途。本發(fā)明骨材料保存液配方為10～15g/L成骨細胞培養(yǎng)基，8～12mmol/Lβ－甘油磷酸鈉，0.02～0.08mmol/L地塞米松，10～100mg/L維生素C，妥布霉素10
文檔編號A01N1/00GK101019528SQ20061002236
公開日2007年8月22日 申請日期2006年11月29日 優(yōu)先權日2006年11月29日
發(fā)明者羅靜聰, 楊志明 申請人:四川大學華西醫(yī)院