專利名稱：一種田螺纖維素酶及其酶解發(fā)酵燃料乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于纖維素酶的應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說是涉及一種田螺纖維素酶，及其用于酶解發(fā)酵燃料乙醇的方法。
背景技術(shù)：
美國《工業(yè)酶學(xué)》認(rèn)為“如果乙醇工業(yè)要生存，就必須利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)”。如文獻(xiàn)1Philippidis GP，Smith TK，Wyman CE，Study of the enzymatic hydrolysis ofcellulose for production of fuel ethanol by the simultaneous saccharification andfermentation process(纖維素同步糖化發(fā)酵燃料乙醇的酶水解研究).Biotechnol.Bioeng(生物技術(shù)與生物工程)，1993，41846-853中所述，目前纖維素發(fā)酵酒精技術(shù)中比較流行的是纖維素同步糖化發(fā)酵分離的方法，這種方法解決了纖維素分步酶解的反饋抑制問題。但是這種方法所用的纖維素酶大多來源于微生物纖維素酶，其酶活最適的溫度是50℃左右。而在纖維素同步糖化發(fā)酵分離的方法中，發(fā)酵乙醇用的釀酒酵母菌的最適發(fā)酵溫度為35～38℃。這樣，二者之間存在一定溫差，很難同時(shí)充分發(fā)揮纖維素酶和釀酒酵母菌的作用。若要解決這個(gè)問題，可以采用增加纖維素酶用酶量的方法，如此一來，使纖維素酶費(fèi)用增加。或是采取選育耐高溫酵母菌的方法來解決此問題，也不能很好地協(xié)調(diào)酶解和發(fā)酵最適作用條件的問題。還有采用補(bǔ)充底物、酵母菌或纖維素酶的方法來解決此問題，雖然對發(fā)酵醪中的乙醇度有所提高，但轉(zhuǎn)化率仍然偏低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的纖維素酶的酶活最適溫度高于釀酒酵母菌的發(fā)酵溫度的缺陷，從而提供一種最佳酶解溫度為37℃，與釀酒酵母菌發(fā)酵溫度相一致的田螺纖維素酶。
本發(fā)明的另一目的在于克服現(xiàn)有的纖維素同步糖化發(fā)酵分離的方法中不能很好地協(xié)調(diào)酶解和發(fā)酵最適作用條件的缺陷，從而采用本發(fā)明提供的田螺纖維素酶，來酶解發(fā)酵燃料乙醇的方法。
本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供一種田螺纖維素酶，其為通過如下步驟得到的1)將田螺去除外殼，將其軟體組織剪成4～6個(gè)碎片；2)加入軟體組織重量8～10倍的10mM的pH7.0的磷酸緩沖液，于低溫(4～8℃)下攪拌浸泡抽提一個(gè)小時(shí)，然后以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10～20分鐘，回收離心液體；3)將離心液體用常規(guī)超濾方法濃縮去水30％，得到的濃縮液中再加入濃縮液重量60～80％的硫酸銨，攪拌均勻，靜止10～20分鐘后，過濾，得到固體的田螺纖維素酶。
所述的田螺優(yōu)選中華園田螺等中國分布的大型螺類，可以收集或規(guī)?；B(yǎng)殖。
所述步驟2)中濾出的軟體組織殘?jiān)蛇M(jìn)一步加工成食品或加工成蛋白飼料。
本發(fā)明提供一種使用上述田螺纖維素酶進(jìn)行酶解發(fā)酵燃料乙醇的方法，包括如下步驟1)將纖維素原料裝入同步酶解發(fā)酵反應(yīng)器中，通入0.1Mpa的高壓蒸汽滅菌30min，然后冷卻到50℃；在無菌操作條件下，按照10～20U纖維素酶酶活/g纖維素原料的比例加入本發(fā)明的固體的田螺纖維素酶；所述的纖維素原料為紙漿，或是在1.5Mpa條件下保壓預(yù)處理10min后的秸稈或木材等；2)在無菌條件下，向同步酶解發(fā)酵反應(yīng)器中接種該反應(yīng)器容積10％(V/V)的釀酒酵母液體種子液體，在35～38℃下發(fā)酵3～5天；3)發(fā)酵結(jié)束后，按常規(guī)方法蒸餾和精餾，制得99.8wt％的燃料乙醇。
盡管纖維素酶是1906年Seilliere在蝸牛的消化液中發(fā)現(xiàn)的，但是過去的觀點(diǎn)都認(rèn)為，一些無脊椎動(dòng)物以及高等的食草動(dòng)物是通過體內(nèi)共生的原生動(dòng)物和細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶來消化纖維素。隨著對無脊椎動(dòng)物體內(nèi)纖維素酶的研究的深入，這種共生消化理論受到挑戰(zhàn)，人們開始對動(dòng)物體內(nèi)的纖維素酶有新的認(rèn)識。
本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了田螺具有纖維素酶活，并利用一簡單的方法從田螺中提取分離得到田螺纖維素酶，與現(xiàn)有的用于纖維素酶解同步糖化發(fā)酵中的纖維素酶相比，其最佳酶解溫度為37℃，與釀酒酵母菌發(fā)酵溫度相一致，可有效解決微生物纖維素酶解溫度和酵母菌發(fā)酵溫度不協(xié)調(diào)的問題，也為動(dòng)物纖維素酶的應(yīng)用開辟了一條新途徑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)還在于(1)由于田螺是我國一種分布廣、適應(yīng)性、人們喜食的大型螺類，發(fā)現(xiàn)了田螺具有纖維素酶活，增加了廉價(jià)田螺的應(yīng)用新途徑；(2)建立了針對田螺纖維素酶提取分離工藝方法，田螺的纖維素酶比活力較高，降低了纖維素酶制劑的成本；(3)由于田螺纖維素酶最佳酶解溫度為37℃，與釀酒酵母菌發(fā)酵溫度相一致，田螺纖維素酶制劑較好地應(yīng)用于纖維素酶解同步糖化發(fā)酵中，可有效解決微生物纖維素酶解溫度不協(xié)調(diào)問題。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、制備田螺纖維素酶收集池塘中的田螺，用水洗干凈后，將田螺外殼去除，然后將每個(gè)田螺的軟體組織剪成4個(gè)碎片，加入軟體組織重量8倍的10mM的pH 7.0的磷酸緩沖液，于4℃低溫下攪拌浸泡抽提一個(gè)小時(shí)，再以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，回收離心液體，濾出的軟體組織殘?jiān)蛇M(jìn)一步加工成食品或加工成蛋白飼料。將離心液體用常規(guī)超濾方法濃縮去水30％左右，得到的濃縮液中再加入濃縮液重量70％的硫酸銨，攪拌均勻，靜止20分鐘后，過濾，得到固體的田螺纖維素酶。
實(shí)施例2、制備田螺纖維素酶收集規(guī)?；B(yǎng)殖的中華園田螺，用水洗干凈后，將田螺外殼去除，然后將每個(gè)田螺的軟體組織剪成5個(gè)碎片，加入軟體組織重量9倍的10mM的pH7.0的磷酸緩沖液，于8℃低溫下攪拌浸泡抽提一個(gè)小時(shí)，再以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，回收離心液體，濾出的軟體組織殘?jiān)蛇M(jìn)一步加工成食品或加工成蛋白飼料。將離心液體用常規(guī)超濾方法濃縮去水30％，得到的濃縮液中再加入濃縮液重量60％的硫酸銨，攪拌均勻，靜止15分鐘后，過濾，得到固體的田螺纖維素酶。
實(shí)施例3、制備田螺纖維素酶收集稻田中的田螺，用水洗干凈后，將田螺外殼去除，然后將每個(gè)田螺的軟體組織剪成6個(gè)碎片，加入軟體組織重量10倍的10mM的pH 7.0的磷酸緩沖液，于6℃低溫下攪拌浸泡抽提一個(gè)小時(shí)，再以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，回收離心液體，濾出的軟體組織殘?jiān)蛇M(jìn)一步加工成食品或加工成蛋白飼料。將離心液體用常規(guī)超濾方法濃縮去水30％，得到的濃縮液中再加入濃縮液重量80％的硫酸銨，攪拌均勻，靜止10分鐘后，過濾，得到固體的田螺纖維素酶。
實(shí)施例4、使用本發(fā)明的田螺纖維素酶進(jìn)行酶解發(fā)酵燃料乙醇將紙漿裝入同步酶解發(fā)酵反應(yīng)器中，通入0.1Mpa的高壓蒸汽滅菌30min，然后冷卻到50℃；在無菌操作條件下，按照10U纖維素酶酶活/g紙漿的比例加入本發(fā)明實(shí)施例1制備的田螺纖維素酶；然后在無菌條件下，向同步酶解發(fā)酵反應(yīng)器中接種該反應(yīng)器容積10％(V/V)的釀酒酵母液體種子液體，在37℃下發(fā)酵4天；發(fā)酵結(jié)束后，按常規(guī)方法蒸餾和精餾，制得99.8wt％的燃料乙醇。
實(shí)施例5、使用本發(fā)明的田螺纖維素酶進(jìn)行酶解發(fā)酵燃料乙醇將在1.5Mpa條件下保壓預(yù)處理了10min的秸稈裝入同步酶解發(fā)酵反應(yīng)器中，通入0.1Mpa的高壓蒸汽滅菌30min，然后冷卻到50℃；在無菌操作條件下，按照15U纖維素酶酶活/g秸稈的比例加入本發(fā)明實(shí)施例2制備的田螺纖維素酶；然后在無菌條件下，向同步酶解發(fā)酵反應(yīng)器中接種該反應(yīng)器容積10％(V/V)的釀酒酵母液體種子液體，在35℃下發(fā)酵3天；發(fā)酵結(jié)束后，按常規(guī)方法蒸餾和精餾，制得99.8wt％的燃料乙醇。
實(shí)施例6、使用本發(fā)明的田螺纖維素酶進(jìn)行酶解發(fā)酵燃料乙醇將在1.5Mpa條件下保壓預(yù)處理了10min的木材裝入同步酶解發(fā)酵反應(yīng)器中，通入0.1Mpa的高壓蒸汽滅菌30min，然后冷卻到50℃；在無菌操作條件下，按照20U纖維素酶酶活/g木材的比例加入本發(fā)明實(shí)施例3制備的田螺纖維素酶；然后在無菌條件下，向同步酶解發(fā)酵反應(yīng)器中接種該反應(yīng)器容積10％(V/V)的釀酒酵母液體種子液體，在38℃下發(fā)酵5天；發(fā)酵結(jié)束后，按常規(guī)方法蒸餾和精餾，制得99.8wt％的燃料乙醇。
權(quán)利要求
1.一種田螺纖維素酶，其為通過如下步驟得到的1)將田螺去除外殼，將其軟體組織剪成4～6個(gè)碎片；2)加入軟體組織重量8～10倍的10mM的pH 7.0的磷酸緩沖液，于低溫下攪拌浸泡抽提一個(gè)小時(shí)，然后以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10～20分鐘，回收離心液體；3)將離心液體用常規(guī)超濾方法濃縮去水30％，得到的濃縮液中再加入濃縮液重量60～80％的硫酸銨，攪拌均勻，靜止10～20分鐘后，過濾，得到固體的田螺纖維素酶。
2.如權(quán)利要求1所述的田螺纖維素酶，其特征在于所述的田螺為收集或規(guī)模化養(yǎng)殖。
3.如權(quán)利要求1或2所述的田螺纖維素酶，其特征在于所述的田螺為中華園田螺。
4.如權(quán)利要求1所述的田螺纖維素酶，其特征在于所述步驟2)的低溫為4～8℃。
5.如權(quán)利要求1所述的田螺纖維素酶，其特征在于所述步驟2)中濾出的軟體組織殘?jiān)蛇M(jìn)一步加工成食品或加工成蛋白飼料。
6.一種使用田螺纖維素酶進(jìn)行酶解發(fā)酵燃料乙醇的方法，包括如下步驟1)將纖維素原料裝入同步酶解發(fā)酵反應(yīng)器中，通入0.1Mpa的高壓蒸汽滅菌30min，然后冷卻到50℃；在無菌操作條件下，按照10～20U纖維素酶酶活/g纖維素原料的比例加入權(quán)利要求1所述的田螺纖維素酶；2)在無菌條件下，向同步酶解發(fā)酵反應(yīng)器中接種該反應(yīng)器容積10％(V/V)的釀酒酵母液體種子液體，在35～38℃下發(fā)酵3～5天；3)發(fā)酵結(jié)束后，按常規(guī)方法蒸餾和精餾，制得99.8wt％的燃料乙醇。
7.如權(quán)利要求6所述的使用田螺纖維素酶進(jìn)行酶解發(fā)酵燃料乙醇的方法，其特征在于所述的纖維素原料為紙漿。
8.如權(quán)利要求6所述的使用田螺纖維素酶進(jìn)行酶解發(fā)酵燃料乙醇的方法，其特征在于所述的纖維素原料為在1.5Mpa條件下保壓預(yù)處理10min后的秸稈。
9.如權(quán)利要求6所述的使用田螺纖維素酶進(jìn)行酶解發(fā)酵燃料乙醇的方法，其特征在于所述的纖維素原料為在1.5Mpa條件下保壓預(yù)處理10min后的木材。
全文摘要
本發(fā)明屬于纖維素酶的應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明提供的田螺纖維素酶，是將田螺去除外殼，將其軟體組織剪成4～6個(gè)碎片；然后加入磷酸緩沖液，于低溫下浸泡抽提后離心回收離心液體；濃縮去水后加入硫酸銨，過濾得到的固體。使用該田螺纖維素酶進(jìn)行酶解發(fā)酵燃料乙醇，可以制得99.8wt％的燃料乙醇。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了田螺具有纖維素酶活，并利用一簡單的方法從田螺中提取分離得到田螺纖維素酶，與現(xiàn)有的用于纖維素酶解同步糖化發(fā)酵中的纖維素酶相比，其最佳酶解溫度為37℃，與釀酒酵母菌發(fā)酵溫度相一致，可有效解決微生物纖維素酶解溫度和酵母菌發(fā)酵溫度不協(xié)調(diào)的問題，也為動(dòng)物纖維素酶的應(yīng)用開辟了一條新途徑。
文檔編號A23K1/10GK1966677SQ20051012363
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月18日
發(fā)明者陳璇, 馬麗霞 申請人:北京市第101中學(xué)