專利名稱：：水稻矮稈基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種水稻基因，尤其是涉及一種通過T-DNA插入突變的方法獲得的水稻矮稈(OryzasativaDwarf，簡寫為osDw)基因。
背景技術(shù)：
：隨著水稻基因組測序計劃的完成以及飽和物理圖譜的建立(FengQ，ZhangY，HaoP，etal.Sequenceandanalysisofricechomosome4.Nature.200221；420(6913)316-320)，其功能基因組的研究目前已成為熱點之一。有關(guān)功能基因的克隆有諸多方法，其中插入標(biāo)簽法是克隆植物功能基因的有效方法之一，如果T-DNA插入到調(diào)控植物生長發(fā)育的功能基因中，就可能引起功能基因的失活，從而產(chǎn)生生理或者表型突變。利用T-DNA插入突變體中的T-DNA標(biāo)簽，采用PCR或者質(zhì)粒拯救法克隆T-DNA的旁鄰序列后，就可以此序列為探針，從基因組或cDNA文庫中克隆基因全長，并進行核酸和蛋白序列的分析和功能預(yù)測，然后鑒定該基因在水稻的生長發(fā)育中的功能。關(guān)于利用標(biāo)簽法克隆植物功能基因的研究，目前國際上已有實驗室建立了模式植物擬南芥的插入飽和突變體庫，并且利用突變體庫克隆了數(shù)十個調(diào)控生長、發(fā)育以及抗性的基因(AlonsoJM，StepanovaAN，LeisseTJ，etal.GenomewideinsertionalmutagenesisofArabidopsisthaliana.Science.2003.301653-657；LiuPP，KoizukaN，HomrichhausenTM，etal.Large-scalescreeningofArabidopsisenhancer-traplinesforseedgermination-associatedgenes.PlantJ.2005；41(6)936-44)。有關(guān)利用標(biāo)簽法克隆水稻功能基因的研究，荷蘭國際植物研究公司、韓國Pohang科技大學(xué)和日本農(nóng)業(yè)資源研究所以及我國科學(xué)院、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位已開展了有關(guān)此方面的研究，已獲得大量的插入突變體(AnS，ParkS，JeongDH，LeeDY，etal.GenerationandanalysisofendsequencedatabaseforT-DNAtagginglinesinrice.PlantPhysiol.2003；133(4)2040-2047；HieiY，OhtaS，KomariT，etal.Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNAPlantJ.19946(2)271-282；WuC，LiX，YuanW，etalDevelopmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenomePlantJ.2003；35(3)418-427)。但是，現(xiàn)階段有關(guān)利用插入突變法克隆基因的研究報道不多。目前驗證和鑒定基因功能主要通過功能互補實驗和基因敲除的方法，其中利用RNAi技術(shù)是進行功能基因鑒定最行之有效的方法之一，其主要優(yōu)點有1、RNAi在確定基因的功能時具有靶向性，在一個沉默載體中插入部分基因序列就可以確定某一基因的功能，不需要消耗大量的勞動力進行群體篩選工作。2、RNAi能用來選擇性地沉默某一基因家族中的單個基因或者沉默一個家族中的許多基因。3、RNAi能夠用來確定胚胎致死基因的功能。RNAi是由dsRNA介導(dǎo)的特異性基因沉默現(xiàn)象，是1988年首次在植物和線蟲中(C.elegans)報道(FraserAG，KamathRS，ZipperlenPetal.FunctionalgenomicanalysisofC.eleganschromosomeIbysystematicRNAinterference.Nature.2000408325-330；GonczyP，EcheverriC，OegemaK，etal.FunctionalgenomicanalysisofcelldivisioninC.elegansusingRNAiofgenesonchromosomeIII.Nature.2000408331-336)。其大致過程為外源或者內(nèi)源轉(zhuǎn)錄生成的dsRNA被一種RNaseIII類的核酸酶Dieer切割成21～25nt的干擾性的小RNA，siRNA進一步與其他多種蛋白成分結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，介導(dǎo)siRNA反義鏈與靶mRNA分子互補結(jié)合并引起同源性靶mRNA分子的切割效應(yīng)。發(fā)夾RNAi構(gòu)件是被認(rèn)為是達到持續(xù)高水平沉默效率最好的構(gòu)件，在RNAi載體中，一個內(nèi)含子位于正義和反義編碼序列之間，然后在轉(zhuǎn)錄加工時拼接而產(chǎn)生dsRNA。有研究發(fā)現(xiàn)，含內(nèi)含子的發(fā)夾RNA比不含內(nèi)含子的發(fā)夾RNA介導(dǎo)的基因沉默更有效果(LawrenceRJ，PikaardCS.Transgene-inducedRNAinterferenceastrategyforovercominggeneredundancyinpolyploidstogenerateloss-of-functionmutations.PlantJ.2003；36(1)114-121；WesleySV，HelliwellCA，SmithNA，etal.Constructdesignforefficient，effectiveandhigh-thoughputgenesilencinginplants.PlantJ.2001；27(6)581-590)。目前利用RNAi技術(shù)，已研究了GAMyb，SLN1，PKABA1等基因在GA誘導(dǎo)的大麥糊粉層a-淀粉酶中的作用(ZentellaR，YamauchiD，HoTH.Moleculardissectionofthegibberellin/abscisicacidsignalingpathwaysbytransientlyexpressedRNAinterferenceinbarleyaleuronecells.PlantCell.2002；14(9)2289-2301)；鑒定AGAMOUS(AG)，CLAVATA3，APETALA1和PERIANTHIA基因在擬南芥花器官發(fā)育中的作用(ChuangCF，MeyerowitzEM.Specificandheritablegeneticinterferencebydouble-strandedRNAinArabidopsisthaliana.ProcNatlAcadSciUSA.200025；97(9)4985-4990)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種通過T-DNA插入突變的方法獲得的osDw基因及其克隆方法。本發(fā)明的另一目的在于提供osDw基因RNAi表達載體與構(gòu)建方法。本發(fā)明的另一目的在于osDw基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法及其osDw基因在水稻遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。本發(fā)明所說的osDw基因序列(包含內(nèi)含子)為acataagctagctccccatactctcacaccccatgtcttctggaggaggaggaggaggag60gaggagatcgccatggcccctaccaccagcacgggcacctcggccgcggcgaaggcgctg120attacgtgtacagcagcagcgacatggagagcttcttcttcagccaacccgggggcgtcg180gcatcggcgggggtggtggtggcgtcgtcggcgccggcggtgccgacgagatcatgccgt240actccagcatcacggactacctgcaggggttattggacccctccgggctagctcggcacc300tcgacgtggcgtgcccgtcgtctcaggacacggtggtcaagcaggagctgtcggtggatg360tgacgagccacgacagccagggcaccggcggcgtcgccggagaaggcgtcgcgcaggcca420cgccgaactcgtcggcgtccttctcgtccagcgacggagaggcggagggcggcaaatcgt480cacgccggtgcaagaagggtcaggcgaaggcggaggaggaggacgacaaggatgaggagg540atggagagaactccaagaaaccgtatgttaaatttccattgattctactctatactttgt600ctgattcttgtcttgatttcttgcttgattaattcttttttgatgcgtgtcttgagatgg660ggatactttcttggggctagatctggttggtcatactgttgcggagttgcaaaatttgac720ctgaaattttctttcgtttatgctttctctctactgcatgcatggtgtgaacattagggt780ttgctagaattttggttccttagggttctttttagtagatccgtctatcctcttgttccc840cttttcttctgattccgttttgacccaatttccaatatgatctttcagacgatggggcta900ctactattcgatttaatttaatagacaaccaacctatgctccataatagatcttgcgtag960aatgaatcaattttacgagttatagcttcaatttttgacttgctaggtctttgaagatta1020tattatgatttccccttttagaaatgattcaaattaagatatattttcgtatcaccacca1080accacctaaatctacaatagttcctcagtacttttgcaaaattaacgctgatcttgcccc1140ataacatgcaatccaacagatatctagctagctagctaacttattagaccctaattaata1200ctatatatcaaaataacaactatttctagcaaaacctggtgctaatctaacatgaaatag1260ctagctattcccatagtccaccatgatcctacctatctagcaagctagttagctagtttg1320attgttggtgctctgaaaaagcccaaactaattaataattaggcctgattgagcttgtca1380ccgcagaaatatcaactgatcttctgaatccatatcatctctctgtttctagctaatcca1440cctgaccttatttttgatattttgtaccatgcatctacacaggaacaagcccaagaagaa1500agctgagaagaggcagcggcagcctcgcgtggcgttcctcaccaagagcgaggttgatca1560cctcgaggacggctaccggtggcgcaagtacggccagaaggcagtcaagaacagcccata1620cccgaggtacacatctatatacatgtacaaaccttaatttcacccagttgttgtagcaca1680tacatatatcgtagtataccatgttactgtgccatacaattgcatggcacgatggtgttc1740aagtactccaatttcaaaatgcaattcaattcgaattcgaatattgcaggagctactacc1800ggtgcacgacgcccaagtgcggtgtgaagaagcgggtggagcggtcgtaccaggacccct1860ccacggtgatcaccacgtacgaagggcagcacacgcaccacagcccggcgagcctccgcg1920gcggcggcggcggcgtcggcatcgtcggagggcaccaccaccaccacctcttcatgcccg1980gcgtgcatggcctgccgccgtcgcacctcatgccggcggggttccaccctgagctgatgg2040gcctcatgcaccaccacccggccatggccgccgccgccgcaaaccctagcatgtacttcc2100cgggcgtagctgcttctgctccgccgcctcctgctgtggctggcggcggtgcaatgccgc2160ccaacgatcatcctcctcttcagcagcatcacttcactgactacgccctgctgcaagacc2220ttttcccttccacaatgcccagcagcaacccatgatgatgactgatctaactgattctgc2280acaaatatatactactcaatatttaactagcacccggaatttatcaagatgcttttcaaa2340cattggagtcgttgcgccaaaaatgtgatggctagggagtgcttgatgatcagcttggtc2400ttggtgagaatatataattgttattaattaattgattttctgcaagcttttcatcttgaa2460cgtaacttgtgtgtgttgtgcacttcatgcttttttctctcttccatttgtcaacatttc2520cctggttgcaaattgaacggatcagtagagatggaagctacaactttataactagaacgg2580ctgcattccacttgattcttcagcatagccctttactgttctgcacctctagacttattg2640tacatgcatgtactagtgtatatcatgtgtacctcattgactcattttcggagagagcaa2700attaattaatatttcgtctc基因全長為2720個堿基，其中第33～35的ATG為起始密碼子，第2253～2255的TGA序列為終止密碼子。本發(fā)明所說osDw基因全長克隆方法為1)根據(jù)blast分析結(jié)果以NCBI上公布的核酸序列為基礎(chǔ)，采用PCR的方法擴增出2.7kb的核酸片斷；2)回收上述核酸片斷，連接到T載體上后，送交博亞公司測序，確證此核酸序列即為osDw基因。本發(fā)明所說的osDw基因RNAi表達載體是指包含osDw基因的3’端416bp的核苷酸序列，將此416bp核酸片斷分別正向和反向連接waxy內(nèi)含子的兩端，其核苷酸序列如下gaagaagcgggtggagcggtcgtaccaggacccctccacggtgatcaccacgtacgaagg60gcagcacacgcaccacagcccggcgagcctccgcggcggcggcggcggcgttggcatcgt120cggagggcaccaccaccaccacctcttcatgcccggcgtgcacggcctgccgccgtcgca180cctcatgccggcggggttccaccctgagctgatgggcctcatgcaccaccacccggccat240ggccgccgccgcaaaccctagcatgtacttcccgggcgtagctgcttctgctccgccgcc300tcctgctgtggctggcggcggtgcaatgccgcccaacgatcatcctcctcttcagcagca360tcacttcactgactacgccctgctgcaagaccttttcccttccacaatgcccagcaggat420ccaaccttacgtacgcgtgcacctaggaaggtatacatatatgtttataattctttgttt480cccctcttattcagatcgatcacatgcatctttcattgctcgtttttccttacaagtagt540ctcatacatgctaatttctgtaaggtgttgggctggaaattaattaattaattaattgac600ttgccaagatccatatatatgtcctgatattaaatcttcgttcgttatgtttggttaggc660tgatcaatgttattctagaggctagagaaacacacccaggggttttccaactagctccac720aagatggtgggctagctgacctagatttgaagtctcactccttataattattttatatta780gatcattttctaatattcgtgtctttttttattctagagtctagatcttgtgttcaactc840tcgttaaatcatgtctctcgccactggagaaacagatcaggagggtttattttgggtata900ggtcaaagctaagattgaaattcacaaatagtaaaatcggaatccaaccaattttagtan960ccgagtttggtccaaaggcaaaatggtatatagctagattattgtttctgctgggcattg1020tggaagggaaaaggtcttgcagcagggcgtagtcagtgaagtgatgctgctgaagaggag1080gatgatcgttgggcggcattgcaccgccgccagccacagcaggaggcggcggagcagaag1140cagctacgcccgggaagtacatgctagggtttgcggcggcggccatggccgggtggtggt1200gcatgaggcccatcagctcagggtggaaccccgccggcatgaggtgcgacggcggcaggc1260cgtgcacgccgggcatgaagaggtggtggtggtggtgccctccgacgatgccaacgccgc1320cgccgccgccgcggaggctcgccgggctgtggtgcgtgtgctgcccttcgtacgtggtga1380tcaccgtggaggggtcctggtacgaccgctccacccgcttcttc1424其中1～416為osDw基因的正義序列，417～1007為waxy內(nèi)含子序列，1008～1424為osDw的反義序列。本發(fā)明所說osDw基因RNAi載體的構(gòu)建方法為1)按osDw基因的3’端416bp核酸序列，合成兩對引物，并在兩對引物中分別引入Kpn1和BamHI以及SacI和SpeI酶切位點；然后PCR擴增得到預(yù)期核酸片斷；2)用Kpn1和BamHI酶切osDw基因的3’端416bp的PCR產(chǎn)物以及ds1301，并將酶切后的核酸片斷連接到ds1301，轉(zhuǎn)化大腸稈菌感受態(tài)細(xì)胞；3)經(jīng)PCR及酶切鑒定得陽性克隆，并命名為ds1301-oxDwsen；4)用SacI和SpeI酶切416bp核酸序列，并與ds1301-oxDwsen連接；5)經(jīng)PCR及酶切鑒定得到陽性克隆，并命名為ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen；6)測序驗證結(jié)果；7)抽提ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen質(zhì)粒；8)取1微克ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)稈菌EHA105；9)經(jīng)PCR及酶切鑒定得陽性克隆，甘油保存，備用。本發(fā)明所說的osDw基因遺傳轉(zhuǎn)化方法為1)取水稻胚，表面消毒，清洗；2)剝出水稻幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織；3)吸取農(nóng)稈菌菌液于YEB中培養(yǎng)；4)將農(nóng)稈菌菌液離心，然后用AA液體培養(yǎng)基懸??；5)挑取愈傷組織，浸泡在AA液體共培養(yǎng)基中；6)將愈傷組織塊從共培養(yǎng)基中夾出，置于無菌濾紙上吸干，而后移入附加乙酰丁香酮(AS)的共培養(yǎng)基中培養(yǎng)；7)將預(yù)分化后的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)；8)將再生小苗移栽到營養(yǎng)土中。在步驟1)中，將10％的次氯酸鈉表面消毒；無菌水清洗3-5遍，每次2-3min。在步驟2)中，用解剖針剝出幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+2mg/L2，4-D)中，暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織，2周后繼代一次。在步驟3)中，吸取0.01ml保存的菌液于10mlYEB(含Kan50μg/mL)中，28℃振蕩32h。在步驟4)中，將農(nóng)稈菌菌液在1,500轉(zhuǎn)速的條件下離心5分鐘，然后用AA液體培養(yǎng)基懸浮。在步驟5)中，挑取愈傷組織，浸泡在AA液體共培養(yǎng)基中20min。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1、本發(fā)明克隆的水稻osDw基因是一種新的具有控制水稻株高功能基因。2、可以根據(jù)osDw基因的序列，構(gòu)建RNAi載體，通過轉(zhuǎn)基因方法獲得矮稈植株。3、構(gòu)建RNAi載體時，在osDw基因的一段(例如3’端416bp核酸序列)正向和反向序列之間插入內(nèi)含子序列可以更有利于誘導(dǎo)基因沉默。圖1為本發(fā)明的轉(zhuǎn)osDWsen-waxy-osDWantisen基因的再生小苗。圖2為本發(fā)明的部分轉(zhuǎn)化植株的PCR擴增結(jié)果。在圖2中，1，12-3；2，5-2；3，21-1；4，21-2；5，9-1；6，9-2；7，2-3；8，8-1；9，2-3；10，2-1；ck陰性對照；M.DL2000marker。圖3為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株39-1(右圖)和對照植株(左圖)的形態(tài)比較。圖4為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植株(黑)和對照植株(白)的株高差異。未抽穗株高測量從尖葉頂部到基部，已抽穗株高測量從穗頂部到基部，縱坐標(biāo)為株高(CM)。圖5為本發(fā)明的抗性愈傷。具體實施例方式以下實施例將對本發(fā)明作進一步的說明實施例1以水稻品種日本晴的基因組DNA為模板，以NCBI上公布的核酸序列為基礎(chǔ)，設(shè)計兩對引物，進行PCR擴增?；厥諗U增產(chǎn)物，并取8μl回收產(chǎn)物與1μl的T-載體在16℃的條件下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸稈菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組子，進行PCR和酶切鑒定。挑取鑒定呈陽性的重組子，送交博亞公司測序。實施例2選取osDw基因的3端416bp核酸序列，合成兩對引物，并在引物中分別引入Kpn1和BamHI以及SacI和SpeI酶切位點。然后以基因組DNA位模板，進行PCR擴增，PCR的擴增條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性45sec，55℃退火1min，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸5min。回收PCR產(chǎn)物，并分別用Kpn1和BamHI雙酶切以及SacI和SpeI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。將ds1301用Kpn1和BamHI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物。取1μlT4連接酶Buffer，7μlKpn1和BamHI雙酶切的PCR產(chǎn)物，1μLKpn1和BamHI雙酶ds1301，10UT4連接酶，在16℃條件下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸稈菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組子，進行PCR和酶切鑒定后，獲得ds1301-osDwsen-waxy-nos中間載體。挑取ds1301-osDwsen-waxy-nos陽性重組子，在LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜，抽提質(zhì)粒，并用SacI和SpeI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，待用。取1μlT4連接酶Buffer，7μl的經(jīng)SacI和SpeI雙酶切的PCR產(chǎn)物，1μl的載體酶切產(chǎn)物，10UT4連接酶，在10μl的體系下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸稈菌感受態(tài)細(xì)胞，挑選重組子，進行PCR、酶切鑒定以及測序驗證后，獲得ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen-nosRNAi載體。實施例3共培養(yǎng)基的制備；挑取-20℃保存的甘油菌于1.5mlLB(含Kan50μg/ml)中，28℃振蕩32h后，吸取150μl農(nóng)稈菌液于10mlLB(含Kan50μg/mL)中，28℃培養(yǎng)24h后，離心，收集菌體，用等體積的用AA液體培養(yǎng)基懸浮菌體，并向菌體中加入乙酰丁香酮(AS)，使其濃度達到100μmol/L。實施例4取日本晴幼胚，用10％的次氯酸鈉表面消毒45min后；用無菌水清洗3-5遍，每次2-3min；用解剖針剝出幼胚，接種于MS+2，4-D2mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25-26℃，黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，15天后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中繼代一次。取新鮮的愈傷組織，浸泡在菌液中20min后，用鑷子夾出愈傷組織，放在含有多層濾紙的培養(yǎng)皿中，吸干多余的菌液。然后放入MS+2，4-D2mg/L+100μmol/LAS的共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3天。用鑷子夾取共培養(yǎng)3天后的愈傷組織，放入MS+2，4-D2mg/L+Cb500mg/L+Hyg100mg/L的篩選培養(yǎng)基上進行篩選，大部分愈傷在10天內(nèi)逐漸變褐，10天之后一部分褐化的組織上先后長出乳白色，略透明，松散，生長相對旺盛的抗性愈傷。將抗性愈傷在MS+ABA2mg/L+6-BA3mg/L+NAA1mg/L+Cb250mg/L+Hyg25mg/L的預(yù)分化培養(yǎng)基中預(yù)分化1周后，抗性愈傷組織中有綠色的小芽點出現(xiàn)，將這些帶綠點的愈傷組織轉(zhuǎn)移到MS+6-BA3mg/L+NAA1mg/L+Sorbitol13g/L+Cb250mg/L+Hyg25mg/L的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，綠色小點繼續(xù)分化，并相繼成苗。從綠點到分化成苗所需要的時間為3-6周不等。實施例5將分化后的小苗移栽到土壤中，待成活后，剪取葉片，進行PCR鑒定，標(biāo)記PCR鑒定呈陽性的植株，在抽穗時，測量單株的株高，并與轉(zhuǎn)化空載體的植株比較。實施例6與實施例2類似，基區(qū)別在于選取osDw基因的200bp核酸序列，按實施例2的方法構(gòu)建RNAi載體，甘油保存，備用。實施例7與實施例2類似，基區(qū)別在于選取osDw基因的800bp核酸序列，按實施例2的方法構(gòu)建RNAi載體，甘油保存，備用。實施例8與實施例2類似，基區(qū)別在于選取osDw基因的800bp核酸序列，按實施例2的方法構(gòu)建RNAi載體，甘油保存，備用。實施例9與實施例2類似，基區(qū)別在于以osDw基因的全長核酸序列，按實施例2的方法構(gòu)建RNAi載體，甘油保存，備用。實施例10取日本晴幼胚，10％的次氯酸鈉表面消毒45min；無菌水清洗3遍，每次3min。用解剖針剝出幼胚，接種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25℃，暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織，2周后繼代一次。吸取-20℃保存的菌液于1.5mlYEB(含Kan50μg/mL)中，28℃振蕩32h。吸取150μl農(nóng)稈菌新鮮菌液于10mlYEB(含Kan50μg/mL)中，28℃培養(yǎng)24h。將農(nóng)稈菌菌液在1,500rpm的條件下離心5min，然后用AA液體培養(yǎng)基懸浮，并稀釋成OD0.3～0.6的濃度。用鑷子挑取愈傷組織，浸泡在菌液中20min。用鑷子將愈傷組織塊從菌液中夾出，置于無菌濾紙上吸干，而后移入附加乙酰丁香酮(AS)的AA固體共培養(yǎng)基中。共培養(yǎng)2～3天后，將愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，15天后繼代一次，共2次。挑選生長良好、結(jié)構(gòu)致密的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入預(yù)分化培養(yǎng)基中，在25℃，12h的光照條件下預(yù)分化2周。將預(yù)分化后的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，將再生小苗移栽到營養(yǎng)土中。權(quán)利要求1.水稻矮稈基因，其特征在于osDw基因包含內(nèi)含子的序列為acataagctagctccccatactctcacaccccatgtcttctggaggaggaggaggaggag60gaggagatcgccatggcccctaccaccagcacgggcacctcggccgcggcgaaggcgctg120attacgtgtacagcagcagcgacatggagagcttcttcttcagccaacccgggggcgtcg180gcatcggcgggggtggtggtggcgtcgtcggcgccggcggtgccgacgagatcatgccgt240actccagcatcacggactacctgcaggggttattggacccctccgggctagctcggcacc300tcgacgtggcgtgcccgtcgtctcaggacacggtggtcaagcaggagctgtcggtggatg360tgacgagccacgacagccagggcaccggcggcgtcgccggagaaggcgtcgcgcaggcca420cgccgaactcgtcggcgtccttctcgtccagcgacggagaggcggagggcggcaaatcgt480cacgccggtgcaagaagggtcaggcgaaggcggaggaggaggacgacaaggatgaggagg540atggagagaactccaagaaaccgtatgttaaatttccattgattctactctatactttgt600ctgattcttgtcttgatttcttgcttgattaattcttttttgatgcgtgtcttgagatgg660ggatactttcttggggctagatctggttggtcatactgttgcggagttgcaaaatttgac720ctgaaattttctttcgtttatgctttctctctactgcatgcatggtgtgaacattagggt780ttgctagaattttggttccttagggttctttttagtagatccgtctatcctcttgttccc840cttttcttctgattccgttttgacccaatttccaatatgatctttcagacgatggggcta900ctactattcgatttaatttaatagacaaccaacctatgctccataatagatcttgcgtag960aatgaatcaattttacgagttatagcttcaatttttgacttgctaggtctttgaagatta1020tattatgatttccccttttagaaatgattcaaattaagatatattttcgtatcaccacca1080accacctaaatctacaatagttcctcagtacttttgcaaaattaacgctgatcttgcccc1140ataacatgcaatccaacagatatctagctagctagctaacttattagaccctaattaata1200ctatatatcaaaataacaactatttctagcaaaacctggtgctaatctaacatgaaatag1260ctagctattcccatagtccaccatgatcctacctatctagcaagctagttagctagtttg1320attgttggtgctctgaaaaagcccaaactaattaataattaggcctgattgagcttgtca1380ccgcagaaatatcaactgatcttctgaatccatatcatctctctgtttctagctaatcca1440cctgaccttatttttgatattttgtaccatgcatctacacaggaacaagcccaagaagaa1500agctgagaagaggcagcggcagcctcgcgtggcgttcctcaccaagagcgaggttgatca1560cctcgaggacggctaccggtggcgcaagtacggccagaaggcagtcaagaacagcccata1620cccgaggtacacatctatatacatgtacaaaccttaatttcacccagttgttgtagcaca1680tacatatatcgtagtataccatgttactgtgccatacaattgcatggcacgatggtgttc1740aagtactccaatttcaaaatgcaattcaattcgaattcgaatattgcaggagctactacc1800ggtgcacgacgcccaagtgcggtgtgaagaagcgggtggagcggtcgtaccaggacccct1860ccacggtgatcaccacgtacgaagggcagcacacgcaccacagcccggcgagcctccgcg1920gcggcggcggcggcgtcggcatcgtcggagggcaccaccaccaccacctcttcatgcccg1980gcgtgcatggcctgccgccgtcgcacctcatgccggcggggttccaccctgagctgatgg2040gcctcatgcaccaccacccggccatggccgccgccgccgcaaaccctagcatgtacttcc2100cgggcgtagctgcttctgctccgccgcctcctgctgtggctggcggcggtgcaatgccgc2160ccaacgatcatcctcctcttcagcagcatcacttcactgactacgccctgctgcaagacc2220ttttcccttccacaatgcccagcagcaacccatgatgatgactgatctaactgattctgc2280acaaatatatactactcaatatttaactagcacccggaatttatcaagatgcttttcaaa2340cattggagtcgttgcgccaaaaatgtgatggctagggagtgcttgatgatcagcttggtc2400ttggtgagaatatataattgttattaattaattgattttctgcaagcttttcatcttgaa2460cgtaacttgtgtgtgttgtgcacttcatgcttttttctctcttccatttgtcaacatttc2520cctggttgcaaattgaacggatcagtagagatggaagctacaactttataactagaacgg2580ctgcattccacttgattcttcagcatagccctttactgttctgcacctctagacttattg2640tacatgcatgtactagtgtatatcatgtgtacctcattgactcattttcggagagagcaa2700attaattaatatttcgtctc基因全長為2720個堿基，其中第33～35的ATG為起始密碼子，第2253～2255的TGA序列為終止密碼子。2.如權(quán)利要求1所述的水稻矮稈基因，其特征在于所說osDw基因全長克隆方法為1)根據(jù)序列對比分析結(jié)果以NCBI上公布的核酸序列為基礎(chǔ)，采用PCR的方法擴增出2.7kb的核酸片斷；2)回收上述核酸片斷，連接到T載體上后，送交博亞公司測序，確證此核酸序列即為osDw基因。3.如權(quán)利要求1所述的水稻矮稈基因，其特征在于所說的osDw基因RNAi表達載體為包含osDw基因的3’端416bp的核苷酸序列，將此416bp核酸片斷分別正向和反向連接waxy內(nèi)含子的兩端，其核苷酸序列如下gaagaagcgggtggagcggtcgtaccaggacccctccacggtgatcaccacgtacgaagg60gcagcacacgcaccacagcccggcgagcctccgcggcggcggcggcggcgttggcatcgt120cggagggcaccaccaccaccacctcttcatgcccggcgtgcacggcctgccgccgtcgca180cctcatgccggcggggttccaccctgagctgatgggcctcatgcaccaccacccggccat240ggccgccgccgcaaaccctagcatgtacttcccgggcgtagctgcttctgctccgccgcc300tcctgctgtggctggcggcggtgcaatgccgcccaacgatcatcctcctcttcagcagca360tcacttcactgactacgccctgctgcaagaccttttcccttccacaatgcccagcaggat420ccaaccttacgtacgcgtgcacctaggaaggtatacatatatgtttataattctttgttt480cccctcttattcagatcgatcacatgcatctttcattgctcgtttttccttacaagtagt540ctcatacatgctaatttctgtaaggtgttgggctggaaattaattaattaattaattgac600ttgccaagatccatatatatgtcctgatattaaatcttcgttcgttatgtttggttaggc660tgatcaatgttattctagaggctagagaaacacacccaggggttttccaactagctccac720aagatggtgggctagctgacctagatttgaagtctcactccttataattattttatatta780gatcattttctaatattcgtgtctttttttattctagagtctagatcttgtgttcaactc840tcgttaaatcatgtctctcgccactggagaaacagatcaggagggtttattttgggtata900ggtcaaagctaagattgaaattcacaaatagtaaaatcggaatccaaccaattttagtan960ccgagtttggtccaaaggcaaaatggtatatagctagattattgtttctgctgggcattg1020tggaagggaaaaggtcttgcagcagggcgtagtcagtgaagtgatgctgctgaagaggag1080gatgatcgttgggcggcattgcaccgccgccagccacagcaggaggcggcggagcagaag1140cagctacgcccgggaagtacatgctagggtttgcggcggcggccatggccgggtggtggt1200gcatgaggcccatcagctcagggtggaaccccgccggcatgaggtgcgacggcggcaggc1260cgtgcacgccgggcatgaagaggtggtggtggtggtgccctccgacgatgccaacgccgc1320cgccgccgccgcggaggctcgccgggctgtggtgcgtgtgctgcccttcgtacgtggtga1380tcaccgtggaggggtcctggtacgaccgctccacccgcttcttc1424其中1～416為osDW的正義序列，417～1007為waxy內(nèi)含子序列，1008～1424為osDw的反義序列。4.如權(quán)利要求3所述的水稻矮稈基因，其特征在于所說osDw基因RNAi載體的構(gòu)建方法為1)取osDw基因的3’端416bp核酸序列，合成兩對引物，并在兩對引物中分別引入Kpn1和BamHI以及SacI和SpeI酶切位點；然后以基因組DNA為模板，PCR擴增得到預(yù)期核酸片斷；2)用Kpn1和BamHI酶切osDw基因的3’端416bp的PCR產(chǎn)物以及ds1301，并將酶切后的核酸片斷連接到ds1301，轉(zhuǎn)化大腸稈菌感受態(tài)細(xì)胞；3)經(jīng)PCR及酶切鑒定得陽性克隆，并命名為ds1301-osDwsen；4)用SacI和SpeI酶切400bp核酸序列，并與ds1301-osDwsen連接；5)經(jīng)PCR及酶切鑒定得到陽性克隆，并命名為ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen；6)測序驗證結(jié)果；7)抽提ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen質(zhì)粒；8)取1微克ds1301-osDwsen-waxy-osDwantisen質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)稈菌EHA105；9)經(jīng)PCR及酶切鑒定得陽性克隆，甘油保存，備用。5.如權(quán)利要求1所述的水稻矮稈基因，其特征在于所說的osDw基因遺傳轉(zhuǎn)化方法為1)取水稻胚，表面消毒，清洗；2)剝出水稻幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織；3)吸取農(nóng)稈菌菌液于YEB中培養(yǎng)；4)將農(nóng)稈菌菌液離心，然后用AA液體培養(yǎng)基懸?。?)挑取愈傷組織，浸泡在含有農(nóng)稈菌的AA液體培養(yǎng)基中；6)將愈傷組織塊從共培養(yǎng)基中夾出，置于無菌濾紙上吸干，而后移入附加乙酰丁香酮的共培養(yǎng)基中培養(yǎng)；7)將預(yù)分化后的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)；8)將再生小苗移栽到營養(yǎng)土中。6.如權(quán)利要求5所述的水稻矮稈基因，其特征在于在步驟1)中，將10％的次氯酸鈉表面消毒，無菌水清洗3-5遍，每次2-3min，在步驟2)中，用解剖針剝出幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織，2周后繼代一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為MS+2mg/L2，4-D。7.如權(quán)利要求5所述的水稻矮稈基因，其特征在于在步驟3)中，吸取0.01ml保存的菌液于10mlYEB中，28℃振蕩32h，YEB中含Kan50μg/mL。8.如權(quán)利要求1所述的水稻矮稈基因，其特征在于osDw基因全長核酸序列或部分核酸序列構(gòu)建的RNAi載體和反義RNA載體。9.osDw基因在水稻遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。全文摘要水稻矮稈基因，涉及一種水稻基因，尤其是涉及一種通過T－DNA插入突變的方法獲得的水稻矮稈基因。提供一種通過T－DNA插入突變的方法獲得的osDw基因及其克隆方法；osDw基因RNAi表達載體與構(gòu)建方法；osDw基因的遺傳轉(zhuǎn)化方法及其在遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用?；蛉L為2720個堿基，其中第33～35的ATG為起始密碼子，第2253～2255的TGA序列為終止密碼子?？寺》椒楦鶕?jù)blast分析結(jié)果以NCBI上公布的核酸序列為基礎(chǔ)，采用PCR方法擴增出2.7kb核酸片斷；回收核酸片斷，接到T載體上后測序確證。具有控制水稻株高功能?？筛鶕?jù)其序列，構(gòu)建RNAi載體，通過轉(zhuǎn)基因方法獲得矮稈植株。文檔編號A01H4/00GK1840662SQ200510116948公開日2006年10月4日申請日期2005年10月27日優(yōu)先權(quán)日2005年10月27日發(fā)明者陳亮,張紅心,林濤,郭小玲,蘇勇波,夏令申請人:廈門大學(xué)