專利名稱：水稻白葉枯病菌小種劃分方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為水稻白葉枯病菌小種劃分方法，專用于對水稻白葉枯病菌小種進行劃分和鑒別，從而及時準確地掌握水稻白葉枯病菌小種組成和優(yōu)勢小種的分布，以便水稻白葉枯病抗病育種和田間品種的合理布局，同時也有利于對各國小種進行比較和研究。
背景技術(shù)：
水稻白葉枯病是亞洲和太平洋地區(qū)水稻生產(chǎn)上最重要的細菌性病害之一。抗病品種的培育和利用是控制該病害的最經(jīng)濟、有效的措施，但抗病基因的鑒定、抗病品種的培育和篩選以及品種的合理布局等都依賴于對病原菌小種分化的研究。
病原菌致病力分化的研究通常是根據(jù)病原菌在含不同已知抗病基因的鑒別品種上反應(yīng)類型將其區(qū)分為不同的小種或致病型(Mew等，1987)。水稻白葉枯病菌致病力分化的研究最早是由日本的久原重松在1958年開始的，但早期所利用的鑒別品種的遺傳背景(即含有的抗病基因)并不十分清楚，白葉枯病菌小種或致病型的劃分有較大的隨意性，鑒別品種的增減會使同一個菌株歸于不同的小種或致病型。因而，盡管這些鑒別品種可以較好的將不同致病力的菌株區(qū)別開來，但這并不能真正反映病原菌致病力分化的情況(Horino等，1980)。如1969年，Kozaka根據(jù)在不同品種上的反應(yīng)類型，將日本的白葉枯病菌區(qū)分為三個群；Ezuka和Horino(1974)在增加了鑒別品種之后進一步分為五個群。歐世璜、苗東華最初將菲律賓的白葉枯病菌分為四個致病群，后來發(fā)現(xiàn)了一個具有很好鑒別能力的品種后，又將第一致病群再分為兩群，并稱之為“生理小種”。
從1985年開始，本實驗室和江蘇省農(nóng)科院、廣東省農(nóng)科院、中國農(nóng)科院等單位在各自研究工作的基礎(chǔ)上成立了我國白葉枯病菌致病型研究協(xié)作組，根據(jù)在IR26、JV14、NG15、Tetep和JG30等五個基本的鑒別品種上的反應(yīng)將我國的白<p>4)在基體中，給定厚度a為3mm；長度b為5mm；和相對介電常數(shù)εr為3，那么，下列等式成立f＝-300.33x-232.33y+3107.38(MHz)w＝-0.113x+0.681(mm)這種情況涉及


圖15A至15C(導(dǎo)體寬度-諧振頻率關(guān)系)；
圖16A至16C(導(dǎo)體繞制匝數(shù)-諧振頻率關(guān)系)；和
圖17A至17C(導(dǎo)體繞制匝數(shù)-導(dǎo)體寬度關(guān)系)，還有表13(對諧振頻率的計算結(jié)果和實測數(shù)據(jù))；表14(對導(dǎo)體寬度的計算結(jié)果和實測數(shù)據(jù))；和表15(由導(dǎo)體寬度的偏差引起的諧振頻率偏差)。
表13
4.病情調(diào)查接種2周和3周后分別測量病斑長度和該葉片的全長，每個菌株測量10張葉片。以3周后調(diào)查的病斑長度小于接種葉長的四分之一為抗病(R)，反之大于等于接種葉長的四分之一為感病(S)。
5.小種劃分用含不同抗病基因的水稻近等基因系品種IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24作為鑒別品種，根據(jù)病原菌菌株與這些鑒別品種的互作反應(yīng)，將白葉枯菌株劃分為相應(yīng)的9個小種。對應(yīng)9個小種R1-R9的互作模式為，R1抗抗抗抗抗抗；R2抗抗抗抗抗感；R3抗抗抗抗感感；R4抗抗抗感感感；R5抗抗感感感感；R6抗感抗抗抗感；R7抗感感抗抗感；R8抗感感感感感；R9感感感感感感。
有益效果 本方法與國內(nèi)其它同類研究相比優(yōu)點表現(xiàn)在(1)水稻鑒別品種遺傳背景一致由于以前所用的鑒別品種系統(tǒng)所含的抗病基因并不完全清楚，因而各個國家或地區(qū)小種的劃分不僅隨意性大，而且結(jié)果也缺乏可比性。利用已知抗病基因的近等基因系(單基因)材料有效地解決了這個問題。
(2)參試菌株的代表性更強選用了全國23個省或自治區(qū)的285個菌株作為參試菌株。其中，1990年以前的菌株108個，2003-2004年采集的菌株177個。小種的劃分不僅反映了目前生產(chǎn)上病原菌致病力的分化，也在一定程度上揭示了稻白葉枯病菌菌致病力分化的變異過程。
(3)接種葉位一致采用孕穗期對平展劍葉進行剪葉接種。根據(jù)調(diào)查，接種葉片部位不同，病斑擴展速度不同，病斑長度相差較大。接種初期下部葉片的病斑擴展速度要快于上部葉片，后期則相反。
(4)調(diào)查數(shù)據(jù)更準確，可靠葉位不同，葉片長度也不相同。因此，在測量病斑同時也測量了該葉片的總?cè)~長，并且在接種2周和3周后分別調(diào)查病情以期相互驗證。
具體實施例方式
1.已知抗病基因的24個水稻品種來自中國水稻所，是國際水稻所(IRRI)培育出的一套近等基因系材料，見表2。將參試水稻品種以規(guī)定的次序移栽到每個劃定的小區(qū)，每個品種栽插1行，單株栽插，株行距為25×20cm，4月中旬浸種育秧，5月中旬移栽。
表2.參試水稻品種及其所包含的抗性基因

除了不使用殺菌劑外，種子浸種、催芽，田塊的耕作、施加底肥以及田間的管理與常規(guī)的水稻種植相同。
2.參試菌株的準備取出凍干保存的原始菌株，移植兩代后在汕優(yōu)63上預(yù)接種，從中選出有活力的285個菌株作為參試菌株，見表3。接種前兩天取出參試菌株，在NA斜面上劃線，28度生長48小時后接種。NA培養(yǎng)基配方牛肉浸膏3g，酵母提取物1g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，瓊脂17g，加水定容至1000mL，調(diào)pH至7.0。
表3參試菌株與來源



3.接種接種前，以無菌水洗脫菌落，懸浮均勻，調(diào)整菌懸液濃度約為3×108cfu/ml。用預(yù)先滅菌處理的、型號一致的平口剪刀沾取菌懸液(沾菌懸液時應(yīng)張開剪刀，以使刀刃上能沾到菌懸液)，選取主莖平展劍葉，剪刀平置，刀尖稍向上，剪去葉尖2-3cm，每個水稻品種接種10片葉。接種過程中，每接種一個菌株要換一把處理過的剪刀。
4.病情調(diào)查接種2周和3周后分別測量病斑長度和該葉片的全長，每菌株測量10張葉片。以3周后調(diào)查的病斑長度小于接種葉長的四分之一為抗病(R)，反之大于等于接種葉長的四分之一為感病(S)。
5.小種劃分根據(jù)病原菌在含不同抗病基因的水稻近等基因系品種上的抗、感反應(yīng)，篩選出對我國水稻白葉枯病菌致病力分化具有較好鑒別能力(抗感差異明顯、穩(wěn)定)的品種作為鑒別品種。所用的鑒別品種為IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24。根據(jù)病原菌菌株與這些鑒別品種的互作反應(yīng)，將白葉枯病菌株劃分為相應(yīng)的9個小種，各小種與各鑒別品種的互作反應(yīng)結(jié)果及其差異性分析結(jié)果見表4。對應(yīng)9個小種R1-R9的互作模式為，R1抗抗抗抗抗抗；R2抗抗抗抗抗感；R3抗抗抗抗感感；R4抗抗抗感感感；R5抗抗感感感感；R6抗感抗抗抗感；R7抗感感抗抗感；R8抗感感感感感；R9感感感感感感。
表4水稻白葉枯病菌與水稻鑒別品種之間的互作關(guān)系及差異性分析

x對應(yīng)小種在水稻鑒別品種上致病的病斑長度；y根據(jù)FLSD(Fisher’s protected least significant difference)方法進行差異性分析，相同字母代表p＜0.01水平上差異性不顯著，不同字母代表了p＜0.01上差異性顯著)；zR＝抗(接種21天后病斑長度小于葉片總長的1/4)，S＝感(接種21天后病斑長度大于或等于葉片總長的1/4)。
范例1云南地區(qū)水稻白葉枯病菌小種的劃分1)水稻鑒別品種的準備已知抗病基因的6個近等基因系材料，見表1。將參試水稻品種以規(guī)定的次序移栽到每個劃定的小區(qū)，每個品種栽插1行，單株栽插，株行距為25×20cm，根據(jù)當?shù)爻Ｒ?guī)的種植方法進行浸種、育秧、移栽以及管理。
2)參試菌株的準備取出凍干保存的原始菌株59個，移植兩代后在移植兩代后在汕優(yōu)63上預(yù)接種，從中選出有活力的菌株作為參試菌株。接種前兩天取出參試菌株，在NA斜面上劃線，28度生長48小時后接種。NA培養(yǎng)基配方牛肉浸膏3g，酵母提取物1g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，瓊脂17g，加水定容至1000mL，調(diào)pH至7.0。
3)接種接種前，以無菌水洗脫菌落，懸浮均勻，調(diào)整菌懸液濃度約為3×108cfu/ml。用預(yù)先滅菌處理的、型號一致的平口剪刀沾取菌懸液(沾菌懸液時應(yīng)張開剪刀，以使刀刃上能沾到菌懸液)，選取主莖劍葉平展葉片，剪刀平置，刀尖稍向上，剪去葉尖2-3cm，每個水稻品種接種10片葉。接種過程中，每接種一個菌株要換一把處理過的剪刀。
4)病情調(diào)查接種2周和3周后分別測量病斑長度和該葉片的全長，每個菌株測量10張葉片。以3周后調(diào)查的病斑長度小于接種葉長的四分之一為抗病(R)，反之大于等于接種葉長的四分之一為感病(S)。
5)小種劃分用含不同抗病基因的水稻近等基因系品種IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24作為鑒別品種，根據(jù)病原菌菌株與這些鑒別品種的互作結(jié)果，對應(yīng)9個小種R1-R9的互作模式，R1抗抗抗抗抗抗；R2抗抗抗抗抗感；R3抗抗抗抗感感；R4抗抗抗感感感；R5抗抗感感感感；R6抗感抗抗抗感；R7抗感感抗抗感；R8抗感感感感感；R9感感感感感感，將白葉枯菌株對應(yīng)劃分為相應(yīng)的9個小種。R2為優(yōu)勢小種，包含了參試菌株18個，其它R1-R7，R9分別包含了參試菌株5、8、1、4、9、8、5、1個。
范例2吉林地區(qū)水稻白葉枯病菌小種的劃分1)水稻鑒別品種的準備已知抗病基因的6個近等基因系材料，見表1。將參試水稻品種以規(guī)定的次序移栽到每個劃定的小區(qū)，每個品種栽插1行，單株栽插，株行距為25×20cm，根據(jù)當?shù)爻Ｒ?guī)的種植方法進行浸種、育秧、移栽以及管理。
2)參試菌株的準備取出凍干保存的原始菌株30個，移植兩代后在移植兩代后在汕優(yōu)63上預(yù)接種，從中選出有活力的菌株作為參試菌株。接種前兩天取出參試菌株，在NA斜面上劃線，28度生長48小時后接種。NA培養(yǎng)基配方牛肉浸膏3g，酵母提取物1g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，瓊脂17g，加水定容至1000mL，調(diào)pH至7.0。
3)接種接種前，以無菌水洗脫菌落，懸浮均勻，調(diào)整菌懸液濃度約為3×108cfu/ml。用預(yù)先滅菌處理的、型號一致的平口剪刀沾取菌懸液(沾菌懸液時應(yīng)張開剪刀，以使刀刃上能沾到菌懸液)，選取主莖劍葉平展葉片，剪刀平置，刀尖稍向上，剪去葉尖2-3cm，每個水稻品種接種10片葉。接種過程中，每接種一個菌株要換一把處理過的剪刀。
4)病情調(diào)查接種2周和3周后分別測量病斑長度和該葉片的全長，每個菌株測量10張葉片。以3周后調(diào)查的病斑長度小于接種葉長的四分之一為抗病(R)，反之大于等于接種葉長的四分之一為感病(S)。
5)小種劃分用含不同抗病基因的水稻近等基因系品種IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24作為鑒別品種，根據(jù)病原菌菌株與這些鑒別品種的互作結(jié)果，對應(yīng)9個小種R1-R9的互作模式，R1抗抗抗抗抗抗；R2抗抗抗抗抗感；R3抗抗抗抗感感；R4抗抗抗感感感；R5抗抗感感感感；R6抗感抗抗抗感；R7抗感感抗抗感；R8抗感感感感感；R9感感感感感感，將白葉枯菌株對應(yīng)劃分為相應(yīng)的4個小種R1、R2、R6、R7。R7為優(yōu)勢小種，包含了參試菌株18個，其它R1、R2、R6分別包含了參試菌株2、6、4個。
權(quán)利要求
1.水稻白葉枯病菌小種的劃分方法，包括1)水稻鑒別品種的準備已知抗病基因的6個近等基因系材料，見表1，將參試水稻品種以規(guī)定的次序移栽到每個劃定的小區(qū)，每個品種栽插1行，單株栽插，株行距為25×20cm，根據(jù)當?shù)爻Ｒ?guī)的種植方法進行浸種、育秧、移栽以及管理；表1.參試水稻鑒別品種及其所包含的抗性基因
2)參試菌株的準備取出凍干保存的原始菌株，移植兩代后在移植兩代后在汕優(yōu)63上預(yù)接種，從中選出有活力的菌株作為參試菌株。接種前兩天取出參試菌株，在NA斜面上劃線，28度生長48小時后接種。NA培養(yǎng)基配方牛肉浸膏3g，酵母提取物1g，多聚蛋白胨5g，蔗糖10g，瓊脂17g，加水定容至1000mL，調(diào)pH至7.0；3)接種接種前，以無菌水洗脫菌落，懸浮均勻，調(diào)整菌懸液濃度約為3×108cfu/ml。用預(yù)先滅菌處理的、型號一致的平口剪刀沾取菌懸液(沾菌懸液時應(yīng)張開剪刀，以使刀刃上能沾到菌懸液)，選取主莖劍葉平展葉片，剪刀平置，刀尖稍向上，剪去葉尖2-3cm，每個水稻品種接種10片葉。接種過程中，每接種一個菌株要換一把處理過的剪刀；4)病情調(diào)查接種2周和3周后分別測量病斑長度和該葉片的全長，每個菌株測量10張葉片。以3周后調(diào)查的病斑長度小于接種葉長的四分之一為抗病，反之大于等于接種葉長的四分之一為感?。?)小種劃分用含不同抗病基因的水稻近等基因系品種IRBB5、IRBB13、IRBB3、IRBB14、IRBB2和IR24作為鑒別品種，根據(jù)病原菌菌株與這些鑒別品種的互作結(jié)果，對應(yīng)9個小種R1-R9的互作模式，R1抗抗抗抗抗抗；R2抗抗抗抗抗感；R3抗抗抗抗感感；R4抗抗抗感感感；R5抗抗感感感感；R6抗感抗抗抗感；R7抗感感抗抗感；R8抗感感感感感；R9感感感感感感，將白葉枯菌株對應(yīng)劃分為相應(yīng)的小種。
全文摘要
利用已知抗病基因的6個近等基因系材料對水稻白葉枯病菌的小種進行劃分和鑒別。在水稻孕穗期，以濃度約為3×10
文檔編號A01G16/00GK1695434SQ200510040448
公開日2005年11月16日 申請日期2005年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月9日
發(fā)明者劉鳳權(quán), 胡白石, 楊萬風(fēng), 劉紅霞 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)