專利名稱：具有殺線蟲功能的秀麗單頂孢菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲功能的秀麗單頂孢菌劑及其制備方法和應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物線蟲是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，僅根結(jié)線蟲已知種類達(dá)70多種，危害3000多種植物，每年造成損失巨大。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，每年全球因線蟲造成的損失高達(dá)1000億美元，2001年我國(guó)作物因受線蟲危害造成的損失高達(dá)233億元。松材線蟲被稱為無(wú)煙森林火災(zāi)，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺(tái)灣、香港等部份地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，有向全國(guó)漫延的趨勢(shì)。更嚴(yán)重的是由于根結(jié)線蟲侵染后造成作物傷口，致使作物根部病害嚴(yán)重發(fā)生。
目前對(duì)線蟲防治仍以化學(xué)殺線蟲劑為主。發(fā)明于上個(gè)世紀(jì)40年代的化學(xué)殺線蟲劑，長(zhǎng)期以來(lái)在保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，防治線蟲病中發(fā)揮了重要作用。但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)許多化學(xué)殺線蟲劑均有副作用，不僅產(chǎn)生抗藥性，更造成環(huán)境污染，危害人體健康，相繼有不少被禁用或即將禁用。如美國(guó)已經(jīng)禁止使用溴甲烷和二溴甲烷?；瘜W(xué)殺線蟲劑在防治線蟲危害，保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的同時(shí)，給人類健康和環(huán)境帶來(lái)了嚴(yán)重的負(fù)面影響，開發(fā)高效低毒殺線蟲劑和生物殺線蟲劑已經(jīng)迫在眉睫。
單頂孢是一類非常重要的捕食線蟲真菌，它們能夠產(chǎn)生三維菌網(wǎng)等捕食器官捕促線蟲，是一類非常重要的線蟲生防資源。研究表明，秀麗單頂孢不僅能夠在CMA平板上產(chǎn)生捕器捕捉線蟲，同時(shí)分泌胞外蛋白酶，利用胞外蛋白酶分解線蟲體壁從而殺死線蟲。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對(duì)產(chǎn)生胞外酶并能夠有效分解線蟲體壁的秀麗單頂孢的研究，開發(fā)生物殺線蟲劑。
本發(fā)明篩選到的對(duì)植物寄生線蟲具有很好毒殺作用的秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)，YMF1.00027，YMF1.00027菌株已于2005年1月27日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國(guó).北京.中關(guān)村；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC No.1310。
秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)，YMF1.00027營(yíng)養(yǎng)菌絲無(wú)色，分隔，分枝；在CMA培養(yǎng)基上，28℃時(shí)生長(zhǎng)速度快，菌落無(wú)色；分生孢子梗較長(zhǎng)120～575μm，分隔，直立，有時(shí)產(chǎn)生較長(zhǎng)分枝，頂端產(chǎn)生單個(gè)分生孢子；分生孢子紡錘形，大小為37.5～72.5×17.5～27.5μm，1～4個(gè)分隔，多為三個(gè)分隔，中央特大細(xì)胞明顯，該菌還能產(chǎn)生小分生孢子，倒卵形，大小為8～15×5～6μm，無(wú)隔。捕食器官為三維菌網(wǎng)。
本發(fā)明按常規(guī)方法制備，將秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)YMF1.00027擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取殺線蟲有效成分，測(cè)定其對(duì)腐生線蟲(Pansgrellus redivivus)和松材線蟲的毒殺作用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的YMF1.00027菌株培養(yǎng)方法1.試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為改良型PDA培養(yǎng)基1％葡萄糖；100g土豆煮成汁，1.8％瓊脂；pH6.5。將YMF1.00027菌絲體接種到培養(yǎng)基上，22℃下培養(yǎng)8天，獲得試管種。
2.液體擴(kuò)大培養(yǎng)(產(chǎn)酶培養(yǎng))產(chǎn)酶培養(yǎng)基(PL-4)組成如下0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亞鐵，用水補(bǔ)充體積至1L，pH6.5。每個(gè)250ml三角瓶分裝60ml培養(yǎng)液，并加入少量的線蟲作為誘導(dǎo)物，121℃滅菌20分鐘，接入菌塊，26℃搖床(200rpm)培養(yǎng)6天。
殺線蟲活性成分的提取將發(fā)酵培養(yǎng)物過濾，收集上清液，按1∶0.56的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用50mM磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7.0)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時(shí)，即得殺線蟲藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
殺線蟲活性試驗(yàn)1、制備試驗(yàn)用藥劑和對(duì)照用藥劑1)按前述液體擴(kuò)大培養(yǎng)方法培養(yǎng)YMF1.00027菌株，按前述提取殺線蟲活性成份的方法制備試驗(yàn)用藥劑。
2)制備對(duì)照用藥劑對(duì)照1按制備試驗(yàn)用藥方法制備，不同的是，培養(yǎng)液中不接入YMF1.00027菌株。
對(duì)照2將制備供試藥劑100℃煮沸30分鐘后作為對(duì)照，以證明殺線蟲有效成份是蛋白酶。
2、制備試驗(yàn)用線蟲1)將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無(wú)菌水洗滌，瞬時(shí)離心，棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲。用無(wú)菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
2)制備松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g經(jīng)水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養(yǎng)4至7天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經(jīng)0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲，28℃培養(yǎng)15至20天。用無(wú)菌水將線蟲洗下，稀釋成含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
3、試驗(yàn)方法1)藥效試驗(yàn)方法取試驗(yàn)用藥劑200μl于1.5ml離心管中，分別加入Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲60條，離心管平放，置于25℃下，分別于12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)檢查計(jì)算線蟲的死亡率。并在光學(xué)顯微鏡下觀察，觀察線蟲體壁變化情況。
鑒定死亡的方法為在處理離心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動(dòng)。
分別用三種對(duì)照藥劑，每處理重復(fù)三次。

分別用兩種對(duì)照藥劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。
試驗(yàn)設(shè)三個(gè)平行，兩次重復(fù)。
4、試驗(yàn)結(jié)果表1 秀麗單頂孢 YMF1.00027對(duì)Panagrellus redivivus線蟲毒殺效果

表2秀麗單頂孢YMF1.00027對(duì)松材線蟲毒殺效果

結(jié)果表明，秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)YMF1.00027菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取的試驗(yàn)用藥劑對(duì)Panagrellus redivivus線蟲具較好的毒殺作用，36小時(shí)線蟲死亡率達(dá)100％，體壁完全溶解。從處理線蟲的變化來(lái)看，經(jīng)歷了從部份體壁溶解到蟲體全部溶解的過程，說(shuō)明活性成份主要為分解線蟲的酶類。而將同批提取的試驗(yàn)用藥劑經(jīng)過煮沸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性后，其殺線蟲活性非常小，且線蟲體壁不出現(xiàn)溶解現(xiàn)象。說(shuō)明秀麗單頂孢YMF1.00027菌株的活性成份主要為酶類。秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)YMF1.00027菌株對(duì)松材線蟲有一定的毒殺作用，線蟲36小時(shí)的死亡率達(dá)85％，蟲體僵直。
本發(fā)明的秀麗單頂孢菌劑對(duì)線蟲Panagrellus redivivus和對(duì)松材線蟲具有較好的毒殺效果，可以作為線蟲生防菌劑進(jìn)行開發(fā)。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
將YMF1.00027菌株接種到改良PDA斜面上，培養(yǎng)基配方為1％葡萄糖；100g土豆煮成汁，1.8％瓊脂；pH自然。將YMF1.00024菌絲體接種到培養(yǎng)基上，22℃下培養(yǎng)8天，獲得試管種。
將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中(每瓶裝60ml)，液體培養(yǎng)基配方為0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亞鐵，用水補(bǔ)充體積至1L，pH6.5。每個(gè)250ml三角瓶分裝60ml培養(yǎng)液，并加入少量的線蟲作為誘導(dǎo)物，121℃滅菌20分鐘，接入菌塊，26℃搖床(200rpm)培養(yǎng)6天。
按1∶0.56的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用50mM磷酸緩沖液(39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7.0)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時(shí)，即得殺線蟲藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
本發(fā)明的使用效果見表1和表2。
權(quán)利要求
1.一種具有殺線蟲功能的秀麗單頂孢菌劑，該菌劑由生產(chǎn)菌株和輔料經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體擴(kuò)大培養(yǎng)及提取殺線蟲活性成份工序后得到，其特征在于生產(chǎn)菌株為秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)YMF1.00027，YMF1.00027菌株已于2005年1月27日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；地址中國(guó).北京.中關(guān)村；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)為CGMCC No.1310。
2.權(quán)利要求1所述菌劑的制備方法，包括試管種培養(yǎng)、液體擴(kuò)大培養(yǎng)及提取殺線蟲活性成份，其特征在于
2.1液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亞鐵，用水補(bǔ)充體積至1L，pH6.5；
2.2從液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取殺線蟲有效成分的方法是將發(fā)酵培養(yǎng)物過濾，收集上清液，按1∶0.56的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清；用50mM磷酸緩沖液重新溶解，磷酸緩沖液為39ml的50mM磷酸二氫鈉加61ml的50mM磷酸氫二鈉，pH為7.0；將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋于50mM磷酸緩沖液中透析3-4次，每次3小時(shí)，即得殺線蟲藥液。
3.權(quán)利要求1所述的菌劑，其特征在于該菌劑對(duì)Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有毒殺作用，可用于植物寄生線蟲生防。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲功能的秀麗單頂孢菌劑及其制備方法和應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本菌劑的生產(chǎn)菌株為秀麗單頂孢(Monacrosporium elegans)，YMF1.00027，采用常規(guī)方法制備，其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為0.1％葡萄糖，0.1％硫酸銨，0.05％硫酸鎂，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亞鐵，用水補(bǔ)充體積至1L，pH6.5。從液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取殺線蟲有效成分的方法是，將發(fā)酵培養(yǎng)物進(jìn)行過濾處理，上清液用硫酸銨進(jìn)行濃縮處理即可做為殺線蟲的藥液。本發(fā)明的菌劑對(duì)Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有效高的毒力，有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01N63/04GK1670178SQ20051001069
公開日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2005年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月16日
發(fā)明者楊金奎, 張克勤, 周薇 申請(qǐng)人:云南大學(xué)