專(zhuān)利名稱(chēng)：在周?chē)芗膊『拖嚓P(guān)病癥的治療中使用再生細(xì)胞的方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是2002年12月9日提交的題目為“用經(jīng)處理的脂肪抽取細(xì)胞治療患者的系統(tǒng)和方法”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/316127的部分繼續(xù)申請(qǐng)，其要求于2001年12月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/338856的權(quán)益。本申請(qǐng)也要求2003年9月17曰提交的題目為“使用源自脂肪組織的細(xì)胞來(lái)治療周?chē)芗膊『拖嚓P(guān)病況的方法”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/503589的優(yōu)先權(quán)。所有上述申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)這種引用而清楚地結(jié)合于本文中。
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及源自脂肪組織的細(xì)胞，更具體涉及源自脂肪的再生細(xì)胞(例如，干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞)，使用源自脂肪的再生細(xì)胞的方法，含有源自脂肪的再生細(xì)胞的組合物，以及用于制備和使用源自脂肪的再生細(xì)胞的系統(tǒng)，所述再生細(xì)胞用于治療周?chē)芗膊『拖嚓P(guān)的病況、疾病或病癥。
2.相關(guān)技術(shù)的描述周?chē)芗膊?PVD)和相關(guān)病癥被定義為心臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)外血管的疾病，這在肢體血管變窄時(shí)常常會(huì)遇到。有兩種主要類(lèi)型的這些病癥，不涉及血管中的缺陷而是源自刺激例如寒冷、壓力或抽煙的功能性疾病，以及源自脈管系統(tǒng)中結(jié)構(gòu)缺陷例如動(dòng)脈粥樣硬化損害、局部炎癥或外傷的器質(zhì)性疾病。這可導(dǎo)致血管的堵塞、異常的血流，并且最終導(dǎo)致組織局部缺血。
一種在臨床上更重要的PVD形式是周?chē)鷦?dòng)脈疾病(PAD)，其具有與冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)共同的要素。類(lèi)似于CAD，PAD常常通過(guò)血管成形術(shù)和支架移植或通過(guò)動(dòng)脈旁路外科手術(shù)來(lái)治療。臨床癥狀取決于堵塞血管的位置。例如，供應(yīng)血液至腸的動(dòng)脈(即腸系膜上動(dòng)脈)的變窄可在小腹導(dǎo)致劇烈的食后痛，這是因?yàn)槎氯难懿荒軡M足消化和吸收過(guò)程中增加的氧需求所引起的。嚴(yán)重的局部缺血可導(dǎo)致腸壞死。類(lèi)似地，腿部的PAD可導(dǎo)致出現(xiàn)間歇性疼痛，通常在腓腸中，其伴隨著活動(dòng)而出現(xiàn)和消失。這種病癥已知為間歇性跛行(IC)，并且可發(fā)展成休息時(shí)的持續(xù)性疼痛、局部缺血潰瘍甚至截肢。對(duì)于PVD，目前可用的治療干預(yù)包括溶栓藥物和抗血栓藥物(肝素、阿斯匹林、香豆定)、鍛煉(針對(duì)IC)、抗動(dòng)脈粥樣化藥物(例如他丁類(lèi))以及手術(shù)血管再造。然而，許多患者所具有的疾病在解剖學(xué)上不適合于外科干預(yù)。
周?chē)芗膊∫部杀憩F(xiàn)為腎臟動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄，這可導(dǎo)致腎臟局部缺血和腎臟機(jī)能障礙。生物學(xué)血管再形成提供了手術(shù)方法的潛在替代。它涉及將血管生成和動(dòng)脈生成的過(guò)程，它們組合起來(lái)以便驅(qū)動(dòng)新并行血流技術(shù)的發(fā)展，以用于在堵塞周?chē)月费?。生物學(xué)血管再形成可通過(guò)提供血管生成因子的藥物和基因治療來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)傳遞細(xì)胞的細(xì)胞療法來(lái)實(shí)現(xiàn)，該細(xì)胞通過(guò)旁分泌釋放血管生成因子和/或通過(guò)提供可形成內(nèi)皮的細(xì)胞來(lái)源而有助于血管生成。
細(xì)胞療法研究是基于發(fā)現(xiàn)了骨髓中存在非造血干細(xì)胞和內(nèi)皮的前體細(xì)胞(Prockop，Azizi等人2000)(Pittenger，Mackay等人1999)(Shi，Rafii等人1998；Carmeliet和Luttun2001)。這些研究采用骨髓移植接受者動(dòng)物，其中供體和宿主細(xì)胞可通過(guò)遺傳標(biāo)志來(lái)區(qū)分開(kāi)，以便顯示接受者中的一部分新血管發(fā)育是源自供體骨髓細(xì)胞(Carmeliet和Luttun2001)(Takahashi，Kalka等人1999；Murayama，Tepper等人2002)。盡管這項(xiàng)工作明確地證明了，骨髓包含這種細(xì)胞，骨髓中間質(zhì)干細(xì)胞的幾率估計(jì)在100000至1000000個(gè)有核細(xì)胞中有1個(gè)(D′lppolito等人，1999；Banfi等人，2001；Falla等人，1993)。類(lèi)似地，從皮膚和其它組織中抽取這些細(xì)胞涉及若干星期長(zhǎng)的復(fù)雜細(xì)胞培養(yǎng)步驟系列(Toma等人，2001)，并且臨床應(yīng)用源自骨骼肌的干細(xì)胞要求兩個(gè)至三個(gè)星期的培養(yǎng)期(Hagege等人，2003)。因此，任何提出的臨床應(yīng)用來(lái)自這種組織的干細(xì)胞將要求通過(guò)細(xì)胞純化和細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程增加細(xì)胞數(shù)量、純度和成熟度。
盡管細(xì)胞培養(yǎng)步驟可提供增加的細(xì)胞數(shù)量、純度和成熟度，但是，這樣是有代價(jià)的。這種代價(jià)可包括一個(gè)或多個(gè)以下技術(shù)困難由于細(xì)胞老化而喪失細(xì)胞功能，喪失可能有用的非干細(xì)胞群體，可能延緩將細(xì)胞應(yīng)用于患者，增加了費(fèi)用，以及在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞被環(huán)境微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)增大。最近檢查源自骨髓的ASC的治療效果的研究使用了基本上全骨髓來(lái)避免與細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的問(wèn)題(Horwitz等人，2001；Orlic等人，2001；Stamm等人，2003；Strauer等人，2002)。然而，臨床益處已經(jīng)是次最優(yōu)的，結(jié)果幾乎當(dāng)然與骨髓中本質(zhì)上可得到的有限ASC劑量和純度有關(guān)。
最近，脂肪組織已經(jīng)成為干細(xì)胞的來(lái)源(Zuk等人，2001；Zuk等人，2002)。脂肪組織(不同于骨髓、皮膚、肌肉、肝臟和大腦)可以比較大的量比較容易地采集，并且發(fā)病率較低(Commons等人，2001；Katz等人，2001b)。然而，在現(xiàn)有技術(shù)中缺乏用于采集源自脂肪的干細(xì)胞的合適方法?，F(xiàn)有方法具有許多的缺點(diǎn)。例如，現(xiàn)有方法會(huì)缺乏部分的或完全的自動(dòng)操作，部分的或完全地封閉的系統(tǒng)，部件的可處理性，等等。
由于源自脂肪的干細(xì)胞治療PVD的治療潛力，因此在本領(lǐng)域中需要一種用于從產(chǎn)生成熟干細(xì)胞群體的脂肪組織中采集細(xì)胞的方法，其具有增加的產(chǎn)率、一致性和/或純度，并且可以快速地和可靠地操作，而很少需要或不需要抽取后的操作。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及再生細(xì)胞，例如成熟干細(xì)胞和祖細(xì)胞，其可用于治療PVD和相關(guān)的疾病或病癥。本發(fā)明也涉及用于從組織、如脂肪組織中分離和濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及再生細(xì)胞的組合物，以便治療PVD和相關(guān)的疾病或病癥。因此，在一個(gè)一般實(shí)施例中，本發(fā)明涉及使用源自組織的再生細(xì)胞的組合物、方法和系統(tǒng)，所述再生細(xì)胞連同添加劑一起直接地置于受者中，這種添加劑對(duì)于促進(jìn)、引起或支持治療益處而言是必要的。
在特定的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及通過(guò)給予、優(yōu)選通過(guò)注射一定濃度的再生細(xì)胞治療PVD和相關(guān)的疾病和病癥、血管缺陷或病癥、冠外組織病癥、周?chē)鷦?dòng)脈疾病、動(dòng)脈硬化和炎性動(dòng)脈炎的方法。再生細(xì)胞可由例如干細(xì)胞、祖細(xì)胞或它們的組合組成。在某些實(shí)施例中，可能需要給予多劑量的再生細(xì)胞，以便得到治療益處。另外，添加劑例如一種或多種生長(zhǎng)因子可與再生細(xì)胞一起給予。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，再生細(xì)胞連同單獨(dú)的血管生成性生長(zhǎng)因子一起給予，或與其它添加劑聯(lián)合給予。再生細(xì)胞也可連同一種或多種免疫抑制藥物一起給予。
給予再生細(xì)胞的途徑在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和皮下給予途徑?？山o予細(xì)胞至例如患者的脈管系統(tǒng)中。細(xì)胞也可經(jīng)由支架來(lái)給予，例如本領(lǐng)域中已知的可吸收支架。
在給予至患者之前，再生細(xì)胞可以細(xì)胞培養(yǎng)方式來(lái)生長(zhǎng)，以便例如促進(jìn)朝著血管生成和/或內(nèi)皮表型的分化。細(xì)胞培養(yǎng)可在支架材料、例如可吸收支架上進(jìn)行，以便產(chǎn)生兩維或三有維結(jié)構(gòu)，其可置于患者身上或體內(nèi)。在給予至患者之前，細(xì)胞也可通過(guò)基因轉(zhuǎn)移來(lái)修飾，使得在修飾的再生細(xì)胞中，改變了一種或多種基因、例如血管生成基因或凋亡基因的表達(dá)。
本發(fā)明也涉及高度通用性的系統(tǒng)和方法，其能夠從給定的組織中分離和濃縮再生細(xì)胞，例如干細(xì)胞和祖細(xì)胞，這種細(xì)胞適合于重新注入對(duì)象中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，系統(tǒng)是自動(dòng)化的。本發(fā)明的系統(tǒng)一般包括一個(gè)或多個(gè)采集室，處理室，廢物室，輸出室和樣品室。各種室經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)管連在一起，使得含有生物材料的流體可在封閉的、無(wú)菌的流體/組織通路中從一個(gè)室通往另一室。在某些實(shí)施例中，廢物室、輸出室和樣品室是可選的。在一個(gè)實(shí)施例中，從組織抽取至處理以及將器件放置入接受者內(nèi)的整個(gè)程序?qū)⑷吭谕谎b置內(nèi)進(jìn)行，實(shí)際上，甚至在接受該程序的患者的同一房間內(nèi)進(jìn)行。
因此，在一個(gè)實(shí)施例中，治療患有PVD或相關(guān)疾病或病癥的患者的方法包括步驟a)提供組織摘取系統(tǒng)；b)使用組織摘取系統(tǒng)從患者摘取脂肪組織，脂肪組織具有一定濃度的干細(xì)胞；c)處理至少一部分脂肪組織，以便所獲得再生細(xì)胞的濃度不同于處理前脂肪組織的再生細(xì)胞的濃度；和d)將再生細(xì)胞給予、優(yōu)選注射入患者，而無(wú)需在給予至患者之前由組織摘取系統(tǒng)中移出再生細(xì)胞。
本文所述的任何特征或特征組合包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要從上下文、本說(shuō)明書(shū)和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)中不會(huì)顯而易見(jiàn)地認(rèn)出包括在任何這種組合中的特征是相互不一致的。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和方面從以下詳細(xì)描述中是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)介


圖1是用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的視圖，其包括一個(gè)過(guò)濾器組件。
圖2是類(lèi)似于
圖1的系統(tǒng)的視圖，其具有呈串聯(lián)構(gòu)造的多個(gè)過(guò)濾器組件。
圖3是類(lèi)似于
圖1的系統(tǒng)的視圖，其具有呈并聯(lián)構(gòu)造的多個(gè)過(guò)濾器組件。
圖4是用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的視圖，其包括離心室。
圖5是采集室的剖視圖，其包括用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)中所使用的前置過(guò)濾器。
圖6是用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的處理室的剖視圖，其采用了滲透過(guò)濾系統(tǒng)。
圖7是用于分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的處理室的剖視圖，其采用用于濃縮再生細(xì)胞的離心器件。
圖8是圖7所示處理室的另一剖視圖。
圖9.1、9.2和9.3顯示了與本發(fā)明的系統(tǒng)一起使用的淘析部件。
圖10是用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的視圖，其采用了真空壓力以用于驅(qū)動(dòng)流體通過(guò)系統(tǒng)。真空系統(tǒng)可通過(guò)將真空泵或真空源施加在系統(tǒng)的出口上來(lái)構(gòu)成，并且控制在預(yù)定的流率下以便抽吸組織和流體通過(guò)，使用活塞、排氣口和夾鉗的系統(tǒng)來(lái)控制流動(dòng)的方向和定時(shí)。
圖11是用于從組織中分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)的視圖，其采用了正壓力來(lái)驅(qū)動(dòng)流體通過(guò)系統(tǒng)。正壓力系統(tǒng)使用機(jī)械機(jī)構(gòu)如蠕動(dòng)泵來(lái)推動(dòng)或推進(jìn)流體和組織以確定的流率通過(guò)系統(tǒng)，其中使用閥、活塞、排氣口和夾鉗來(lái)控制流動(dòng)的方向和定時(shí)。
圖12A顯示了過(guò)濾過(guò)程，其中流體的進(jìn)給流相切于過(guò)濾器的細(xì)孔而流動(dòng)。
圖12B顯示了過(guò)濾過(guò)程，其中流體的進(jìn)給流垂直于過(guò)濾器的細(xì)孔而流動(dòng)。
圖13是用于本發(fā)明的系統(tǒng)的一次性組的示例性視圖。
圖14是用于本發(fā)明的系統(tǒng)的可再用部件的示例性視圖。
圖15A是本發(fā)明的器件的示例性視圖，其采用
圖13所示的一次性組和
圖14所示的可再用部件組裝而成。
圖15B是流程圖，描述了通過(guò)軟件程序執(zhí)行的示例性預(yù)定程序的步驟，其控制本發(fā)明系統(tǒng)的自動(dòng)化實(shí)施例。顯示了兩個(gè)備選處理參數(shù)，從而說(shuō)明了系統(tǒng)的通用性。
圖16A和16B描述了通過(guò)培養(yǎng)的源自脂肪的干細(xì)胞所表達(dá)的VEGF(5A)和PIGF(5B)蛋白質(zhì)。
圖17描述了檢測(cè)源自脂肪的干細(xì)胞群中的內(nèi)皮祖細(xì)胞。
圖18A和18B描述了在正常的(7A)和鏈佐星處理過(guò)的(7B)小鼠中血管結(jié)構(gòu)的體外發(fā)育。
圖19描述了與陰性對(duì)照相比，用源自脂肪的干細(xì)胞治療后的后肢局部缺血小鼠中血流的平均恢復(fù)增加了。
圖20A和20B顯示，增加源自脂肪的干細(xì)胞劑量改善了移植物存活和血管生成(20A)，并且描述了在組織標(biāo)本中脂肪組織結(jié)構(gòu)的保留(20B)。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了使用源自脂肪的再生細(xì)胞(″ADC″)來(lái)治療PVD的方法。PVD一般源自動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，其中血管的動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄其自身會(huì)導(dǎo)致一定程度的組織局部缺血，同時(shí)增加臨床上嚴(yán)重灌注不足的可能性，這種不足是狹窄部位的凝塊堆積或其它栓塞所導(dǎo)致的。局部缺血導(dǎo)致通常由現(xiàn)堵塞血管灌注的組織中的代謝性機(jī)能障礙(不足以滿足要求的氧供應(yīng))，這在嚴(yán)重形式或進(jìn)行性形式中可導(dǎo)致壞死過(guò)程。本發(fā)明部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即，本發(fā)明的再生細(xì)胞(1)表達(dá)了血管生成性生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，包括PIGF、VEGF、bFGF、IGF-II、Eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IL-12p40/p70、IL-12p70、IL-13、IL-6、IL-9、瘦蛋白、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-1、TIMP-2、TNF-α和血小板生成素，(2)包括內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，其在血管形成中具有確鑿的功能，(3)體外發(fā)育成為血管，和(4)體內(nèi)支持局部缺血組織存活。因此，本發(fā)明的再生細(xì)胞可用于通過(guò)例如促進(jìn)血管生成來(lái)治療PVD。
本發(fā)明也涉及用于分離和濃縮再生細(xì)胞的快速且可靠的系統(tǒng)和方法，再生細(xì)胞例如為來(lái)自于各種組織的干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞，組織包括但不限于脂肪、骨髓、血液、皮膚、肌肉、肝臟、結(jié)締組織、筋膜、大腦和其它神經(jīng)系統(tǒng)組織、血管以及其它軟組織或液體組織或組織成分或組織混合物(例如包括皮膚、血管、脂肪和結(jié)締組織的組織混合物)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，系統(tǒng)從脂肪組織中分離和濃縮再生細(xì)胞。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，系統(tǒng)是自動(dòng)化的，使得整個(gè)方法可伴隨最少的用戶(hù)干預(yù)或?qū)I(yè)知識(shí)而進(jìn)行。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中，使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法獲得的再生細(xì)胞適合于直接置入遭受PVD或相關(guān)疾病或病癥的接受者中，從該接受者中抽取了該組織。
優(yōu)選的是，整個(gè)程序，從組織抽取到分離、濃縮和將再生細(xì)胞放置(例如注射)到接受者中，將全部在同一裝置中進(jìn)行，實(shí)際上，甚至在接受程序的患者房間內(nèi)進(jìn)行。再生細(xì)胞可在抽取和濃縮后的相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。例如，再生細(xì)胞可在從患者采集組織后的大約一小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備好，在某些情況下，可在從采集組織后的大約10至40分鐘內(nèi)準(zhǔn)備好。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，再生細(xì)胞可在從采集組織后的大約20分鐘內(nèi)準(zhǔn)備好。從抽取至分離和濃縮的整個(gè)程序長(zhǎng)度可根據(jù)許多因素而變化，包括患者體形、所采集組織的類(lèi)型和要求用于給定治療應(yīng)用的再生細(xì)胞的量。細(xì)胞也可連同其它細(xì)胞、組織、組織碎片、支架或其它細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化刺激劑一起在單個(gè)操作程序中置于接受者的體內(nèi)，以便將治療、結(jié)構(gòu)或美容益處提供給接受者?？梢岳斫?，再生細(xì)胞在系統(tǒng)的分離和濃縮階段之外的任何進(jìn)一步操作將要求額外的時(shí)間來(lái)對(duì)應(yīng)于這種操作方式。
為了可更容易地理解本發(fā)明，首先定義某些用語(yǔ)。另外的定義在整個(gè)詳細(xì)描述中進(jìn)行闡述。
本文所使用的″再生細(xì)胞″指的是使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法獲得的任何異質(zhì)或同質(zhì)細(xì)胞，本發(fā)明的系統(tǒng)和方法導(dǎo)致或有助于器官、組織、生理單元或系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)或功能的完全或部分再生、恢復(fù)或替換，因而提供了治療、結(jié)構(gòu)或美容的益處。再生細(xì)胞的示例包括ASC、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、分化或去分化的脂肪細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、單能和多能祖細(xì)胞和前體細(xì)胞(和它們的后代)，以及淋巴細(xì)胞。
再生細(xì)胞可提供治療、結(jié)構(gòu)或美容益處的一種機(jī)理是通過(guò)將它們自身或它們的后代結(jié)合到新生的、現(xiàn)有的或修復(fù)的組織或組織成分中。例如，ASC和/或它們的后代可結(jié)合到新生的骨骼、肌肉或其它結(jié)構(gòu)性或功能性組織中，因而導(dǎo)致或有助于治療、結(jié)構(gòu)或美容的改善。類(lèi)似地，內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮前體細(xì)胞或祖細(xì)胞和它們的后代可結(jié)合到現(xiàn)有的、新生的、修復(fù)的或擴(kuò)展的血管中，因而導(dǎo)致或有助于治療、結(jié)構(gòu)或美容的益處。
再生細(xì)胞可提供治療、結(jié)構(gòu)或美容的益處的另一機(jī)理是通過(guò)表達(dá)和/或分泌分子例如生長(zhǎng)因子，其促進(jìn)給定組織或組織成分的結(jié)構(gòu)或功能的產(chǎn)生、保留、恢復(fù)和/或再生。例如，再生細(xì)胞可表達(dá)和/或分泌分子，其導(dǎo)致組織或細(xì)胞的生長(zhǎng)增強(qiáng)，這又直接地或間接地參與了結(jié)構(gòu)或功能的改善。再生細(xì)胞可表達(dá)和/或分泌生長(zhǎng)因子，包括例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PIGF)、bFGF、IGF-11、Eotaxin、G-CSF、GM-CSF、IL-12p40/p70、IL-12p70、IL-13、IL-6、IL-9、瘦蛋白、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-1、TIMP-2、TNF-α、血小板生成素，以及它們的同工型，其可執(zhí)行一種或多種以下功能刺激新血管的發(fā)育，即促進(jìn)血管生成；通過(guò)擴(kuò)大它們的血液攜帶容量來(lái)改善現(xiàn)有小血管(側(cè)支)的氧供應(yīng)；誘發(fā)再生細(xì)胞從遠(yuǎn)離受損部位的位置的活動(dòng)，以便因而增強(qiáng)這種細(xì)胞引導(dǎo)和遷移至受損部位；刺激生長(zhǎng)和/或促進(jìn)細(xì)胞在受損部位的存活，因而促進(jìn)功能或結(jié)構(gòu)的保留；傳送具有抗凋亡性能的分子，因而減少細(xì)胞死亡和永久喪失功能的速率或可能性；以及與內(nèi)源再生細(xì)胞和/或其它生理機(jī)制相互作用。
再生細(xì)胞可以它們′天然′存在的形式來(lái)使用，或者利用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法從組織中分離和濃縮，或者它們可通過(guò)以下方式修飾通過(guò)用生長(zhǎng)因子或其它生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑刺激或灌注，通過(guò)基因轉(zhuǎn)移(瞬時(shí)的或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)移)，通過(guò)基于物理性能(例如大小或密度)進(jìn)一步再分級(jí)所得群體，與固相材料的差異性粘附，表達(dá)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)分子，細(xì)胞培養(yǎng)或其它體外或體內(nèi)操作、修飾或分級(jí)，如本文進(jìn)一步所述。再生細(xì)胞也可連同其它細(xì)胞或器件一起使用，例如合成的或生物學(xué)的支架，用于傳送修飾或增強(qiáng)細(xì)胞相關(guān)特性的因子、藥物、化學(xué)物質(zhì)或其它試劑的材料或器件，如本文中進(jìn)一步所述。
本文所使用的″再生細(xì)胞組合物″指的是在組織如脂肪組織被洗滌和至少部分地解集之后，一般存在于一定體積液體內(nèi)的細(xì)胞組合物。例如，本發(fā)明的再生細(xì)胞組合物包含多種不同類(lèi)型的再生細(xì)胞，包括ASC、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、分化或去分化的脂肪細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、單能和多能祖細(xì)胞和前體細(xì)胞(和它們的后代)，以及淋巴細(xì)胞。再生細(xì)胞組合物也可包含一種或多種雜質(zhì)，例如膠原，其可存在于組織碎片中，或者在本文所述的組織解集過(guò)程中使用的或因該過(guò)程導(dǎo)致的殘余膠原酶或其它酶或試劑。
本文所使用的″再生藥物″指的是任何治療、結(jié)構(gòu)或美容方面的益處，其源自將再生細(xì)胞直接地或間接地置于接受者體內(nèi)。本文所使用的″周?chē)芗膊?PVD)″指的是心臟和大腦外血管的疾病和循環(huán)病癥，包括但不限于功能性PVD、器質(zhì)性PVD、周?chē)鷦?dòng)脈疾病(PAD)、動(dòng)脈硬化性堵塞性疾病、動(dòng)脈硬化、血管外傷和炎性動(dòng)脈炎。具體而言，常常PVD的特征為將血液輸送至腿部和手臂肌肉的血管的狹窄。例如，在類(lèi)似于冠狀動(dòng)脈疾病和頸動(dòng)脈疾病的PAD中，脂肪沉積物沿著動(dòng)脈壁積聚并且影響血液循環(huán)，主要是在通往腿部和足部的動(dòng)脈中?；加蠵AD的人們因血液凝塊的風(fēng)險(xiǎn)，具有死于中風(fēng)和心臟病發(fā)作的較高風(fēng)險(xiǎn)。
本文所使用的用語(yǔ)″血管生成″指的是新血管由現(xiàn)有脈管系統(tǒng)和組織產(chǎn)生的過(guò)程(Folkman，1995)。用語(yǔ)″修復(fù)或重塑″指的是現(xiàn)有脈管系統(tǒng)的重新形成。組織局部缺血的緩解決定性地依賴(lài)于血管生成。新血管的自然生長(zhǎng)在局部缺血部位中及其周?chē)峁┝藗?cè)支循環(huán)，改善了血流，并且緩解了局部缺血所導(dǎo)致的癥狀。血管生成緩解的疾病和病癥包括急性心肌梗塞、局部缺血性心肌病、周?chē)芗膊　⒕植咳毖灾酗L(fēng)、急性血管壞死、局部缺血的創(chuàng)傷(包括AFT)、膿毒病、局部缺血性腸疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病和腎病、血管炎、局部缺血性腦病、勃起障礙生理疾病、局部缺血性或創(chuàng)傷性脊髓損傷、多器官系統(tǒng)衰竭、局部缺血性牙齦疾病和移植相關(guān)的局部缺血。
本文所使用的″干細(xì)胞″指的是多能再生細(xì)胞，其具有分化成各種其它細(xì)胞類(lèi)型的潛力，并且可執(zhí)行一種或多種特定功能，而且具有自我更新的能力。本文所公開(kāi)的其中一些干細(xì)胞可具有多能性。
本文所使用的″祖細(xì)胞″指的是多能再生細(xì)胞，其具有分化成一種以上細(xì)胞類(lèi)型的潛力，并且具有有限的或沒(méi)有自我更新能力。本文所使用的″祖細(xì)胞″也指單能細(xì)胞，其具有分化成僅僅單一細(xì)胞類(lèi)型的潛力，并且執(zhí)行一種或多種特定功能，具有有限的或沒(méi)有自我更新能力。特別是，本文所使用的″內(nèi)皮祖細(xì)胞″指的是具有分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛力的多能或單能細(xì)胞。
本文所使用的″前體細(xì)胞″指的是單能再生細(xì)胞，其能夠分化成一個(gè)細(xì)胞類(lèi)型。前體細(xì)胞和它們的后代可保留較廣泛的增殖能力，例如淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其可在適當(dāng)?shù)臈l件下增殖。
本文所使用的用語(yǔ)″血管生成因子″或″血管生成蛋白質(zhì)″指的是任何已知的蛋白質(zhì)、肽或其它試劑，其能夠促進(jìn)新血管從現(xiàn)有脈管系統(tǒng)中生長(zhǎng)出(″血管生成″)。本發(fā)明中所使用的合適血管生成因子包括但不限于胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(Luttun等人，2002)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Aharinejad等人，1995)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Buschmann等人，2003)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-A、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(Mints等人，2002)、神經(jīng)氈蛋白(Wang等人，2003)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6(Botta等人，2000)、促血管生成素1，促血管生成素2(Sundberg等人，2002)、促紅細(xì)胞生成素(Ribatti等人，2003)、BMP-2、BMP-4、BMP-7(Carano和Filvaroff，2003)、TGF-β(Xiong等人，2002)、IGF-1(Shigematsu等人，1999)、骨橋蛋白(Asou等人，2001)、多效營(yíng)養(yǎng)因子(Beecken等人，2000)、苯丙酸諾龍(Lamouille等人，2002)、內(nèi)皮縮血管肽-1(Bagnato和Spinella，2003)和它們的組合。血管生成因子可單獨(dú)地起作用，或連同另一因子起作用。當(dāng)組合起來(lái)時(shí)，血管生成因子也可協(xié)同作用，因而這些因子的組合效果大于分開(kāi)采用單獨(dú)因子的效果總和。用語(yǔ)″血管生成因子″或″血管生成蛋白質(zhì)″還包含這種因子的功能類(lèi)似物。功能類(lèi)似物包括例如因子的功能性部分。功能類(lèi)似物還包括抗獨(dú)特型抗體，其結(jié)合因子的受體，并且因此而模擬了因子在促進(jìn)血管生成和/或組織重塑中的活性。用于產(chǎn)生這種抗獨(dú)特型抗體的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且例如在WO97/23510中進(jìn)行了介紹，其內(nèi)容通過(guò)引用而結(jié)合于本文中。
用于本發(fā)明的血管生成因子可從任何合適源來(lái)產(chǎn)生或獲得。例如，因子可由它們的天然來(lái)源進(jìn)行提純，或合成產(chǎn)生，或通過(guò)重組表達(dá)。因子可作為蛋白質(zhì)組合物給予患者?；蛘?，因子可以編碼因子的表達(dá)質(zhì)粒形式來(lái)給予。合適表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)造是本領(lǐng)域中眾所周知的。用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的合適載體包括例如，腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體、腺伴隨病毒載體、RNA載體、脂質(zhì)體、陽(yáng)離子脂質(zhì)、慢病毒(Ientiviral)載體和轉(zhuǎn)座子。
本文所使用的用語(yǔ)″動(dòng)脈生成″指的是改善從現(xiàn)有小動(dòng)脈連接處生長(zhǎng)側(cè)支動(dòng)脈和/或其它動(dòng)脈的過(guò)程(Carmeliet，2000；Scholz等人，2001；Scholz等人，2002)。更具體地說(shuō)，動(dòng)脈生成是動(dòng)脈的原位募集和擴(kuò)展，這是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞從供應(yīng)血液至局部缺血組織、腫瘤或炎癥部位的現(xiàn)有小動(dòng)脈連接處增殖實(shí)現(xiàn)的。這些血管主要在受影響組織外生長(zhǎng)，并且對(duì)于傳送養(yǎng)分至局部缺血的區(qū)域、腫瘤或炎癥部位而言是很重要的。動(dòng)脈生成是對(duì)心肌局部缺血的正常反應(yīng)部分(Mills等人，2000；Monteiro等人，2003)。另外，冠狀動(dòng)脈旁路移植(CABG)的常用手術(shù)技術(shù)實(shí)際上只是產(chǎn)生人造側(cè)支血管(Sergeant等人，1997)。因此，在梗塞之后增強(qiáng)動(dòng)脈生成的過(guò)程將改善血流流向局部缺血的組織，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡減少以及梗塞尺寸變小。這些改善將導(dǎo)致心臟功能改善和治療益處。
本文所使用″干細(xì)胞數(shù)量″或″干細(xì)胞頻率″指的是在集落生成試驗(yàn)中觀察到的集落數(shù)量，其中源自脂肪的細(xì)胞(ADC)以低細(xì)胞密度(＜10000細(xì)胞/孔)下涂布平板，并且在支持MSC生長(zhǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(例如DMEM/F12培養(yǎng)基，其補(bǔ)充有10％胎牛血清、5％馬血清和抗生素/抗真菌劑)。細(xì)胞生長(zhǎng)兩個(gè)星期，之后，將培養(yǎng)物用蘇木精染色，將超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的集落計(jì)數(shù)為CFU-F。干細(xì)胞頻率計(jì)算成每100個(gè)平板涂布的有核細(xì)胞中觀察到的CFU-F數(shù)量(例如開(kāi)始有1000個(gè)有核再生細(xì)胞的平板上計(jì)數(shù)有15個(gè)集落即為1.5％的干細(xì)胞頻率)。干細(xì)胞數(shù)量計(jì)算成干細(xì)胞頻率乘以獲得的有核ADC細(xì)胞的總數(shù)量。高百分比(大約100％)的由再生細(xì)胞生長(zhǎng)出的CFU-F表達(dá)細(xì)胞表面分子CD105，其也由源自骨髓的干細(xì)胞表達(dá)(Barry等人，1999)。CD105也由源自脂肪組織的干細(xì)胞表達(dá)(Zuk等人，2002)。
本文所使用的用語(yǔ)″脂肪組織″指的是脂肪，包括儲(chǔ)存脂肪的結(jié)締組織。脂肪組織包含多種再生細(xì)胞類(lèi)型，包括ASC和內(nèi)皮祖細(xì)胞和前體細(xì)胞。
本文所使用的用語(yǔ)″脂肪組織單元″指的是分散的或可測(cè)量的脂肪組織量。脂肪組織單元可通過(guò)確定單元的重量和/或體積來(lái)測(cè)量。基于以上鑒定的數(shù)據(jù)，從患者取得的經(jīng)處理的脂肪抽取物單元具有這樣的細(xì)胞組分，其中至少0.1％的細(xì)胞組合物是干細(xì)胞；也就是說(shuō)，它具有如上所述確定的至少0.1％的干細(xì)胞頻率。關(guān)于本文的公開(kāi)，脂肪組織單元可指從患者取得的脂肪組織的全部量，或者不到從患者取得的脂肪組織的全部量。因此，脂肪組織單元可與另一脂肪組織單元相組合，以形成具有單獨(dú)單元總和的重量或體積的脂肪組織單元。
本文所使用的用語(yǔ)″部分″指的是小于全部的材料量。小部分指的是不到50％的量，主要部分指的是大于50％的量。因此，不到從患者取得的脂肪組織全部量的脂肪組織單元是一部分所取下的脂肪組織。
本文所使用的用語(yǔ)″經(jīng)處理的脂肪抽取物″指的是脂肪組織，其已經(jīng)被處理，以便從成熟脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織中分離出活性細(xì)胞組分(例如含有再生物的成分)。這部分在本文中稱(chēng)為″源自脂肪的細(xì)胞″或″ADC″。典型地，ADC指的是從脂肪組織中通過(guò)洗滌、分離和濃縮細(xì)胞獲得的再生細(xì)胞沉淀。一般通過(guò)離心細(xì)胞的懸浮物，使得細(xì)胞聚集在離心室或細(xì)胞濃縮器的底部，來(lái)獲得沉淀。
本文所使用的用語(yǔ)″給予″、″引入″、″傳送″、″放置″和″移植″在本文中可互換地使用，指的是例如在各種情形下，通過(guò)將本發(fā)明的再生細(xì)胞放置、例如注射對(duì)象中，所采用的方法或途徑至少部分導(dǎo)致再生細(xì)胞在所需部位定位。再生細(xì)胞可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)耐緩絹?lái)給予，其導(dǎo)致傳送至對(duì)象中的所需位置，其中至少一部分細(xì)胞或細(xì)胞成分保持存活。細(xì)胞在給予對(duì)象之后的存活期可短至若干小時(shí)、例如24小時(shí)至若干天，甚至長(zhǎng)達(dá)若干年。
本文所使用的用語(yǔ)″治療″包括減輕或緩解疾病或病癥的至少一種負(fù)面影響或癥狀。
本文所使用的″治療有效劑量的再生細(xì)胞″指的是足以帶來(lái)有益或所需臨床效果的再生細(xì)胞量。所述劑量可在一次或多次給予中給予。然而，精確確定所謂的有效劑量可基于各患者獨(dú)有的因素，包括但不限于患者的年齡、體形、疾病的類(lèi)型或嚴(yán)重程度、疾病階段、給予再生細(xì)胞的途徑、所使用的輔助治療的類(lèi)型或程度、正在進(jìn)行的疾病過(guò)程和所需治療的類(lèi)型(例如，積極治療與常規(guī)治療)。
本文所使用的用語(yǔ)″對(duì)象″包括溫血?jiǎng)游?，?yōu)選哺乳動(dòng)物，包括人。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，對(duì)象是靈長(zhǎng)類(lèi)。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，對(duì)象是人。
如上所述，再生細(xì)胞，例如干細(xì)胞和祖細(xì)胞，可從多種組織中采集。本發(fā)明的系統(tǒng)可用于全部這種組織。然而，脂肪組織尤其是再生細(xì)胞的豐富來(lái)源。因此，本發(fā)明的系統(tǒng)在本文中顯示為使用脂肪組織作為再生細(xì)胞的來(lái)源，這僅僅是通過(guò)示例的方式，而沒(méi)有限制性。
脂肪組織可通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法獲得。例如，脂肪組織可通過(guò)吸脂術(shù)(注射器或動(dòng)力輔助)或通過(guò)脂肪切除術(shù)從患者取得，脂肪切除術(shù)例如抽吸輔助的脂肪整形術(shù)(Iipoplasty)、超聲輔助的脂肪整形術(shù)、以及脂肪切除術(shù)或它們的組合。脂肪組織被取下并采集起來(lái)，并且可根據(jù)本丈所述的本發(fā)明系統(tǒng)的任何實(shí)施例來(lái)處理。采集的組織的量取決于許多因素，包括體重指數(shù)和供體年齡、用于采集的時(shí)間、所接近的脂肪組織采集部位的可得到性、伴隨的和現(xiàn)有的療法和病況(例如抗凝血?jiǎng)┲委?以及采集組織的臨床目的。例如，從較瘦個(gè)體中抽取的100毫升脂肪組織的再生細(xì)胞百分比大于從肥胖供體中抽取的百分比(表1)。這可能反映了肥胖個(gè)體中較多脂肪含量的稀釋效果。因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，與從較瘦患者抽取的量相比，需要從超重供體獲得更大量的組織。這一觀察結(jié)果也表明，本發(fā)明的應(yīng)用不限于具有大量脂肪組織的個(gè)體。
表1體重指數(shù)對(duì)組織和細(xì)胞產(chǎn)量的影響
在脂肪組織被處理之后，所得再生細(xì)胞基本上沒(méi)有成熟脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織。因此，本發(fā)明的系統(tǒng)產(chǎn)生了異質(zhì)的多個(gè)源自脂肪的再生細(xì)胞，其可用于研究和/或治療目的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞適合于放置或重新注入接受者的體內(nèi)。在其它實(shí)施例中，細(xì)胞可用于研究，例如，細(xì)胞可用于建立干細(xì)胞或祖細(xì)胞系，其可存活較長(zhǎng)一段時(shí)間并且用于進(jìn)一步研究。
現(xiàn)在將詳細(xì)參考本發(fā)明的當(dāng)前優(yōu)選實(shí)施例，其示例在附圖中顯示。只要有可能，相同的或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)在附圖和描述中指的是相同的或類(lèi)似的部件。應(yīng)注意到，附圖是采用簡(jiǎn)化的形式，并未精確地按照比例繪制。關(guān)于本文的公開(kāi)，僅僅出于方便和清楚的目的，方向用語(yǔ)，例如頂部，底部，左邊，右邊，上，下，上方，以上，以下，下方，后面，前面，遠(yuǎn)端和近端是相對(duì)于附圖來(lái)使用的。這種方向用語(yǔ)不應(yīng)解釋為以任何方式限制了本發(fā)明的范圍。
盡管本文的公開(kāi)指的是某些實(shí)施例，但是可以理解，這些實(shí)施例是通過(guò)示例的方式和并非通過(guò)限制的方式來(lái)呈現(xiàn)的。盡管討論了示例性的實(shí)施例，但是，以下詳細(xì)描述的內(nèi)容應(yīng)解釋為覆蓋了所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的實(shí)施例的全部修改、備選和等效形式。本發(fā)明可連同本領(lǐng)域中傳統(tǒng)使用的各種醫(yī)學(xué)方法一起使用。
現(xiàn)在參見(jiàn)附圖，本發(fā)明的系統(tǒng)10一般包括一個(gè)或多個(gè)組織采集室20，處理室30，廢物室40，輸出室50和樣品室60。各種室經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)管12連在一起，使得含有生物材料的流體可從一個(gè)室通往另一室，同時(shí)保持封閉的、無(wú)菌的流體/組織通路。導(dǎo)管可包括剛性的或柔性的主體，其在本文中分別可互換地稱(chēng)為管腔和管子。在某些實(shí)施例中，導(dǎo)管為柔性管子的形式，例如傳統(tǒng)上用于臨床設(shè)置的聚乙烯管子，硅酮或本領(lǐng)域中已知的任何其它材料。導(dǎo)管12可根據(jù)是否需要通過(guò)流體或組織而在大小上變化。導(dǎo)管12也可取決于循環(huán)通過(guò)系統(tǒng)的組織或流體的量而在大小上變化。例如，對(duì)于流體的通過(guò)而言，導(dǎo)管可具有從大約0.060至大約0.750英寸的直徑，對(duì)于組織的通過(guò)而言，導(dǎo)管可具有從0.312至0.750英寸的直徑。一般，導(dǎo)管的大小選擇成平衡導(dǎo)管可容納的體積和輸送組織或流體通過(guò)所述導(dǎo)管所要求的時(shí)間。在系統(tǒng)的自動(dòng)化實(shí)施例中，前述參數(shù)即輸送的體積和時(shí)間必須被識(shí)別，使得適當(dāng)?shù)男盘?hào)可傳送至系統(tǒng)的處理器件。這允許器件將精確體積的液體和組織從一個(gè)室移動(dòng)至另一室。使用的可彎曲的管子應(yīng)能夠抵抗負(fù)壓力以減少潰縮的可能性。使用的柔性管子還應(yīng)能夠抵抗正壓力，該正壓力通過(guò)例如可用于系統(tǒng)的正排量泵來(lái)產(chǎn)生。
系統(tǒng)的所有室可包括一個(gè)或多個(gè)端口，例如，出口22或入口21端口，其接受標(biāo)準(zhǔn)的IV號(hào)注射器和抽吸管子連接件。端口可為密封端口，例如橡膠隔片封閉的注射器針頭連接端口51。入口端口可通過(guò)導(dǎo)管而連在一個(gè)或多個(gè)套管(未示出)上。例如，組織入口端口21可連在集成的一次使用吸脂套管上，并且導(dǎo)管可為柔性的管子。導(dǎo)管一般定位成提供從系統(tǒng)的一個(gè)室至另一室的流體通路。朝著這一端，導(dǎo)管和端口可連在例如可人工地或自動(dòng)地操作的抽吸器件(未示出)上。抽吸器件例如可為注射器或電動(dòng)泵。抽吸器件應(yīng)能夠提供足夠的負(fù)壓力，以便從患者吸出組織。一般可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員例如手術(shù)醫(yī)生已知的任何合適抽吸器件。
導(dǎo)管12還可包括一個(gè)或多個(gè)夾鉗(未示出)，以便控制材料在系統(tǒng)的各種部件流動(dòng)。夾鉗可通過(guò)有效地密封系統(tǒng)的不同區(qū)域用于保持系統(tǒng)的無(wú)菌性?；蛘撸瑢?dǎo)管12可包括一個(gè)或多個(gè)閥14，其控制材料在系統(tǒng)中的流動(dòng)。閥14在圖中被識(shí)別為開(kāi)環(huán)。在優(yōu)選實(shí)施例中，閥可為機(jī)電節(jié)流閥。在另一實(shí)施例中，閥可為氣動(dòng)閥。在其它實(shí)施例中，該閥可為液壓閥或機(jī)械閥。這種閥優(yōu)選通過(guò)可連在控制桿上的控制系統(tǒng)來(lái)啟動(dòng)?？刂茥U可被人工地操縱，使控制桿被啟動(dòng)。在自動(dòng)化的實(shí)施例中，控制系統(tǒng)可連在控制桿以及連在處理器件上，該處理器件可在預(yù)定的啟動(dòng)條件下啟動(dòng)閥。在某些自動(dòng)化的實(shí)施例中，閥的啟動(dòng)可以是部分自動(dòng)化的，并且部分地受到使用者的偏愛(ài)，使得過(guò)程可被優(yōu)化。在其它實(shí)施例中，某些閥可被人工地啟動(dòng)，其它閥則通過(guò)處理器件自動(dòng)地啟動(dòng)。閥14也可連同一個(gè)或多個(gè)泵一起使用，例如蠕動(dòng)泵34或正排量泵(未示出)。導(dǎo)管12和/或閥14也可包括傳感器29，例如，光學(xué)傳感器，超聲波傳感器，壓力傳感器或本領(lǐng)域中已知的其它形式的監(jiān)控器，其能夠區(qū)分各種流過(guò)系統(tǒng)的流體成分和流體液面。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，傳感器29可為光學(xué)傳感器。
該系統(tǒng)還可包括多個(gè)過(guò)濾器36。在某些實(shí)施例中，過(guò)濾器可處于系統(tǒng)28的室內(nèi)。系統(tǒng)內(nèi)的不同室可包括不同的過(guò)濾器。過(guò)濾器可有效地用于從不合乎需要的細(xì)胞和可根據(jù)系統(tǒng)使用的解集試劑中來(lái)分離再生細(xì)胞，例如干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，過(guò)濾器組件36包括中空纖維過(guò)濾器件。在另一實(shí)施例中，過(guò)濾器組件36包括滲透過(guò)濾器件，其可以與或不與沉淀過(guò)程一起使用。在另一實(shí)施例中，過(guò)濾器組件36包括離心器件，其可以與或不與淘析器件和過(guò)程一起使用。在另外一個(gè)實(shí)施例中，系統(tǒng)包括這些過(guò)濾器件的組合。本發(fā)明的過(guò)濾功能可為雙層的，其中一些過(guò)濾器從最終的濃縮物中去掉非所需物質(zhì)如膠原、游離脂質(zhì)、游離脂肪細(xì)胞和殘余膠原酶，而其它過(guò)濾器用于濃縮最終的產(chǎn)品。系統(tǒng)的過(guò)濾器可包括多個(gè)細(xì)孔，其直徑和/或長(zhǎng)度為20至800微米。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，采集室20具有前置過(guò)濾器28，其具有從80至400微米的多個(gè)細(xì)孔。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，采集室20具有前置過(guò)濾器28，其具有多個(gè)265微米的細(xì)孔。在其它實(shí)施例中，過(guò)濾器可以是可拆式的和/或一次性的。
系統(tǒng)也可包括一個(gè)或多個(gè)溫度控制器件(未示出)，其設(shè)置成調(diào)節(jié)系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)室內(nèi)所包含的材料的溫度。溫度控制器件可為加熱器、冷卻器或者為這兩者，即，它能夠在加熱器和冷卻器之間切換。溫度器件可調(diào)節(jié)通過(guò)系統(tǒng)的任何材料的溫度，包括組織，解集試劑、再懸浮試劑，漂洗試劑，洗滌試劑或添加劑。例如，脂肪組織的加熱促進(jìn)解集，而再生細(xì)胞輸出的冷卻對(duì)于保持存活性是合乎需要的。同樣，如果需要預(yù)溫?zé)岬脑噭┯糜谧罴训慕M織處理，則溫度器件的作用將是保持預(yù)定的溫度，而非增加或降低溫度。
微粒保持封閉、無(wú)菌的流體/組織通路，全部端口和閥可包括封閉件，其用于保持系統(tǒng)的密封式構(gòu)造。封閉件可為不可透過(guò)流體、空氣和其它雜質(zhì)的膜片，或者它可以是本領(lǐng)域中已知的任何其它合適封閉件。另外，系統(tǒng)的全部端口可以設(shè)計(jì)成它們可容納用于將材料抽取至室中的注射器、針或其它器件，而不會(huì)有損于系統(tǒng)的無(wú)菌性。
如本文中所述，可以經(jīng)由任何本領(lǐng)域已知的方法從患者抽取組織。吸出的組織可以在置于系統(tǒng)中用于處理之前被抽取。吸出的組織一般經(jīng)由密封式進(jìn)入端口通過(guò)導(dǎo)管12而傳輸至采集室20，該端口例如為橡膠隔片封閉的注射器針頭連接端口(在采集室上未示出)?；蛘撸M織抽取步驟可以是系統(tǒng)的一部分。例如，采集室20可包括真空管線11，其使用插入患者的標(biāo)準(zhǔn)套管來(lái)促進(jìn)組織摘取。因此，在該實(shí)施例中，整個(gè)系統(tǒng)連接至患者。該組織可以通過(guò)入口端口21經(jīng)由導(dǎo)管例如12a而引入采集室20中，該導(dǎo)管12a是封閉的無(wú)菌的通路部分。采集室20可包括多個(gè)柔性的或剛性的筒或圓筒或它們的組合。例如，采集室20可包括一個(gè)或多個(gè)不同尺寸的剛性筒。采集室20也可包括一個(gè)或多個(gè)柔性的袋。在這種系統(tǒng)中，所述袋優(yōu)選設(shè)有例如內(nèi)或外框架形式的支撐件，其有助于降低在對(duì)袋施加抽吸時(shí)袋潰縮的可能性。采集室20在尺寸上設(shè)置成保持所需量的鹽水，以便在處理室30內(nèi)所執(zhí)行過(guò)程的洗滌和濃縮階段之前，適當(dāng)?shù)叵礈旌徒饧M織。優(yōu)選的是，存在于采集室20組織或流體的體積易于肉眼確定。例如，為了從脂肪組織中獲得再生細(xì)胞，合適的采集室能夠保持800毫升的脂肪抽取物和1200毫升的鹽水。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，采集室20具有至少2升的容量。在另一實(shí)施例中，為了從血液中分離和濃縮紅細(xì)胞，采集室20具有至少1.5升的容量。一般，采集室20的大小將根據(jù)從患者采集的組織的類(lèi)型和量而變化。采集室20可在尺寸上設(shè)置成可容納少至大約5毫升至多達(dá)大約2升的組織。對(duì)于更小的組織體積，例如5毫升至100毫升而言，組織可以在傳輸至采集室20之前聚集在注射器中。
采集室20可以用可被滅菌的任何合適生物相容性材料構(gòu)造成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，采集室20由一次性材料構(gòu)成，其滿足ISO10993標(biāo)準(zhǔn)體系所述血管內(nèi)接觸的生物相容性要求。例如，可以使用聚碳酸酯丙烯酸(polycarbonate acrylic)或ABS。采集室20的流體路徑優(yōu)選沒(méi)有熱原，即適合于血液使用，而不會(huì)有傳輸疾病的危險(xiǎn)。在一個(gè)實(shí)施例中，采集室20由這樣的材料構(gòu)造成，這種材料允許使用者目視確定存在于室內(nèi)的組織的大致體積。在其它實(shí)施例中，采集室20中的組織和/或流體的體積通過(guò)自動(dòng)化的傳感器29來(lái)確定。采集室20優(yōu)選設(shè)計(jì)成使得在自動(dòng)化的實(shí)施例中，系統(tǒng)可以適當(dāng)?shù)木却_定室內(nèi)的組織和/或流體的體積。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，系統(tǒng)以在正負(fù)15％內(nèi)的精度檢測(cè)采集室內(nèi)的體積。
在一個(gè)僅通過(guò)示例方式提供的具體實(shí)施例中，采集室20為剛性室的形式，例如，由醫(yī)用等級(jí)聚碳酸酯構(gòu)成的室，其含有大致圓錐形的具有265微米大小網(wǎng)眼的醫(yī)用等級(jí)聚酯的前置過(guò)濾器28(見(jiàn)圖5)。剛性的組織采集容器可具有大約八英寸高和大約五英寸直徑的大??；壁厚度可以為大約0.125英寸。進(jìn)入圓筒可以通過(guò)例如一個(gè)或多個(gè)用于抽吸管子的端口，一個(gè)或多個(gè)帶有用于通過(guò)無(wú)菌對(duì)接技術(shù)連接的管子的端口，和/或一個(gè)或多個(gè)用于針刺穿通過(guò)橡膠隔片的端口。采集室20內(nèi)部的前置過(guò)濾器28優(yōu)選構(gòu)造成例如在從患者取下組織時(shí)，可保留脂肪組織并通過(guò)非脂肪組織。更具體而言，在最初采集脂肪組織過(guò)程中，或在另一實(shí)施例中在最初采集脂肪組織之后，過(guò)濾器28可允許通過(guò)游離脂質(zhì)、血液和鹽水，同時(shí)保留脂肪組織碎片。就此而言，過(guò)濾器28包括多個(gè)相同或不同尺寸的細(xì)孔，但大小在大約20微米至5毫米的范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，過(guò)濾器28包括多個(gè)400微米的細(xì)孔。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，過(guò)濾器28是大約200微米厚度的醫(yī)用等級(jí)聚酯網(wǎng)眼，并且?guī)в写笮榇蠹s265微米的細(xì)孔和大約47％的開(kāi)孔面積。這種材料在漂洗過(guò)程中保留住組織，但允許細(xì)胞在組織解集之后通過(guò)網(wǎng)眼穿過(guò)。因此，當(dāng)組織從患者吸出時(shí)，非脂肪組織可以與脂肪組織分離。相同的功能可以用不同的材料、網(wǎng)眼尺寸、端口的數(shù)量和類(lèi)型達(dá)到。例如，尺寸小于100微米或大至數(shù)千微米的網(wǎng)眼細(xì)孔將可實(shí)現(xiàn)允許通過(guò)鹽水和血細(xì)胞而保留脂肪組織聚團(tuán)和碎片的相同目的。類(lèi)似地，相同的目的可以通過(guò)使用備選剛性的塑料材料來(lái)實(shí)現(xiàn)，或通過(guò)許多本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它修改來(lái)實(shí)現(xiàn)。
系統(tǒng)10也可包括一個(gè)或多個(gè)溶液源22。溶液源可包括洗滌溶液源23，以及組織解集試劑源24，例如膠原酶。采集室20包括封閉的流體通路，其允許洗滌和解集溶液或試劑以無(wú)菌的方式添加至組織。
用于洗滌溶液23和解集試劑24的容器可以是任何合適容器，其可以無(wú)菌的方式保持它們的內(nèi)容物，例如，為可潰縮的袋，例如用于臨床裝置的IV袋。這些容器可具有導(dǎo)管12，例如導(dǎo)管12e，其連在采集室20上，使得洗滌溶液和解集試劑可傳送至采集室20的內(nèi)部。洗滌溶液和解集試劑可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方式傳送至采集室20的內(nèi)部，包括簡(jiǎn)單地將重力壓力施加在用于鹽水23和/或解集試劑24的容器外側(cè)，或通過(guò)將正排量泵設(shè)置在導(dǎo)管上，例如圖4中的導(dǎo)管12d上。在自動(dòng)化的實(shí)施例中，系統(tǒng)的處理器件計(jì)算各種參數(shù)，例如鹽水的體積和洗滌循環(huán)所要求的時(shí)間或數(shù)量以及解集試劑的濃度或量和解集所要求的時(shí)間，這是基于最初通過(guò)使用者輸入的信息(例如，待處理的組織的體積)。或者，量、時(shí)間等等可以通過(guò)使用者人工地操縱。
采集室內(nèi)的組織和/或流體應(yīng)保持在30攝氏度至40攝氏度的溫度。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，采集室內(nèi)的懸浮物的溫度保持在37攝氏度。在某些實(shí)施例中，如果手術(shù)程序或治療場(chǎng)合需要延遲，則所選擇的組織可以?xún)?chǔ)存在采集室中以便以后使用。組織可以在室溫或大致室溫下或在大約4攝氏度下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)96小時(shí)。
洗滌溶液可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何溶液，包括鹽水或任何其它緩沖的或非緩沖的電解質(zhì)溶液。待處理的組織的類(lèi)型將規(guī)定所用洗滌溶液的類(lèi)型或組合。典型地，洗滌溶液，例如鹽水，在脂肪組織已經(jīng)從患者取得并置于采集室中之后進(jìn)入采集室20中。然而，洗滌溶液可在脂肪組織被抽取之前傳送至采集室20，或可與脂肪組織同時(shí)地傳送至采集室20。在采集室20中，洗滌溶液和抽取的脂肪組織可以通過(guò)任何手段來(lái)混合，包括如下所述的方法。
例如，組織可以通過(guò)攪動(dòng)來(lái)洗滌(其最大程度增加了細(xì)胞的存活性和減少了釋放的游離脂質(zhì)的量)。在一個(gè)實(shí)施例中，在變化的速度下，例如大約30回轉(zhuǎn)每分鐘，通過(guò)使整個(gè)采集室20旋轉(zhuǎn)通過(guò)可變弧度來(lái)攪動(dòng)組織(例如，通過(guò)大約45度至大約90度的弧度)。在其它實(shí)施例中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)整個(gè)采集室20來(lái)攪動(dòng)組織，其中采集室20包括一個(gè)或多個(gè)槳葉或突起，其剛性地連接在采集室的內(nèi)表面上，并且在變化的速度下、例如大約30回轉(zhuǎn)每分鐘的速度下通過(guò)可變度數(shù)的弧度(例如，通過(guò)大約45度至大約90度的弧度)。如上所述的采集室20的旋轉(zhuǎn)可以通過(guò)連接在或鄰近于采集室20的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)。該驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)可以是本領(lǐng)域中已知的簡(jiǎn)單的皮帶或齒輪或其它驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)。轉(zhuǎn)速可為例如30回轉(zhuǎn)每分鐘。一般而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，更高的速度可產(chǎn)生更大體積的游離脂質(zhì)，但可能不是最佳的。
在其它實(shí)施例中，通過(guò)將可旋轉(zhuǎn)的軸25設(shè)置在采集室20中來(lái)攪動(dòng)組織，其中可旋轉(zhuǎn)的軸包括一個(gè)或多個(gè)槳葉25a或突起，其剛性地連接在可旋轉(zhuǎn)的軸25，并且在軸旋轉(zhuǎn)時(shí)通過(guò)混合物。在某些實(shí)施例中，帶有剛性相連的槳葉25a的可旋轉(zhuǎn)的軸25可以靠在采集室20的底部。這可以例如通過(guò)將槳葉狀器件置于回旋磁場(chǎng)(例如，磁性攪拌器)中來(lái)實(shí)現(xiàn)。或者，組織的攪拌可以使用本領(lǐng)域中已知的簡(jiǎn)單攪拌機(jī)來(lái)實(shí)現(xiàn)，即進(jìn)行上下?lián)u動(dòng)而不旋轉(zhuǎn)的器件。組織也可以使用本領(lǐng)域已知的任何其它手段來(lái)洗滌，包括搖晃、攪拌、倒置等等。
在所需量的洗滌循環(huán)之后，組織解集試劑可傳送至采集室20，以便將再生細(xì)胞與余下的脂肪組織成分分離。解集試劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何解集試劑?？梢允褂玫慕饧噭┌ㄖ行缘鞍酌福z原酶，胰蛋白酶，脂酶，透明質(zhì)酸酶，脫氧核糖核酸酶，Blendzyme酶混合物家族的成員如LiberaseH1，胃蛋白酶，超聲波或其它物理能量，激光，微波，其它機(jī)械器件和/或它們的組合。本發(fā)明的優(yōu)選解集試劑是膠原酶。解集試劑可以添加有其它溶液。例如，鹽水，例如如上所述從鹽水源23傳送的鹽水，可連同膠原酶一起或者緊跟在其之后而被添加至脂肪組織中。在一個(gè)實(shí)施例中，洗滌的脂肪組織在或37℃左右與含膠原酶的酶溶液相混合達(dá)大約20-60分鐘。在其它實(shí)施例中，更高濃度的膠原酶或類(lèi)似的試劑可被添加進(jìn)來(lái)，以便降低消化時(shí)間。洗滌的脂肪組織和組織解集試劑以類(lèi)似于上述攪動(dòng)方法的方式而被攪動(dòng)，直到洗滌的脂肪組織被解集。例如，洗滌的脂肪組織和組織解集試劑可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)整個(gè)采集室達(dá)大約90度的弧度而被攪動(dòng)，通過(guò)設(shè)有包含在軸旋轉(zhuǎn)時(shí)通過(guò)溶液的一個(gè)或多個(gè)槳葉的軸來(lái)進(jìn)行，和/或通過(guò)旋轉(zhuǎn)整個(gè)采集室來(lái)進(jìn)行，該采集室在采集室的內(nèi)表面上包含槳葉或突起。
根據(jù)使用源自脂肪的細(xì)胞的目的，脂肪組織可被部分地解集，或被完全地解集。例如，在其中源自脂肪的細(xì)胞與脂肪組織單元相組合的實(shí)施例中，部分地解集所采集的脂肪組織是合乎需要的，以便去除一部分的部分地解集的脂肪組織，然后繼續(xù)解集留在采集室中的脂肪組織的余下部分。或者，在任何消化之前，一部分洗滌的脂肪組織可被取下并放置在樣品容器中。在另一實(shí)施例中，所采集的脂肪組織被部分地解集，以便在被重新引入到患者之前濃縮細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，脂肪組織與組織解集試劑相混合達(dá)一段一般不到大約20分鐘的時(shí)間。然后，部分地解集的組織的一部分可從采集室中取出，余下的部分地解集的組織可以通過(guò)將脂肪組織與組織解集試劑相混合達(dá)另外40分鐘而被進(jìn)一步解集。當(dāng)源自脂肪的細(xì)胞將被作為基本純的再生細(xì)胞群體而被使用時(shí)，脂肪組織可以被完全地解集。
在消化之后，組織和解集試劑溶液是被允許沉淀達(dá)一段足夠的時(shí)間，以允許漂浮的和不漂浮的溶液成分在采集室內(nèi)分開(kāi)。典型地，該時(shí)間的范圍為大約15秒鐘至若干分鐘，但可以在修改的實(shí)施例中執(zhí)行其它時(shí)間。漂浮層包括需要進(jìn)行進(jìn)一步洗滌和濃縮的再生細(xì)胞。不漂浮層包括血液，膠原，脂質(zhì)和組織的其它非再生細(xì)胞成分。不漂浮的層必須被去掉而移送至廢物室。
因此，采集室20優(yōu)選包括出口端口22，其處在室的最低點(diǎn)，使得血液和組織的其它不漂浮成分可以經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)管12而排至一個(gè)或多個(gè)廢物容器40。采集室20一般處于(或者可以放置在)直立位置，使得出口端口22處在采集室的底部。排出可以是被動(dòng)的或主動(dòng)的。例如，如上所述的不漂浮成分可以使用重力，通過(guò)施加正或負(fù)壓力，通過(guò)使用泵34或通過(guò)使用排氣口32而被排出。在自動(dòng)化的實(shí)施例中，處理器件可發(fā)送信號(hào)至某些閥和/或泵以便從采集室20中排出不漂浮層。自動(dòng)化的實(shí)施例也可包括傳感器29，其可在已經(jīng)到達(dá)漂浮液體和不漂浮液體之間的界面時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。自動(dòng)化的實(shí)施例也可包括傳感器29，例如，光學(xué)傳感器，其能夠檢測(cè)在通往采集室之外的導(dǎo)管中流動(dòng)的流出物的光折射變化。光折射的適當(dāng)變化可作為在流出導(dǎo)管中存在漂浮層的信號(hào)，這表明不漂浮層已經(jīng)被排出。傳感器29然后可將信號(hào)發(fā)送至處理器件，以便繼續(xù)進(jìn)行下一步驟。
然而，在某些實(shí)施例中，組織可以進(jìn)行處理，以便收回組織的非再生細(xì)胞成分。例如，在某些治療或研究應(yīng)用中，可能需要膠原，蛋白質(zhì)，基體或基質(zhì)成分，脂質(zhì)，脂肪細(xì)胞或組織的其它成分。在這種實(shí)施例中，包含再生細(xì)胞的漂浮層必須如上所述被除去而移送至廢物室。不漂浮層因此而保留在系統(tǒng)中，以便根據(jù)需要進(jìn)一步處理。
一旦不漂浮層被除去，包含再生細(xì)胞的漂浮層就可以被洗滌達(dá)一次或多次，以便除去殘余雜質(zhì)。因此，采集室20一般包括一個(gè)或多個(gè)允許洗滌溶液傳送至室內(nèi)部的端口21，以及一個(gè)或多個(gè)允許廢物和其它材料從采集室20引向外面的端口22。例如，采集室可包括一個(gè)或多個(gè)如本文所述的密封式進(jìn)入端口。采集室20還可包括一個(gè)或多個(gè)蓋子(未示出)，例如頂部蓋子和底部蓋子，以便在洗滌溶液傳送至采集室中和/或廢物被輸送出的同時(shí)，進(jìn)一步確保系統(tǒng)保持無(wú)菌。端口21可以設(shè)在采集室的蓋子上或采集室的側(cè)壁上。
用新鮮洗滌溶液洗滌的過(guò)程可以重復(fù)，直到溶液中殘余不漂浮雜質(zhì)的含量到達(dá)預(yù)定的水平。換句話說(shuō)，采集室20中包含上述漂浮材料混合物、包括脂肪組織碎片的余下材料可以被另外洗滌一次或多次，直到非所需材料的量降低至所需的預(yù)定水平。確定洗滌終點(diǎn)的一種方法是測(cè)量紅細(xì)胞在組織溶液中的量。這可以通過(guò)測(cè)量在540納米波長(zhǎng)時(shí)光吸光度來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，大約0.546和大約0.842之間的范圍被視為可接受的。
在洗滌和/或解集過(guò)程中，一種或多種添加劑可根據(jù)需要被添加至各種容器，以便改善結(jié)果。添加劑的一些示例包括優(yōu)化洗滌和解集的試劑，在處理過(guò)程中增強(qiáng)活性細(xì)胞群體存活性的添加劑，抗微生物試劑(例如抗生素)，裂解脂肪細(xì)胞和/或紅細(xì)胞的添加劑，或富集目標(biāo)細(xì)胞群體的添加劑(通過(guò)與固相部分的差異性結(jié)合或以其它方式促進(jìn)細(xì)胞群體的顯著減少或富集)。其它可能的添加劑包括促進(jìn)再生細(xì)胞的恢復(fù)和存活性的添加劑(例如，胱天蛋白酶抑制劑)，或者可減少發(fā)生輸液或安置不良反應(yīng)的可能性的添加劑(例如，細(xì)胞或結(jié)締組織重聚集的抑制劑)。
在經(jīng)過(guò)了足夠的沉降時(shí)間之后，洗滌的脂肪組織碎片和組織解集試劑的所得混合物的不漂浮部分將包含再生細(xì)胞，例如干細(xì)胞和其它源自脂肪的祖細(xì)胞。如本文中所論述，含有再生細(xì)胞的不漂浮部分將傳輸至處理室30中，其中目標(biāo)再生細(xì)胞如源自脂肪的干細(xì)胞，將與存在于混合物不漂浮部分中的其它細(xì)胞和物質(zhì)分開(kāi)。該不漂浮部分在本文中稱(chēng)為再生細(xì)胞組合物，并且包括多種不同類(lèi)型的細(xì)胞，包括干細(xì)胞，祖細(xì)胞，內(nèi)皮的前體細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和本文所述的其它再生細(xì)胞。再生細(xì)胞組合物也可包含一種或多種雜質(zhì)，例如存在于脂肪組織碎片中的膠原和其它結(jié)締組織蛋白質(zhì)及其碎片，或來(lái)自組織解集過(guò)程的殘余膠原酶。
本發(fā)明的處理室30優(yōu)選設(shè)在系統(tǒng)內(nèi)，使得再生細(xì)胞組合物以無(wú)菌的方式通過(guò)管子12、閥14和泵34而從采集室20移動(dòng)至處理室30。處理室在尺寸上設(shè)置成可容納10mL至1.2L的組織/流體混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，處理室在尺寸上設(shè)置成可容納800毫升。在某些實(shí)施例中，整個(gè)再生細(xì)胞組合物從采集室20被引向處理室30。然而，在其它實(shí)施例中，再生細(xì)胞組合物的一部分被引向處理室30，而另一部分被引向系統(tǒng)的不同區(qū)域如樣品室60，以便在隨后的時(shí)間里與在處理室30中的處理細(xì)胞重新組合。
處理室30可以由可進(jìn)行滅菌的任何合適生物相容性材料來(lái)構(gòu)成。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，處理室30由滿足如ISO10993標(biāo)準(zhǔn)體系所述的血管內(nèi)接觸生物相容性要求的一次性材料構(gòu)成。例如，可以使用聚碳酸酯丙烯酸，ABS，乙烯-乙酸乙烯共聚物或苯乙烯-丁二烯共聚物(SBC)。在另一實(shí)施例中，一次性處理室的流體路徑是沒(méi)有熱原的。處理室可以為塑料袋的形式，例如傳統(tǒng)上用于處理血庫(kù)中血液的塑料袋；或者，在其它實(shí)施例中，它可以在結(jié)構(gòu)上是剛性的(圖6)。在一個(gè)實(shí)施例中，處理室30可以類(lèi)似于在2001年12月7日提交的共同擁有的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/316127和2002年12月20日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/325728中公開(kāi)的處理室，這些專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用而結(jié)合于本文中。
處理室30可以以任何方式構(gòu)造成適合于分離和濃縮細(xì)胞，包括過(guò)濾和離心和/或這兩者方式的組合。在某些實(shí)施例中，再生細(xì)胞組合物從采集室20被引入處理室30，在室30中，組合物可以被過(guò)濾，以便分離和/或濃縮特定的再生細(xì)胞群體。細(xì)胞過(guò)濾是從細(xì)胞的其它不同組分或類(lèi)型中分離出特定組分和細(xì)胞的方法。例如，本發(fā)明的再生細(xì)胞組合物包括多種不同類(lèi)型的細(xì)胞，包括干細(xì)胞，祖細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，以及一種或多種雜質(zhì)，例如存在于脂肪組織碎片中的膠原，或來(lái)自于組織解集過(guò)程的殘余膠原酶。設(shè)在處理室30中的過(guò)濾器36可允許分離和濃縮再生細(xì)胞的特定子群體，例如干細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞等等。
與從液體中過(guò)濾細(xì)胞相關(guān)的一些變量包括但不限于，過(guò)濾介質(zhì)的細(xì)孔大小，細(xì)孔的幾何形狀(形狀)，過(guò)濾器的表面積，被過(guò)濾溶液的流動(dòng)方向，跨膜壓力，特定細(xì)胞群體的稀釋度，微粒大小和形狀以及細(xì)胞大小和細(xì)胞存活性。根據(jù)本文的公開(kāi)，需要進(jìn)行分離或過(guò)濾的特定細(xì)胞一般為源自脂肪的干細(xì)胞。然而，在某些實(shí)施例中，這些特定細(xì)胞可包括源自脂肪的祖細(xì)胞，例如內(nèi)皮前體細(xì)胞，其單獨(dú)地或連同干細(xì)胞一起。
再生細(xì)胞組合物可以被引導(dǎo)通過(guò)過(guò)濾器組件，例如過(guò)濾器組件36。在某些實(shí)施例中，過(guò)濾器組件36包括多個(gè)過(guò)濾器，它們構(gòu)造成用于執(zhí)行不同功能以及將再生細(xì)胞組合物分成分開(kāi)的部分或組分。例如，其中一個(gè)過(guò)濾器可以構(gòu)造成從再生細(xì)胞組合物中分離出膠原，其中一個(gè)過(guò)濾器可以構(gòu)造成從再生細(xì)胞組合物中分離脂肪細(xì)胞和/或脂質(zhì)組分，并且其中一個(gè)過(guò)濾器可以構(gòu)造成從再生細(xì)胞組合物中分離出殘余酶，例如組織解集試劑。在某些實(shí)施例中，其中一個(gè)過(guò)濾器能夠執(zhí)行兩種功能，例如從組合物中分離出膠原和組織解集試劑。多個(gè)過(guò)濾器一般被串聯(lián)地設(shè)置；然而，過(guò)濾器的至少一部分也可以并聯(lián)地設(shè)置。過(guò)濾器組件36的過(guò)濾器的串聯(lián)設(shè)置如圖2所示。過(guò)濾器組件36的過(guò)濾器的并聯(lián)設(shè)置如圖3所示。
在一個(gè)實(shí)施例中，過(guò)濾器組件36包括第一過(guò)濾器，第二過(guò)濾器，和第三過(guò)濾器。第一過(guò)濾器構(gòu)造成用于除去存在于再生細(xì)胞組合物中的膠原微粒。這些膠原微粒一般具有大約0.1微米的直徑和高達(dá)20微米的長(zhǎng)度。膠原微?？梢允遣煌叽绲?，這取決于消化。它們也可以是細(xì)纖維，這意味著它們具有纏繞和扭曲。本文所述的任何過(guò)濾器可以由聚醚砜、聚酯、PTFE、聚丙烯、PVDF或可能的纖維素制成。對(duì)于過(guò)濾膠原具有兩種可能的方法。一種可能的方法是首先試圖除去大的微粒，讓細(xì)胞通過(guò)，這就要求例如可能在10微米范圍內(nèi)的過(guò)濾器。第二種方法是使用較小尺寸的過(guò)濾器，例如4.5微米，以便膠原被很好地消化，從而捕集細(xì)胞，而讓膠原通過(guò)。這將要求有讓細(xì)胞浮起而脫離過(guò)濾器的手段。也可以采用可吸附和保持膠原纖維的過(guò)濾器。
第二過(guò)濾器構(gòu)造成用于除去游離的未成熟脂肪細(xì)胞，其在再生細(xì)胞組合物中是不漂浮的。在一個(gè)實(shí)施例中，第二過(guò)濾器可以由聚酯構(gòu)成，并且所具有的細(xì)孔大小在大約30和大約50微米之間，優(yōu)選的細(xì)孔大小為大約40微米。盡管被稱(chēng)為第二過(guò)濾器，但是，這種器件的放置可以處于第一而非第二的位置，以便有助于首先除去更大細(xì)胞和微粒。第三過(guò)濾器構(gòu)造成用于除去存在于組合物中的未用的或殘余的膠原酶或其它組織解集試劑。在一種優(yōu)選實(shí)施例中，膠原酶可隨時(shí)間分解。在一個(gè)實(shí)施例中，第三過(guò)濾器包括多個(gè)細(xì)孔，其具有不到1微米的直徑或長(zhǎng)度。在某些實(shí)施例中，該細(xì)孔可具有小于1微米的直徑。在其它實(shí)施例中，該細(xì)孔所具有的直徑在10kD與5微米之間。在某些實(shí)施例中，第三過(guò)濾器可以構(gòu)造成用于將再生細(xì)胞群體濃縮到小體積的鹽水或其它洗滌溶液中，如下文中所述。作為當(dāng)前的優(yōu)選，只有最終的過(guò)濾器是中空纖維單元。不必任何過(guò)濾器都是中空纖維類(lèi)型。中空纖維單元在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中用于最終的過(guò)濾器，因?yàn)樗勺钣行У赜糜诔ツz原酶，而對(duì)再生細(xì)胞的有害影響最小。在其中器件是成品物品的采集件的實(shí)施例中，三個(gè)過(guò)濾器處于單獨(dú)的外殼中。將第一和第二過(guò)濾器組成在一個(gè)外殼中是可行的，如果中空纖維單元用于第三過(guò)濾器的話。如果最終的過(guò)濾器不是中空纖維單元，那么全部三個(gè)過(guò)濾器都可以包含在一個(gè)外殼中。
過(guò)濾器組件36的過(guò)濾器可以是設(shè)在處理室30中，或可以作為與處理室30分開(kāi)的部件來(lái)提供。另外，過(guò)濾器組件36的過(guò)濾器可以設(shè)在多個(gè)處理室中，或以在線的方式來(lái)設(shè)置。在某些實(shí)施例中，導(dǎo)管或管子可用作處理室或室。處理室可以在尺寸上減小，使得它成為將過(guò)濾器相連起來(lái)的導(dǎo)管的內(nèi)體積。這種類(lèi)型的系統(tǒng)將正確地起作用。如果組織溶液的體積具有適當(dāng)體積的話。因此，導(dǎo)管可通過(guò)在流體和細(xì)胞流過(guò)過(guò)濾器時(shí)包含流體和細(xì)胞而用作處理室?？梢孕⌒牡販p小導(dǎo)管的體積，使得灌輸和流通系統(tǒng)過(guò)程中不會(huì)不必要地?fù)p失細(xì)胞/組織。
參考如上所述的實(shí)施例，含有洗滌的細(xì)胞和殘余膠原、脂肪細(xì)胞和/或未消化組織解集試劑的再生細(xì)胞組合物可以被引導(dǎo)通過(guò)第一過(guò)濾器，以便從組合物中除去至少一部分、優(yōu)選基本上所有的膠原微粒，使得很少、優(yōu)選沒(méi)有膠原微粒存在于過(guò)濾溶液中。含有脂肪細(xì)胞和/或未消化組織解集試劑的過(guò)濾再生細(xì)胞組合物然后可被引導(dǎo)通過(guò)第二過(guò)濾器，以便從過(guò)濾的再生細(xì)胞組合物中除去至少一部分、優(yōu)選基本上所有的游離脂肪細(xì)胞。隨后，含有未消化組織解集試劑的經(jīng)兩次過(guò)濾的再生細(xì)胞組合物可以被引導(dǎo)通過(guò)第三過(guò)濾器，例如如下文中所述的中空纖維過(guò)濾器件，以便從再生細(xì)胞組合物中除去或減少未消化的組織解集試劑。
經(jīng)三次過(guò)濾的再生細(xì)胞組合物(即，在通過(guò)第一、第二和第三過(guò)濾器之后的余下組合物)然后可被引導(dǎo)至多個(gè)出口，其可包括處理室30的包括多個(gè)出口的一部分。這些出口可用于保持必要的壓力，以及用于經(jīng)由導(dǎo)管連接在其它容器上，這些其它的容器可包括采集室20，輸出室50，和/或廢物容器40。
在一個(gè)實(shí)施例中，過(guò)濾器組件36的過(guò)濾器包括中空纖維的過(guò)濾部件?；蛘邠Q句話說(shuō)，過(guò)濾器包括用過(guò)濾介質(zhì)形成的中空管的采集器?？膳c所公開(kāi)的系統(tǒng)10一起使用的過(guò)濾介質(zhì)的示例包括聚砜、聚醚砜或混合酯材料等等。這些過(guò)濾介質(zhì)的中空纖維或中空管可以包含在過(guò)濾器組件36的圓柱形濾筒中。過(guò)濾介質(zhì)的單個(gè)管或纖維一般具有大約0.1毫米至大約1毫米的內(nèi)徑，其優(yōu)選值為大約0.5毫米。合適圓柱形濾筒的直徑和長(zhǎng)度將確定可置于濾筒內(nèi)的過(guò)濾介質(zhì)單個(gè)管的數(shù)量。合適中空纖維過(guò)濾器濾筒的一個(gè)示例是FiberFlo切向流過(guò)濾器，其產(chǎn)品目錄號(hào)為M-C-050-K(Minntech，Minneapolis，Minnesota)。過(guò)濾介質(zhì)的細(xì)孔尺寸范圍可在大約10千道爾頓與大約5微米之間，其中優(yōu)選的細(xì)孔大小為大約0.5微米。
在中空纖維過(guò)濾器中，每一中空管具有主體，其具有第一端，第二端，以及處于該主體中并且在第一端和第二端之間延伸的管腔。每一中空管的主體包括多個(gè)細(xì)孔。這些細(xì)孔一般在主體中定向成使得再生細(xì)胞組合物可通過(guò)流過(guò)主體的管腔而被過(guò)濾，并且待過(guò)濾產(chǎn)品沿切向地通過(guò)細(xì)孔，如
圖12A所示。換句話說(shuō)，液體中的更小微粒相對(duì)于通過(guò)主體管腔的流體的流動(dòng)而沿切向地通過(guò)細(xì)孔。在組合物進(jìn)行過(guò)濾時(shí)，帶有再生細(xì)胞的組合物通過(guò)每一中空管的管腔。優(yōu)選的是，組合物的流動(dòng)相切于每一中空管的主體的細(xì)孔。
通過(guò)使用流體的切向流，干細(xì)胞的過(guò)濾效率就可以相對(duì)于其它過(guò)濾技術(shù)而得以提高。例如，根據(jù)一些過(guò)濾技術(shù)，過(guò)濾介質(zhì)的細(xì)孔以這種方式來(lái)設(shè)置，即過(guò)濾器定向成垂直于流體的流動(dòng)方向，使得過(guò)濾介質(zhì)阻擋了正在進(jìn)行過(guò)濾的流體的通路，如
圖12B所示。在這種類(lèi)型的過(guò)濾中，被過(guò)濾出再生細(xì)胞組合物例如干細(xì)胞的微粒傾向于在過(guò)濾器的一側(cè)積聚，并且阻擋流體流過(guò)細(xì)孔。這種阻擋會(huì)降低過(guò)濾器的效率。另外，細(xì)胞恒定地受到流體流動(dòng)壓力以及積聚在過(guò)濾器上游側(cè)的細(xì)胞的重量。這可導(dǎo)致增大干細(xì)胞的溶胞。因此，在其中流體流動(dòng)平行于細(xì)孔在過(guò)濾器中方向的這種過(guò)濾技術(shù)中，在流體通過(guò)細(xì)孔時(shí)，大細(xì)胞和小微粒都可能被不合乎要求地引導(dǎo)至過(guò)濾介質(zhì)上。因此，液體中的更大產(chǎn)品例如細(xì)胞可阻塞細(xì)孔，因而降低了過(guò)濾效果，并且增加了細(xì)胞破裂或損傷的出現(xiàn)。
相比之下，在本系統(tǒng)10的中空纖維構(gòu)造中，被過(guò)濾的流體流入中空管的管腔。流體中能夠通過(guò)過(guò)濾器主體細(xì)孔的那部分在流體作用于主體內(nèi)側(cè)上的正壓力以及施加在主體外側(cè)上的負(fù)壓力的幫助下，流過(guò)主體細(xì)孔。在該實(shí)施例中，細(xì)胞一般未受到流體流動(dòng)的壓力或其它細(xì)胞重量的作用，因此干細(xì)胞上的剪切力得以降低，因此，過(guò)濾的效率和效果可得以增強(qiáng)，這是通過(guò)降低阻塞率和減少再生細(xì)胞溶胞來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由于鹽水分子和不需要的蛋白質(zhì)分子的大小，在過(guò)濾過(guò)程中，這些分子和其它小成分通過(guò)中空管主體的細(xì)孔而到達(dá)中空管的外面，并且被引導(dǎo)至廢物容器40。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)中空管過(guò)濾介質(zhì)外側(cè)上形成真空來(lái)增強(qiáng)過(guò)濾。由于再生細(xì)胞例如干細(xì)胞或祖細(xì)胞的大小，這些細(xì)胞一般無(wú)法通過(guò)主體的細(xì)孔，因此就被留在中空管過(guò)濾器的內(nèi)側(cè)(例如留在管的管腔中)，并且經(jīng)由過(guò)濾器和處理室之間的導(dǎo)管而被引導(dǎo)回到處理室30，或被引導(dǎo)至輸出室50。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，中空纖維過(guò)濾器具有大約0.05微米的細(xì)孔尺寸，并且包含大約550cm2的過(guò)濾介質(zhì)表面積。單個(gè)介質(zhì)管一般具有大約0.5毫米的直徑。在處理130毫升的再生細(xì)胞組合物時(shí)，大約120毫升的另加鹽水可被添加至組合物中。處理時(shí)間或過(guò)濾時(shí)間可以為大約8分鐘。中空纖維管主體每一側(cè)上的壓差(例如主體的管腔內(nèi)的壓力和主體外側(cè)的壓差)被視為跨膜壓力?？缒毫榇蠹s1毫米汞柱至大約500毫米汞柱，優(yōu)選的壓力為大約200毫米汞柱。使用中空纖維過(guò)濾的平均有核細(xì)胞復(fù)原率和存活性可以為存活細(xì)胞的大約80％。
一般在這種系統(tǒng)中被除去的膠原酶的量折合為Ig3的減少量。例如，如果從采集室轉(zhuǎn)移至處理室的再生細(xì)胞組合物中膠原酶的初始濃度是0.078U/ml，那么在最終再生細(xì)胞組合物中的膠原酶濃度將為0.00078U/ml。膠原酶在中空纖維過(guò)濾器中被除去，并且中空纖維過(guò)濾器對(duì)應(yīng)于如上所述的第三過(guò)濾器。
顯示了如上所述的一種或多種細(xì)胞過(guò)濾方法的處理室如附圖、尤其是
圖1-3所示。參見(jiàn)
圖1-3，在處理室30和過(guò)濾器組件36的過(guò)濾室之間，可以設(shè)置泵，例如泵34。另外，排氣口和壓力傳感器，例如排氣口32和壓力傳感器39可以設(shè)置成符合處理室30和過(guò)濾器組件36。還可以提供用于輸出室50的配件。這些可選的部件(例如泵34、排氣口32、壓力傳感器39用于輸出室50的配件)可以設(shè)在處理室30和過(guò)濾器組件36之間，使得包含在處理室30中的液體可在流過(guò)過(guò)濾器組件36之前，首先流至這些可選的部件中的一個(gè)或多個(gè)。例如，液體可在經(jīng)過(guò)過(guò)濾器組件36之前流過(guò)泵34?；蛘撸后w可在通過(guò)過(guò)濾器組件之前通過(guò)壓力傳感器39，以便在系統(tǒng)中獲得過(guò)濾器前的液體壓力。在某些情況下，其中一個(gè)或多個(gè)這些部件也可以作為處理室30的部件來(lái)提供，例如排氣口32，如圖6所示。在所示實(shí)施例中，壓力傳感器39設(shè)在管線內(nèi)，以便確定再生細(xì)胞組合物在進(jìn)入過(guò)濾器組件36的過(guò)濾室時(shí)由泵34所產(chǎn)生的壓力。這種構(gòu)造可有助于監(jiān)控經(jīng)過(guò)過(guò)濾器膜片的跨膜壓力。附加的鹽水或其它緩沖劑和洗滌溶液可被添加至再生細(xì)胞組合物中，以便在組合物過(guò)濾通過(guò)過(guò)濾器組件36時(shí)幫助除去不需要的蛋白質(zhì)。這種重復(fù)的洗滌可以執(zhí)行多次，以便改善再生細(xì)胞的純度。在某些實(shí)施例中，鹽水可以在被視為改善過(guò)濾所必要的任何步驟中添加。
在一個(gè)通過(guò)示例方式來(lái)提供并且沒(méi)有限制性的具體實(shí)施例中，不需要的蛋白質(zhì)和鹽水或其它洗滌溶液通過(guò)以下方式來(lái)除去。帶有再生細(xì)胞以及膠原和結(jié)締組織微?；蛩槠⒅炯?xì)胞和膠原酶的組合物循環(huán)地通過(guò)一系列過(guò)濾器，直到達(dá)到最小體積。最小體積是系統(tǒng)的總?cè)菁{體積和一些預(yù)設(shè)常量的函數(shù)。容納體積是在所有處理室都騰空時(shí)包含在管子和導(dǎo)管中的液體體積。在一個(gè)實(shí)施例中，最小體積是15ml。當(dāng)達(dá)到最小體積時(shí)，預(yù)定體積的洗滌溶液被引入系統(tǒng)中，以便與再生細(xì)胞組合物混合。洗滌溶液和再生細(xì)胞組合物的這種混合物然后循環(huán)通過(guò)過(guò)濾器，直到再次達(dá)到最小體積。這種循環(huán)可以多次重復(fù)，以便提高再生細(xì)胞的純度，或者換句話說(shuō)，增加組合物中再生細(xì)胞相對(duì)于組合物中其它物質(zhì)的比例。見(jiàn)
圖10和11。
在確定再生細(xì)胞組合物已經(jīng)被純化除去了不需要的蛋白質(zhì)并且充分地濃縮之后(在示例性實(shí)施例中，可以使用大約1×105至大約1×107個(gè)細(xì)胞/ml范圍內(nèi)的最小濃度，并且在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，最小濃度可以為大約1×107個(gè)細(xì)胞/ml)，輸出室50、例如輸出袋可以連接在處理室30的出口端口和/或過(guò)濾器組件36上，這取決于具體實(shí)施例。排氣口、例如排氣口32，然后可打開(kāi)，以便促進(jìn)濃縮的再生細(xì)胞輸出。在一個(gè)實(shí)施例中，在已經(jīng)進(jìn)行試驗(yàn)之后，憑經(jīng)驗(yàn)作出何時(shí)達(dá)到最小濃度的決定，并且該決定被編程到電子控制器件中。該決定可以為需要產(chǎn)出什么的過(guò)程中的輸入，即需要多少干細(xì)胞/祖細(xì)胞或細(xì)胞濃度范圍?；诳茖W(xué)數(shù)據(jù)，需要獲得預(yù)定量的脂肪組織并置于系統(tǒng)中，以便實(shí)現(xiàn)所需的輸出。在排氣口32打開(kāi)時(shí)，泵、例如泵34可用于將濃縮的再生細(xì)胞傳送至輸出袋中。在一個(gè)實(shí)施例中，輸出袋50類(lèi)似于空的血液袋，其具有在一端帶有管接頭的管。在無(wú)菌方式中，輸出袋上的接頭可以連接在出口端口上，并且濃縮的再生細(xì)胞可以被傳輸至輸出袋中。
如
圖1-3所示，真空泵26可以設(shè)在系統(tǒng)10中，以便改變系統(tǒng)中的壓力以及其它作用。例如，真空泵26可經(jīng)由導(dǎo)管、例如導(dǎo)管12b而連在采集室20上，以便促進(jìn)了采集室20內(nèi)壓力的降低。真空泵26也可通過(guò)導(dǎo)管、例如導(dǎo)管12g而連在處理室30上。關(guān)于真空泵26連同泵34的操作，通過(guò)使用閥將真空吸力引至在處理過(guò)程中特定點(diǎn)處需要真空的不同導(dǎo)管，就可以實(shí)施兩個(gè)分離真空泵或源，或可以實(shí)施單個(gè)泵或源。另外，真空泵26可經(jīng)由導(dǎo)管、例如導(dǎo)管12f而連在廢物容器40上。
參見(jiàn)
圖10和11，真空泵26所產(chǎn)生的壓力可用于引導(dǎo)包含再生細(xì)胞的流體流過(guò)導(dǎo)管12。這種壓力可以在多個(gè)方向上提供，例如，通過(guò)自動(dòng)地或人工地控制在系統(tǒng)10中的一個(gè)或多個(gè)閥14的位置。系統(tǒng)10可以設(shè)置成利用正壓力或利用負(fù)壓力、或它們的組合來(lái)正確地起作用。例如，再生細(xì)胞可以被抽吸通過(guò)如上所述的第一和第二過(guò)濾器而進(jìn)入軟側(cè)面容器，該容器連接在第三過(guò)濾器上。軟側(cè)面容器可以在線地(串聯(lián)式)連接在第三過(guò)濾器的前面。最終的輸出室可以是軟側(cè)面容器，其位于第三過(guò)濾器的另一側(cè)(例如下游側(cè))上。在該實(shí)施例中，壓力被用于將再生細(xì)胞從一個(gè)軟側(cè)面容器通過(guò)過(guò)濾器而移動(dòng)至第二軟側(cè)面容器。
在系統(tǒng)10的另一實(shí)施例中，干細(xì)胞和/或源自脂肪的祖細(xì)胞的過(guò)濾可以使用滲透過(guò)濾和沉淀的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，這種系統(tǒng)使用鹽水，其通過(guò)了組織再生細(xì)胞組合物(例如含有干細(xì)胞和/或源自脂肪的祖細(xì)胞的組合物)，然后通過(guò)過(guò)濾器。其中與細(xì)胞從再生細(xì)胞組合物中滲透過(guò)濾相關(guān)的一些變量包括但不限于，過(guò)濾介質(zhì)的細(xì)孔大小，細(xì)孔的幾何形狀或形狀，過(guò)濾器的表面積，被過(guò)濾的再生細(xì)胞組合物的流動(dòng)方向，注入鹽水的流率，跨膜壓力，細(xì)胞群體的稀釋度，細(xì)胞的大小和存活性。
在系統(tǒng)10的一個(gè)實(shí)施例中，處理室30使用了過(guò)濾器組件36，其執(zhí)行滲透過(guò)濾和沉淀，以便分離和濃縮再生細(xì)胞。通過(guò)示例的方式，而并非通過(guò)限制的方式，處理室30被定義為大致圓柱形的主體，其具有側(cè)壁30a、頂面30b和底面30c，如圖6所示。無(wú)菌的排氣口32設(shè)在頂面30b中。
在圖6的實(shí)施例中，處理室30顯示為包括過(guò)濾器組件36，其包括兩個(gè)過(guò)濾器，例如大細(xì)孔過(guò)濾器36a和小細(xì)孔過(guò)濾器36b。過(guò)濾器36a和36b的細(xì)孔尺寸一般在大約0.05微米和大約10微米之間的范圍內(nèi)。大細(xì)孔過(guò)濾器36a可包括直徑為大約5微米的細(xì)孔，小細(xì)孔過(guò)濾器36b可包括直徑為大約1-3微米的細(xì)孔。在一個(gè)實(shí)施例中，過(guò)濾器具有大約785毫米2的表面積。過(guò)濾器36a和36b將處理室30的內(nèi)部分成包括第一室37a、第二室37b和第三室37c。如圖6所示，第一室37a位于第二室37b和第三室37c之間。另外，第一室37a顯示為處理室30的具有入口端口31a和出口端口31b的區(qū)域。所示的處理室30包括可提供從處理室30外部至處理室30內(nèi)部的通路的多個(gè)端口，例如端口31a，31b和31c。端口31a，31b和31c，顯示為設(shè)在處理室30主體的側(cè)壁30a中。然而，端口31a，31b和31c也可以設(shè)在其它區(qū)域中。端口31a被顯示為樣品入口端口，其構(gòu)造成可連在導(dǎo)管上，使得含有再生細(xì)胞的組合物可以從中經(jīng)過(guò)而通向處理室30的內(nèi)部。端口31b顯示為出口端口，其構(gòu)造成連在導(dǎo)管上，使得被分離和濃縮的細(xì)胞可以從處理室30內(nèi)部取出。端口31c是顯示為入口端口，其構(gòu)造成連在導(dǎo)管上，用于將新鮮洗滌溶液如鹽水傳送至處理室30的內(nèi)部。
在使用中，再生細(xì)胞可以經(jīng)由入口端口31a而被引入中心室37a中。鹽水或其它緩沖劑通過(guò)入口端口31c被引入底部室37b中。鹽水可以在大約10ml/min的流率下被引導(dǎo)通過(guò)室37a中的再生細(xì)胞組合物。鹽水的流率設(shè)置成使得它可抵消重力。鹽水的流動(dòng)使得室中的細(xì)胞能夠基于細(xì)胞的密度而分離。典型地，當(dāng)鹽水受迫通過(guò)組合物時(shí)，組合物中的更大細(xì)胞將沉淀在中心室37a的底部，并且更小的細(xì)胞和蛋白質(zhì)將被載帶通過(guò)第二過(guò)濾器36b而進(jìn)入頂部室37c中。這種過(guò)濾通過(guò)調(diào)節(jié)鹽水的流率來(lái)實(shí)現(xiàn)，使得更大細(xì)胞在適當(dāng)?shù)奈恢脻L動(dòng)，而該位置允許更小的微粒自由移動(dòng)并被鹽水載帶走。無(wú)菌的排氣口32設(shè)在室30中，以便確保在處理單元內(nèi)的三個(gè)室中保持正確的壓力梯度。上室37c可包括吸收劑介質(zhì)33。吸收劑介質(zhì)的用途是捕集質(zhì)溶液中不需要的蛋白質(zhì)，以確保例如在鹽水流率降低時(shí)，這些蛋白質(zhì)不會(huì)穿過(guò)過(guò)濾介質(zhì)而回到處理溶液中。吸收劑介質(zhì)可以是一類(lèi)過(guò)濾器材料，其能夠吸收或吸附將被過(guò)濾出的材料或成分。流出端口可以被添加在頂部過(guò)濾器上方，以幫助抽掉廢物。這樣的另一實(shí)施例可以從頂部施加柔和的真空，以幫助抽掉廢物。在所示實(shí)施例中，當(dāng)流率相對(duì)較小時(shí)，可以實(shí)施吸收劑介質(zhì)。多余的鹽水和蛋白質(zhì)然后被攜帶至廢物容器。
當(dāng)更大細(xì)胞(例如源自脂肪的干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞)已經(jīng)與更小的細(xì)胞和蛋白質(zhì)充分地分離時(shí)，含有分離細(xì)胞的組合物可以進(jìn)行濃縮，如下文中所述。在組合物已經(jīng)從室37a中通過(guò)出口端口31b取出之后或者在組合物仍處于室37a中的同時(shí)，組合物可以被進(jìn)一步濃縮。在一個(gè)實(shí)施例中，組合物中的細(xì)胞濃度通過(guò)以下方式來(lái)增加。在細(xì)胞已經(jīng)被足夠地分離之后，過(guò)濾器、例如過(guò)濾器36a和36b可以保持朝著對(duì)方而運(yùn)動(dòng)。這種運(yùn)動(dòng)具有減小這兩個(gè)過(guò)濾器之間的體積(例如室37a的體積)的效果。振動(dòng)部件也可以連同處理室30一起來(lái)提供，以便促進(jìn)細(xì)胞在組合物中的濃縮。在一個(gè)實(shí)施例中，振動(dòng)部件可連在過(guò)濾器36b(例如小細(xì)孔過(guò)濾器)上。振動(dòng)可減少細(xì)胞被捕集在過(guò)濾器中。如同廢物和細(xì)胞被濃縮為更小的體積，組合物體積的減小允許除去多余的鹽水。
在另一實(shí)施例中，再生細(xì)胞的濃縮通過(guò)以下方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。在細(xì)胞已經(jīng)被充分地分離之后，再生細(xì)胞組合物可以被傳輸至另一室(未示出)，其利用重力來(lái)過(guò)濾出多余的鹽水。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，沉淀可與滲濾在相同的時(shí)間發(fā)生。這種沉淀可以通過(guò)在過(guò)濾器頂部引入組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)，該過(guò)濾器所具有的細(xì)孔大小從大約10kD至大約2微米。在一個(gè)實(shí)施例中，合適過(guò)濾器具有大約1微米的細(xì)孔大小。重力的作用將允許鹽水和更小的微粒通過(guò)過(guò)濾器，同時(shí)阻止組合物中的細(xì)胞流過(guò)過(guò)濾器。在已經(jīng)獲得所需的細(xì)胞濃度之后，并且在經(jīng)過(guò)濾的更小微粒已經(jīng)從過(guò)濾器下方被取出之后，再生細(xì)胞組合物可以被攪動(dòng)，以便從過(guò)濾器中取出細(xì)胞，并且隨后可將濃縮的再生細(xì)胞傳輸至輸出袋中。更小的微?？梢宰鳛閺U物而通過(guò)出口抽走。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，再生細(xì)胞組合物從采集室20輸送至處理室30，其中組合物可以進(jìn)行離心操作，以便分離和濃縮再生細(xì)胞。離心原理在本領(lǐng)域是眾所周知的，出于簡(jiǎn)潔起見(jiàn)在本文中不再重復(fù)。在本文中采用了本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)離心器件、部件和參數(shù)。用作部分離心器件的示例性處理室如圖7和8所示。典型地，離心器件導(dǎo)致了離心室(例如圖7所示的離心室)圍繞軸線自旋，因而增加了作用于溶液中的細(xì)胞上的作用力，使其大于重力。溶液中的密度更大或更重的材料一般沉淀在離心室的一端，即圖7的輸出室50，以形成再生細(xì)胞沉淀。所述沉淀然后可再懸浮起來(lái)，以便獲得具有所需細(xì)胞濃度和/或所需細(xì)胞和培養(yǎng)基體積的溶液。圖7所示處理室構(gòu)造成利用離心力和重力來(lái)分離和濃縮細(xì)胞。具體而言，在離心過(guò)程中，離心力將再生細(xì)胞組合物中的密度更大的成分、例如再生細(xì)胞引向離心室的最外端。當(dāng)離心室減慢并最終停止下來(lái)時(shí)，重力將幫助再生細(xì)胞保持在離心室的最外端并形成細(xì)胞沉淀。因此，再生細(xì)胞組合物的不需要成分、即廢物可以被除去，同時(shí)不會(huì)干擾細(xì)胞沉淀。
在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施例中，處理室可包括細(xì)胞濃縮器，其為自旋膜片過(guò)濾器的形式。在離心處理的另一實(shí)施例中，也可以應(yīng)用離心淘析。在該實(shí)施例中，細(xì)胞可以基于單個(gè)細(xì)胞的沉淀速率來(lái)分離，使得通過(guò)離心所施加的定向(例如向外)力促進(jìn)了細(xì)胞和溶液以不同的速率沉淀。在淘析過(guò)程中，目標(biāo)細(xì)胞群體的沉淀速率與反向(例如向內(nèi))流率對(duì)抗，該反向流率通過(guò)在與離心力相反的方向上泵送溶液而施加。對(duì)逆流進(jìn)行調(diào)節(jié)，使得溶液內(nèi)的細(xì)胞和微粒被分離開(kāi)。淘析已經(jīng)應(yīng)用于許多細(xì)胞分離例子中(Inoue，Carsten等人1981；Hayner，Braun等人1984；Noga1999)，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員在理解了本公開(kāi)之后，可以將用來(lái)優(yōu)化流動(dòng)和離心參數(shù)的原理和實(shí)踐應(yīng)用于本文中。
圖9顯示了與根據(jù)本發(fā)明實(shí)施淘析相關(guān)的原理。淘析實(shí)施例可以類(lèi)似于離心實(shí)施例，即使用自旋轉(zhuǎn)子來(lái)對(duì)溶液施加作用力。與當(dāng)前實(shí)施例的淘析分離相關(guān)聯(lián)的一些變量包括但不限于自旋室的大小和形狀，轉(zhuǎn)子的直徑，轉(zhuǎn)子的速度，逆流管子的直徑，逆流的流率，以及將從溶液除去的微粒和細(xì)胞的大小和密度。與在離心一樣，再生細(xì)胞可以基于單個(gè)細(xì)胞的密度而被分離。
在一個(gè)實(shí)施例中，再生細(xì)胞組合物、例如含有再生細(xì)胞和膠原酶的溶液被引入自旋轉(zhuǎn)子的室中，如圖9.1所示。在溶液被添加至室中之后，另外的鹽水以預(yù)定的流率被添加至室中。鹽水的流率可以作為轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速、細(xì)胞直徑和已憑經(jīng)驗(yàn)建立的室常量的函數(shù)而被預(yù)定。利用例如類(lèi)似于IV泵的裝置來(lái)控制流率。另加鹽水的目的是在轉(zhuǎn)子室內(nèi)側(cè)提供一定的條件，其中更大微粒將運(yùn)動(dòng)至室的一側(cè)，而更小的微粒將運(yùn)動(dòng)至另一側(cè)，如圖g.2所示。調(diào)節(jié)流量，使得在本申請(qǐng)中，更小的微粒將離開(kāi)室并運(yùn)動(dòng)至廢物容器，如圖9.3所示。這種運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致轉(zhuǎn)子室內(nèi)的溶液具有基本上同質(zhì)的細(xì)胞群體，例如干細(xì)胞。在已確定干細(xì)胞已經(jīng)與溶液中的其它成分分離之后(其中不需要的蛋白質(zhì)和游離脂質(zhì)已經(jīng)從室中去除)，就停止逆流。室內(nèi)的細(xì)胞然后在室的外壁上形成濃縮的沉淀。反轉(zhuǎn)逆流，并且細(xì)胞沉淀被傳輸至輸出袋。
如上所述，處理室30或輸出室50可包括一個(gè)或多個(gè)端口，例如端口51或52。這些端口中的一個(gè)或多個(gè)可以設(shè)計(jì)成可使用上述方法的任何組合或其一部分輸送獲得的再生細(xì)胞，并經(jīng)由導(dǎo)管而將其輸送至其它手術(shù)器件、細(xì)胞培養(yǎng)器件、細(xì)胞浸泡器件、基因治療器件或提純器件。這些端口也可以設(shè)計(jì)成可將再生細(xì)胞經(jīng)由導(dǎo)管輸送至系統(tǒng)內(nèi)的其它室或容器或另一系統(tǒng)的用于上述相同目的一部分。端口和導(dǎo)管也可以用于添加一種或多種添加劑，例如生長(zhǎng)因子，再懸浮流體，細(xì)胞培養(yǎng)試劑，細(xì)胞增殖試劑，細(xì)胞保存試劑或細(xì)胞修飾試劑，包括將基因移送至細(xì)胞的試劑。端口和導(dǎo)管也可用于將再生細(xì)胞輸送至其它目標(biāo)，例如移植材料(例如骨骼或骨骼碎片)以及其它手術(shù)移植物和器件。
也可以通過(guò)重新配置現(xiàn)有系統(tǒng)的一次性組的互連，重編現(xiàn)有系統(tǒng)的處理器件的程序，通過(guò)為現(xiàn)有系統(tǒng)提供不同或附加的容器和/或室，通過(guò)將細(xì)胞輸送至一個(gè)或多個(gè)附加的系統(tǒng)或器件和/或任何它們的組合，這樣來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞的進(jìn)一步處理。例如，系統(tǒng)可以通過(guò)任何上述任何手段來(lái)重新配置，使得利用該系統(tǒng)獲得的再生細(xì)胞可以經(jīng)受以下一種或多種處理(一個(gè)或多個(gè)再生細(xì)胞類(lèi)型的)細(xì)胞增殖和細(xì)胞維護(hù)(包括細(xì)胞片漂洗和介質(zhì)更換)；傳代培養(yǎng)；細(xì)胞接種；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(包括從大量供應(yīng)源中接種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)；采集(包括酶催化的采集、無(wú)酶催化的采集和通過(guò)機(jī)械刮擦進(jìn)行的采集)；測(cè)量細(xì)胞存活性；細(xì)胞涂布(例如在微量滴定板上進(jìn)行，包括從單個(gè)孔中挑出細(xì)胞進(jìn)行增殖，將細(xì)胞擴(kuò)展到新孔中)；高通量篩選；細(xì)胞治療應(yīng)用；基因治療應(yīng)用；組織工程應(yīng)用；治療性蛋白質(zhì)應(yīng)用；病毒疫苗應(yīng)用；采集再生細(xì)胞或上清液以用于集中或篩選，測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)，溶胞，接種，感染或誘導(dǎo)；產(chǎn)生細(xì)胞系(包括雜交瘤細(xì)胞)；培養(yǎng)細(xì)胞以用于透過(guò)性研究；細(xì)胞用于RNAi和抗病毒研究；細(xì)胞用于敲除和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究；親和純化研究；結(jié)構(gòu)生物學(xué)應(yīng)用；試驗(yàn)開(kāi)發(fā)和蛋白質(zhì)工程應(yīng)用。
例如，如果再生細(xì)胞群體的增殖是特定應(yīng)用所要求的，那么就可以使用這樣的方法，即，利用優(yōu)選增殖該群體同時(shí)其它群體保持不變(并因被生長(zhǎng)的選擇細(xì)胞稀釋而減少)或由于缺乏所要求的生長(zhǎng)條件而喪失的培養(yǎng)條件。Sekiya等人已經(jīng)描述了這方面可用于源自骨髓的干細(xì)胞的條件(Sekiya等人，2002)。該方法(與或不與差異性粘附至組織培養(yǎng)塑料)可以應(yīng)用于本發(fā)明的另一實(shí)施例中。在該實(shí)施例中，最終的再生細(xì)胞沉淀從輸出室中取出，并且置于提供了細(xì)胞培養(yǎng)成分的第二系統(tǒng)中。這可以為傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)器或生物反應(yīng)器樣式器件的形式，例如Tsao等人的US專(zhuān)利No.6001642所述，或Armstrong等人的US專(zhuān)利No.6238908所述。在一個(gè)備選實(shí)施例中，細(xì)胞增殖或細(xì)胞培養(yǎng)成分可被添加至現(xiàn)有系統(tǒng)中，例如添加至輸出室中，從而允許源自脂肪的細(xì)胞群體的短期粘附和/或細(xì)胞培養(yǎng)。該備選實(shí)施例可允許將細(xì)胞培養(yǎng)和/或細(xì)胞增殖成分集成在系統(tǒng)中，并且不需要從該系統(tǒng)中取出細(xì)胞并且放置在另一系統(tǒng)內(nèi)。
在處理過(guò)程中，一種或多種添加劑可根據(jù)需要來(lái)添加至或供應(yīng)至各種室或容器，以便改善結(jié)果。這些添加劑也可以作為另一系統(tǒng)的一部分來(lái)提供，該另一系統(tǒng)與現(xiàn)有系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)或與現(xiàn)有系統(tǒng)分開(kāi)。例如，在某些實(shí)施例中，添加劑被添加或提供，而無(wú)需從系統(tǒng)中取出再生細(xì)胞。在其它實(shí)施例中，通過(guò)將包括添加劑的新容器或室以無(wú)菌的方式連接在系統(tǒng)的未用端口上，來(lái)添加或提供添加劑。在其它實(shí)施例中，添加劑被添加或提供至未連接在本發(fā)明系統(tǒng)上的第二系統(tǒng)或器件。添加劑的一些示例包括優(yōu)化洗滌和解集的試劑，增強(qiáng)活性細(xì)胞群體在處理過(guò)程中的存活性的添加劑，抗微生物試劑(例如抗生素)，溶解脂肪細(xì)胞和/或紅細(xì)胞的添加劑，或富集目標(biāo)細(xì)胞群體的添加劑(通過(guò)差異化粘附在固相部分上或以其它方式，促進(jìn)細(xì)胞群體的顯著減少或富集)，如本文所述。
例如，為了獲得同質(zhì)的再生細(xì)胞群體，可以采用用于分離和濃縮特定再生細(xì)胞類(lèi)型的任何合適方法，例如使用細(xì)胞特異性抗體，其能夠識(shí)別并結(jié)合存在于例如干細(xì)胞或祖細(xì)胞如內(nèi)皮前體細(xì)胞上的抗原。這包括正選擇(選擇目標(biāo)細(xì)胞)，負(fù)選擇(選擇性地除去不需要的細(xì)胞)，或它們的組合。細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記例如酶也可以用于使用分子的選擇，所述分子與特定酶作用時(shí)會(huì)發(fā)熒光。另外，具有粘附性能的固相材料可以被插入系統(tǒng)的輸出室中，該材料的性能被選擇成允許差異性粘附和/或洗脫最終細(xì)胞沉淀內(nèi)的特定再生細(xì)胞群體。
這種不同粘附方法的一個(gè)備選實(shí)施例包括使用識(shí)別在目標(biāo)再生細(xì)胞和不需要細(xì)胞上差異性表達(dá)的表面分子的抗體和/或抗體組合?；谔囟?xì)胞表面標(biāo)記(或它們的組合)的表達(dá)來(lái)進(jìn)行選擇是另一種常用技術(shù)，其中抗體(直接地或間接地)粘附在固相支持結(jié)構(gòu)上(Geiselhart等人，1996；Formanek等人，1998；Graepler等人，1998；Kobari等人，2001；Mohr等人，2001)。
在另一實(shí)施例中細(xì)胞沉淀可以再懸浮起來(lái)，堆積在形成了連續(xù)或不連續(xù)密度梯度的流體物質(zhì)之上(或之下)，并置于離心器中，以便用于根據(jù)細(xì)胞密度來(lái)分離細(xì)胞群體。在類(lèi)似的實(shí)施例中，也可以采用連續(xù)流動(dòng)的方法，例如脫落(apheresis)(Smith，1997)和淘析(有或沒(méi)有逆流)(Lasch等人，2000)(Ito和Shinomiya，2001)。
添加劑的其它示例可包括附加的生物學(xué)成分或結(jié)構(gòu)成分，例如細(xì)胞分化因子，生長(zhǎng)促進(jìn)劑，免疫抑制劑，醫(yī)學(xué)器件，或任何它們的組合，如下文中所述。例如，可以添加其它的細(xì)胞，組織，組織碎片，生長(zhǎng)因子如VEGF和其它已知的血管生成性或動(dòng)脈生成性生長(zhǎng)因子，生物活性或惰性的化合物，可吸收支架，或用于改善再生細(xì)胞群體的傳送、功效、耐受力或功能的其它添加劑。再生細(xì)胞群體也可以通過(guò)插入DNA或置于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(如本文所述或本領(lǐng)域中已知的)中來(lái)修飾，以便改變、增強(qiáng)或補(bǔ)充再生細(xì)胞的功能，從而用于衍生出結(jié)構(gòu)或治療目的。例如，用于干細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，例如公開(kāi)于(Morizono等人，2003；Mosca等人，2000)中，并且可包括病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，更具體而言為與腺伴隨病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，例如公開(kāi)于(Walther和Stein，2000)和(Athanasopoulos等人，2000)中。也可以進(jìn)行不基于病毒的技術(shù)，例如公開(kāi)于(Muramatsu等人，1998)中。也可以添加編碼一種或多種細(xì)胞分化因子如生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子的基因。各種細(xì)胞分化試劑的示例公開(kāi)于(Gimble等人，1995；Lennon等人，1995；Majumdar等人，1998；Caplan和Goldberg，1999；Ohgushi和Caplan，1999；Pittenger等人，1999；Caplan和Bruder，2001；Fukuda，2001；Worster等人，2001；Zuk等人，2001)之中。也可以添加編碼抗凋亡因子或試劑的基因。添加基因(或基因的組合)可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來(lái)進(jìn)行，包括但不限于腺病毒轉(zhuǎn)染，″基因槍″，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒(Ientivirus)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒，腺伴隨病毒。這些再生細(xì)胞然后可連同攜帶基因傳送媒介的材料一起進(jìn)行移植，該傳遞體材料能夠隨時(shí)間將基因釋放和/或呈送至細(xì)胞，使得轉(zhuǎn)染可繼續(xù)進(jìn)行或原位啟動(dòng)。
當(dāng)細(xì)胞和/或含有細(xì)胞的組織被給予(例如注射)到從其獲得細(xì)胞和/或組織的患者以外的患者時(shí)，可以給予一種或多種免疫抑制劑至接受細(xì)胞和/或組織的患者，以減少和優(yōu)選預(yù)防移植排斥反應(yīng)。本文所使用的用語(yǔ)″免疫抑制藥物或試劑″包括藥物，其抑制或干擾正常的免疫功能。適合用于本文所公開(kāi)的方法的免疫抑制劑的示例包括抑制T細(xì)胞/B細(xì)胞共同刺激途徑的試劑，例如通過(guò)CTLA4和B7途徑干擾T-細(xì)胞和B-細(xì)胞偶聯(lián)的試劑，例如公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利公告號(hào)No.20020182211中。優(yōu)選的免疫抑制劑是環(huán)孢霉素A。其它示例包括myophenylate mofetil，雷帕霉素和抗胸腺細(xì)胞球蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，免疫抑制藥物連同至少一種其它治療劑一起給予。免疫抑制藥物在與給予途徑相容的配方中給予，并且以足以實(shí)現(xiàn)所需治療效果的劑量而給予接受者。在另一實(shí)施例中，免疫抑制藥物被臨時(shí)地給予一段足夠的時(shí)間，以便誘發(fā)本發(fā)明的再生細(xì)胞的耐受性。
在這些實(shí)施例中，再生細(xì)胞可以通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方式來(lái)接觸、組合、混合或添加至添加劑，包括器件如本文所述的攪動(dòng)器件和相關(guān)的方法。例如，可以使用搖晃、倒置、壓縮脈沖或移動(dòng)滾子。
在另一方面，細(xì)胞群體可以被置于接受者體內(nèi)并且由可吸收塑料鞘套或其它材料和相關(guān)的部件來(lái)包圍，例如由MacroPoreBiosurgery公司制造的材料和相關(guān)的部件(例如見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.6269716；5919234；6673362；6635064；6653146；6391059；6343531；6280473)。
在所有前述實(shí)施例中，至少一部分被分離且濃縮的再生細(xì)胞可以被冷藏，如2002年9月12日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/242094中所述，其題目為“保存來(lái)自于非造血組織的非胚胎細(xì)胞”，其要求2001年9月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)60/322070的優(yōu)先權(quán)，并且其被共同轉(zhuǎn)讓?zhuān)@些專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用而明確地結(jié)合于本文中。
在處理結(jié)束時(shí)，再生細(xì)胞可以從輸出室中人工地取出。細(xì)胞可以被置于傳送器件如注射器中，以便通過(guò)皮下注射、肌肉內(nèi)注射或允許將細(xì)胞傳遞至患者目標(biāo)部位內(nèi)的其它技術(shù)，而置于接受者體內(nèi)。換句話說(shuō)，細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何手段而被置于患者體內(nèi)。優(yōu)選實(shí)施例包括通過(guò)針或?qū)Ч軄?lái)放置，而修改的實(shí)施例包括通過(guò)直接的手術(shù)移植來(lái)放置。在其它實(shí)施例中，細(xì)胞可以被自動(dòng)地輸送至輸出室，其可以為容器、注射器或?qū)Ч艿鹊鹊男问剑⑶移淇捎糜趯⒓?xì)胞置入患者體內(nèi)。容器也可用于儲(chǔ)存細(xì)胞以便以后使用，或用于冷藏。所有的取出方法是以無(wú)菌的方式來(lái)執(zhí)行的。在手術(shù)移植的實(shí)施例中，細(xì)胞可以連同添加物一起施用，例如預(yù)成型的基體或支架，如本文所述。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中(例如如圖4所示的實(shí)施例)，系統(tǒng)是自動(dòng)化的。在另一實(shí)施例中，系統(tǒng)同時(shí)具有自動(dòng)化的和手動(dòng)的部件。系統(tǒng)可包括一個(gè)或多個(gè)一次性的部件，其連接在或安裝在可再用的硬件部件或模塊上。本發(fā)明的自動(dòng)化系統(tǒng)提供了屏幕顯示(見(jiàn)
圖16)，其可有助于系統(tǒng)的正確操作。自動(dòng)化的系統(tǒng)也可提供屏幕，其通過(guò)步驟說(shuō)明而提供了程序和/或步驟的狀態(tài)，以便正確地安裝系統(tǒng)的一次性部件。屏幕也可顯示在系統(tǒng)中出現(xiàn)的問(wèn)題或故障，并且在適當(dāng)時(shí)提供″故障查找″指導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施例中，屏幕是用戶(hù)界面屏幕，其允許使用者通過(guò)例如觸摸屏幕而將參數(shù)輸入至系統(tǒng)中。
部分地和完全地自動(dòng)化的系統(tǒng)可包括處理器件(例如，微處理器或個(gè)人計(jì)算機(jī))和相關(guān)的軟件程序，其提供用于系統(tǒng)的控制邏輯，以便基于使用者的輸入，來(lái)操作和自動(dòng)化進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)處理步驟。在某些實(shí)施例中，系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)方面可以允許使用者借助于留在處理器件中的軟件來(lái)進(jìn)行編程。處理器件可在只讀存儲(chǔ)器(ROM)中具有一個(gè)或多個(gè)預(yù)定程序的軟件程序。例如，處理器件可具有預(yù)定程序的軟件，其設(shè)計(jì)成可用于處理血液，用于處理脂肪組織以便獲得小體積的再生細(xì)胞的另一程序，以及用于處理脂肪組織以便獲得更大體積的再生細(xì)胞的另一程序。處理器件也可具有預(yù)定程序的軟件，其為使用者提供適當(dāng)?shù)膮?shù)，以便基于使用者輸入的相關(guān)信息如所要求的再生細(xì)胞的量、所處理的組織的類(lèi)型、所要求的后處理操作的類(lèi)型、治療應(yīng)用的類(lèi)型等等，來(lái)優(yōu)化處理。
軟件也可允許步驟的自動(dòng)操作，例如通過(guò)控制系統(tǒng)的泵和閥，來(lái)控制流體和組織沿著特定管路徑的流入和流出；控制啟動(dòng)的正確順序和/或方向；用壓力傳感器檢測(cè)阻擋；混合機(jī)構(gòu)，使用容積機(jī)構(gòu)測(cè)量沿著特定通路移動(dòng)的組織和/或流體的量；使用熱控制器件來(lái)保持各種部件的溫度；以及將分離和濃縮處理與定時(shí)和軟件機(jī)理集成在一起。處理器件也可基于待處理的組織類(lèi)型和/或待采集的細(xì)胞群體或子群體，以及待執(zhí)行的程序的類(lèi)型(例如，使用增加有再生細(xì)胞的脂肪組織進(jìn)行組織增強(qiáng)，或處理細(xì)胞以利用涂覆了再生細(xì)胞的骨骼移植物來(lái)進(jìn)行骨骼修復(fù)應(yīng)用)，來(lái)控制離心速度。處理器件還可包括標(biāo)準(zhǔn)的并行或串行端口或與其它計(jì)算機(jī)或網(wǎng)絡(luò)通信的其它手段。因此，處理器件可以是獨(dú)立的單元，或者與一個(gè)或多個(gè)附加的器件相關(guān)聯(lián)，以用于本文所述的其它處理方法。
軟件可允許用于自動(dòng)化采集″運(yùn)行數(shù)據(jù)″，例如包括一次性部件的批號(hào)，溫度和體積測(cè)量值，組織體積和細(xì)胞數(shù)量參數(shù)，所施加的酶的劑量，培養(yǎng)時(shí)間，操作者身份，日期和時(shí)間，患者身份，等等。在器件特征識(shí)別系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，例如條形碼閱讀系統(tǒng)將被集成起來(lái)，以便允許將這些變量(例如一次性組的批號(hào)和有效期，膠原酶的批號(hào)和有效期，患者/樣品標(biāo)識(shí)符等等)數(shù)據(jù)輸入處理器件，而作為該處理的部分文件。這將減少數(shù)據(jù)輸入出錯(cuò)的幾率。這種條形碼閱讀系統(tǒng)可以利用USB或本領(lǐng)域已知的其它接口端口和系統(tǒng)而被容易地結(jié)合在處理器件中。這樣，器件將提供數(shù)據(jù)進(jìn)入和處理文件的集中控制。這些參數(shù)的打印出的報(bào)告將是系統(tǒng)編程操作的用戶(hù)定義參數(shù)的一部分。自然，這將要求將打印機(jī)部件(硬件和驅(qū)動(dòng)器)或打印機(jī)驅(qū)動(dòng)軟件連同打印機(jī)的界面輸出連接器(例如USB端口)集成在該裝置的硬件中。
在某些實(shí)施例中，系統(tǒng)是完全自動(dòng)化的系統(tǒng)。例如，使用者可初始地選擇待處理組織的量，將系統(tǒng)連接至患者，系統(tǒng)可以不間斷的順序來(lái)自動(dòng)地吸出所要求的組織并分離和濃縮再生細(xì)胞，而無(wú)需使用者的進(jìn)一步輸入。使用者也可輸入所要求的再生細(xì)胞的量并允許系統(tǒng)吸出所需量的組織并對(duì)組織進(jìn)行處理。完全自動(dòng)化的系統(tǒng)還包括系統(tǒng)，其能夠基于許多(例如兩個(gè)或多個(gè))使用者輸入?yún)?shù)來(lái)重新配置，例如洗滌循環(huán)的數(shù)量，離心的速度，等等。系統(tǒng)也可以以半自動(dòng)化的模式來(lái)運(yùn)行，在該過(guò)程中，系統(tǒng)進(jìn)行某些步驟而無(wú)需使用者干預(yù)，但在進(jìn)行某些處理過(guò)程之前要求使用者進(jìn)行干預(yù)。在其它實(shí)施例中，系統(tǒng)是單個(gè)集成的系統(tǒng)，其顯示了使用說(shuō)明，以便引導(dǎo)使用者在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)執(zhí)行預(yù)定的操作。例如，處理器件可提示使用者進(jìn)行正確插入管子、室和系統(tǒng)的其它部件所必須的步驟。因此，使用者可確保操作的正確順序得以執(zhí)行。這種系統(tǒng)可另外要求使用者確認(rèn)每一操作步驟，以防止無(wú)意中啟動(dòng)或終止處理步驟。在另一實(shí)施例中，系統(tǒng)可啟動(dòng)自動(dòng)化的檢測(cè)，以便確認(rèn)正確插入了管子、室，缺乏阻擋等等。在另外一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的系統(tǒng)能夠進(jìn)行編程，以便通過(guò)自動(dòng)控制組織流過(guò)系統(tǒng)來(lái)執(zhí)行多個(gè)分離和濃縮處理。這一特征可能是重要的，例如，在患者的外科手術(shù)過(guò)程中，其中丟失的組織被采集到系統(tǒng)中，并且組織的再生細(xì)胞被分離并濃縮并返回至患者。
如上所述，系統(tǒng)的部件可以是一次性的(在本文中稱(chēng)為″一次性組″)，使得系統(tǒng)的部件可以在一次使用之后被丟棄。該實(shí)施例可有助于確保與患者組織相接觸的任何表面將在使用之后被正確地丟棄掉。示例性的一次性組如
圖13所示。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，系統(tǒng)的一次性部件預(yù)先進(jìn)行滅菌，并且包裝起來(lái)以便可″非定制′使用，這樣就易于使用并且易于裝載，而且不需要使用許多管子連接件和管子連接件的復(fù)雜連接。這種一次性部件制造起來(lái)比較便宜，因此，由于其不會(huì)因?yàn)槠湟淮涡允褂枚a(chǎn)生較高的費(fèi)用。在一個(gè)實(shí)施例中，一次性的系統(tǒng)(本文中互換地稱(chēng)為″一次性組″)基本上包括或包括或由以下部件組成采集室20，處理室30，廢物室40，輸出室50，過(guò)濾器組件36，樣品袋60和相關(guān)的導(dǎo)管12或管子。在系統(tǒng)的一次性組的優(yōu)選實(shí)施例中，采集室20和處理室30通過(guò)容納在剛性框架中的導(dǎo)管12相連。處理室30的旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)(圖7&8)也可以容納在同一剛性框架中。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，一次性組的各種室和容器包括必要的界面，其能夠與系統(tǒng)的處理器件通信，使得自動(dòng)化系統(tǒng)的泵、閥、傳感器和其它器件根據(jù)需要而被適當(dāng)?shù)貑?dòng)或停用，而無(wú)需使用者干預(yù)。界面也減少了裝配系統(tǒng)所要求的時(shí)間和專(zhuān)業(yè)知識(shí)，并且也通過(guò)顯示如何正確地裝配系統(tǒng)以及在出現(xiàn)錯(cuò)誤安裝時(shí)提醒使用者，而減少了錯(cuò)誤。
本發(fā)明的大多數(shù)一次性組具有許多常用元件。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，系統(tǒng)的不同應(yīng)用會(huì)要求附加的部件，其可以是一次性組的一部分。因此，一次性組還可包括一個(gè)或多個(gè)針或注射器，其適合于從患者獲得脂肪或其它組織并將再生細(xì)胞返回給患者。所包括的各種針和注射器的類(lèi)型和數(shù)量將取決于所處理組織的類(lèi)型和量。一次性組還可包括一個(gè)或多個(gè)剛性的或柔性的容器，用于保持系統(tǒng)中所用的洗滌流體和其它處理試劑。例如，一次性組可包括容器，其用于保持鹽水、酶和程序所要求的任何其它治療流體或替換流體。另外，合適洗滌溶液，再懸浮流體，添加劑，試劑或移植材料可以連同一次性組一起提供，以便與本發(fā)明的系統(tǒng)和方法一起使用。
本文所述的或?qū)嵺`本發(fā)明所要求的系統(tǒng)部件、設(shè)備或供應(yīng)源的任何組合可以以成套工具的形式來(lái)提供。例如，本發(fā)明的成套工具可包括例如用于基于注射器的吸脂術(shù)的最佳長(zhǎng)度和型號(hào)的針和無(wú)菌注射器，所述這些注射器包含優(yōu)選的過(guò)濾介質(zhì)，其可用于處理小體積的組織?？梢耘c本發(fā)明一起使用并且也可包括在本發(fā)明成套工具中的其它示例性的設(shè)備和供應(yīng)源在表II和表III中列出。
下表II顯示了供應(yīng)源的示例，其可以根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法而用于獲得源自脂肪的再生細(xì)胞
表II
下表III顯示了與本文所公開(kāi)的系統(tǒng)和方法一起使用的設(shè)備。
表III
系統(tǒng)的可再用部件基本上包括、包括或由以下部件組成用于采集室的攪動(dòng)機(jī)構(gòu)，泵，用于啟動(dòng)閥和泵控制的各種傳感器，離心電動(dòng)機(jī)、離心電動(dòng)機(jī)的旋轉(zhuǎn)框，用戶(hù)界面屏幕和USB端口，用于連接一次性組的互鎖或?qū)悠骷驑?gòu)造，使得一次性組安全地連接在可再用的硬件部件和其它相關(guān)的器件上并與之形成接口。示例性的可再用部件顯示于
圖14中。在優(yōu)選實(shí)施例中，可再用部件包括用于從再生細(xì)胞組合物中分離和濃縮出再生細(xì)胞的裝置，例如旋轉(zhuǎn)離心機(jī)。在該實(shí)施例中，可再用部件設(shè)計(jì)成連接在一次性組的一部分處理室(包括離心室)上并與之形成接口，如
圖15A所示。可以理解，在可再用部件中用于分離和濃縮再生細(xì)胞的裝置不限于旋轉(zhuǎn)離心機(jī)，而是還可包括本文所述的任何其它構(gòu)造，包括自旋膜片過(guò)濾器。可再用部件也可容納本文所述的處理器件，其中包含預(yù)定程序的軟件，以用于執(zhí)行若干不同的組織處理程序以及因此而選擇性地啟動(dòng)系統(tǒng)的各種泵和閥。處理器還可包括數(shù)據(jù)儲(chǔ)存容量，用于儲(chǔ)存供體/患者信息，處理或采集信息和其它數(shù)據(jù)以用于以后的下載或匯編。可再用部件可以與各種一次性組一起使用。一次性組例如通過(guò)互鎖器件或構(gòu)造而連接在可再用部件上，以便連接一次性組，使得一次性組以一定的方式而安全地連接在可再用的硬件部件并與之形成接口，使得可再用部件上所設(shè)的處理器件可控制，即，發(fā)送信號(hào)至一次性組的各種部件以及可再用部件的各種部件和其它相關(guān)器件和系統(tǒng)，以及從中接收信號(hào)。
在一個(gè)實(shí)施例中，用于系統(tǒng)中的一次性組包括采集室20，其可容納大約800毫升的組織；處理室30，其可處理在采集室20中被洗滌和消化的大約800毫升組織所產(chǎn)生的再生細(xì)胞組合物；輸出室50，其可容納至少0.5毫升的再生細(xì)胞；以及廢物容器40，其可容納大約10L的廢物。在該實(shí)施例中，硬件器件不大于24″長(zhǎng)×18″寬×36″高。一次性組以及硬件器件的各種部件的備選尺寸可以根據(jù)需要來(lái)構(gòu)成，并且將由本發(fā)明來(lái)無(wú)限制性地涵括。
系統(tǒng)的一次性部件易于放置在器件上。帶有相應(yīng)可再用部件組裝在一起的所用一次性組的視圖顯示在
圖15A中。系統(tǒng)優(yōu)選設(shè)計(jì)成使得它可檢測(cè)不適當(dāng)?shù)匮b載的一次性部件。例如，每一一次性組的部件可具有顏色引導(dǎo)的標(biāo)記，以便將管子、室等正確地對(duì)準(zhǔn)和插入到系統(tǒng)的適當(dāng)位置中。在另外的實(shí)施例中，本文所公開(kāi)的系統(tǒng)是便攜式單元。例如，該便攜式單元能夠從已經(jīng)采集了脂肪組織的一個(gè)位置移動(dòng)至用于脂肪組織采集的另一位置。在某些實(shí)施例中，便攜式單元適合于在患者的床邊采集和處理脂肪組織。因此，便攜式單元可以是可以從患者移動(dòng)至患者的系統(tǒng)的一部分。因此，便攜式單元可以設(shè)在輪子上，其被鎖定就位，并因此而可以在方便的位置容易地放置和使用，并且在整個(gè)程序中處于穩(wěn)定且安全的位置。在其它實(shí)施例中，便攜式單元設(shè)計(jì)成用于在平坦面例如桌子頂面上安裝和操作。便攜式單元也可以被封閉在外殼單元中。便攜式單元可進(jìn)一步包括吊架，鉤子，標(biāo)簽，比例尺和其它器件，以便有助于該程序的進(jìn)行。所有本文中介紹的系統(tǒng)的可再用部件，例如離心機(jī)、處理器件、顯示屏幕，可以安裝在系統(tǒng)的便攜式單元中。
用于獲得再生細(xì)胞的備選的手動(dòng)實(shí)施例也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，可以使用本文所述的部件系統(tǒng)、設(shè)備和/或供應(yīng)源的任何組合來(lái)處理脂肪組織。
本發(fā)明的系統(tǒng)的手動(dòng)實(shí)施例可以根據(jù)以下步驟和信息來(lái)實(shí)施，這些步驟和信息通過(guò)示例的方式而并非通過(guò)限制的方式來(lái)提供。首先，脂肪組織從患者體內(nèi)采集。組織取出管線、或取樣部位聯(lián)接器打開(kāi)，并且長(zhǎng)釘被插入600ml血液袋的側(cè)面端口中。大約10ml的脂肪組織通過(guò)鈍套管而被采集到10ml注射器中。該鈍套管被相對(duì)銳利的針(14G)取代。取樣部位用碘酒擦拭。脂肪組織通過(guò)取樣部位被注入600ml袋中。注射器和針然后被丟棄到銳尖物體室中。重復(fù)這些步驟，以便將足夠的組織置入袋中。足夠的組織是在不同情況的基礎(chǔ)上基于患者的臨床具體情形和應(yīng)用來(lái)確定的。
其次，對(duì)吸出的脂肪組織進(jìn)行洗滌。預(yù)溫?zé)?37℃)的鹽水袋被掛在工作面上。藍(lán)色止血夾鉗設(shè)置在管子上并處于600ml袋和長(zhǎng)釘之間。夾鉗閉合，以便密封管子。600ml袋上的長(zhǎng)釘用于插入鹽水袋中(在這種設(shè)置使用中，600ml袋上的針用于穿過(guò)橡膠隔片而進(jìn)入鹽水袋中，在插入針之前，用碘酒擦拭隔片)。藍(lán)色夾鉗被釋放開(kāi)，大約150ml的鹽水被允許進(jìn)入600ml袋中。當(dāng)所需體積的鹽水已經(jīng)進(jìn)入600ml袋之后，藍(lán)色夾鉗閉合。600ml袋在大約15秒鐘內(nèi)被倒置10-15次。第二藍(lán)色夾鉗施加在從3L廢物袋通往長(zhǎng)釘?shù)墓茏由稀?L袋上的長(zhǎng)釘用于進(jìn)入600ml袋中。600ml袋被倒置懸掛在工作面上，并且被允許擱置大約1分鐘。通往3L袋的藍(lán)色夾鉗被釋放開(kāi)。允許廢物流體流入3L袋中。在組織進(jìn)入管子之前，施加上藍(lán)色夾鉗，以便阻止流動(dòng)。600ml袋下降至工作面。這些步驟重復(fù)兩次以上。如果鹽水廢物仍然看起來(lái)比較紅，那么就表明要進(jìn)行第三次附加的循環(huán)。熱密封器用于將管子密封在3L廢物袋和600ml袋之間。大約在管子的中間點(diǎn)處進(jìn)行密封。3L廢物袋被取下并丟棄。600毫升袋回到工作面。
第三，對(duì)洗滌的脂肪組織進(jìn)行消化。處于鹽水和600ml袋之間的管子上的藍(lán)色夾鉗被釋放開(kāi)，以允許大約150ml的鹽水進(jìn)入600ml袋中。600ml袋上的取樣部位用碘酒擦拭。膠原酶被注入穿過(guò)取樣部位而進(jìn)入600ml袋中。通過(guò)在37℃水浴槽或除了微波加熱的等效形式中融化一個(gè)膠原酶管瓶，來(lái)制備膠原酶。帶有22G針的1ml注射器被插入管瓶中。膠原酶被抽取到針中。該針被取下，并用0.2微米的過(guò)濾器和第二22G針取代。膠原酶然后從注射器中通過(guò)0.2微米過(guò)濾器和針而排出。在0.1-0.2Wunsch單位/ml的最終膠原酶濃度下進(jìn)行脂肪組織的消化。加熱墊放在搖桿上。在此期間，仍然相連的鹽水袋設(shè)在搖桿的側(cè)面。要注意確保通往鹽水袋的管子以這種方式來(lái)定位，使得它在運(yùn)動(dòng)時(shí)不會(huì)纏繞在搖桿上。加熱墊控制器設(shè)定為37℃。600ml袋設(shè)在搖桿上。搖桿被設(shè)定為最大。對(duì)袋進(jìn)行觀察，以確保它是穩(wěn)定的，并且允許其搖動(dòng)大約1小時(shí)(55±10分鐘)。
第四，取出再生細(xì)胞組合物。袋從搖桿上取下。藍(lán)色夾鉗施加在之前通往廢物袋的封閉管子上。無(wú)菌的連接器件是用于將四邊形袋組(根據(jù)以下說(shuō)明來(lái)預(yù)制備)連在之前連接在廢物袋上的管子上。可以看到，四邊形包是兩個(gè)相連的四邊形包。識(shí)別管子并將分成兩個(gè)包，將管子自身折疊，并且將金屬環(huán)滑動(dòng)到折疊的管子上(即這兩段管子上)。使環(huán)向下滑動(dòng)大約0.5英寸。在彎曲處形成的卷邊用于密封管子。使用止血裝置來(lái)部分地使環(huán)卷邊閉合起來(lái)。環(huán)未過(guò)緊地卷邊，因?yàn)榄h(huán)需要在處理過(guò)程中取下。600ml袋被倒置懸掛在工作面上，并且被允許擱置大約3分鐘。通往四邊形組的管子上的藍(lán)色夾鉗被釋放開(kāi)，以便將細(xì)胞部分(在黃色/橙色脂肪層下方的層)排到四邊形組中。要注意防止脂肪層進(jìn)入管子中。在這種處理過(guò)程中，管子可以被人工地卷邊，以便在脂肪層接近管子時(shí)減慢流動(dòng)。通往四邊形袋組的管子然后用藍(lán)色夾鉗封閉，600毫升袋回到工作面，并且鹽水袋被懸掛起來(lái)。處于鹽水和600ml袋之間的管子上的藍(lán)色夾鉗被釋放開(kāi)，以允許大約150ml的鹽水進(jìn)入600ml袋。600ml袋在大約15秒鐘內(nèi)倒置大約10-15次。600ml袋然后倒置懸掛在工作面之上，并且被允許擱置大約3-5分鐘。通往四邊形組的管子上的藍(lán)色夾鉗被釋放開(kāi)，并且細(xì)胞部分(黃色/橙色脂肪層下方的層)被排出而進(jìn)入四邊形組中。要注意防止脂肪層進(jìn)入管子中。例如，在脂肪層接近管子時(shí)，可通過(guò)人工地對(duì)管子進(jìn)行卷邊來(lái)減慢流動(dòng)。通往四邊形袋組的管子用藍(lán)色夾鉗來(lái)封閉。從四邊形組至600ml袋的管子然后被熱密封。然后取下和丟棄600ml袋。
第五，洗滌再生細(xì)胞組合物。金屬夾子設(shè)在兩個(gè)滿袋之間的管子上，以便密封管子。四邊形組放置在天平上。水被添加至第二″模擬″四邊形上，其設(shè)置成用于平衡四邊形組。四邊形組和平衡組放置在離心機(jī)的相對(duì)吊桶上。對(duì)于中空的過(guò)濾器而言，細(xì)胞被洗滌并置于袋中，并且管子被密封在袋和如上所述的中空纖維過(guò)濾器組件之間。利用蠕動(dòng)泵，使流體流過(guò)過(guò)濾器組件，并且細(xì)胞濃縮物在下游端上被采集在袋中。應(yīng)注意確保四邊形組袋不受壓并且是直立的。離心機(jī)在400倍重力下操作達(dá)10分鐘。四邊形組從離心機(jī)中取出，并被置于血漿壓榨器中。注意以這種方式將袋置于壓榨器中，使得在袋頂部的硬管子剛好處在后板的頂部。如果袋太高則會(huì)留下太多的鹽水，如果它太低，則管子將干擾前板關(guān)閉的能力，因此同樣會(huì)留下太多的鹽水。藍(lán)色夾鉗是施加在從滿四邊形通往空四邊形的每一管線上。取下金屬環(huán)和藍(lán)色夾鉗，以允許上清液流入空的四邊形組中。盡可能多的鹽水被壓榨出，但應(yīng)注意不要除去細(xì)胞沉淀。伸入每一含有上清液的袋中的管子被熱密封。含有上清液的廢物袋被取下。藍(lán)色夾鉗被施加在通往每一含有細(xì)胞的四邊形組袋的管子上。從血漿壓榨器中取出所述袋。無(wú)菌的連接器件用于將通往四邊形包的管子連接在鹽水袋上。通往其中一個(gè)四邊形組袋的藍(lán)色夾鉗被取下，以允許大約150ml鹽水流入袋中，然后夾鉗被重新施加上，以阻止鹽水流動(dòng)。滿的四邊形組袋然后倒置大約10-15次達(dá)大約15秒鐘。通往空的四邊形組袋的藍(lán)色夾鉗然后取下，而滿的袋中的所有內(nèi)容物被排出到空袋中。金屬環(huán)夾鉗被重新施加，以便將管子密封在兩個(gè)四邊形組袋之間。管子然后被熱密封，并且鹽水袋被取下。滿的四邊形組袋然后在大約15秒鐘內(nèi)倒置大約10-15次。另一模擬四邊形組是放置在天平上，并且與細(xì)胞四邊形組重新形成平衡。四邊形組袋(一個(gè)是滿的，一個(gè)是空的)然后被置于離心機(jī)中，使得四邊形組袋未受壓并且是直立的。
離心機(jī)在大約400xg下操作10分鐘。四邊形組然后從離心機(jī)中取出，并且以這種方式被小心地置于血漿壓榨器中，即，使得袋頂部的硬管子剛好處在后板的頂部。如果袋太高則會(huì)留下太多的鹽水，如果它太低，則管子將干擾前板關(guān)閉的能力，因此同樣會(huì)留下太多的鹽水。取下金屬環(huán)，以便將全部上清液從滿的袋中壓榨出而進(jìn)入空袋中，但應(yīng)注意不要除去再生細(xì)胞沉淀。袋之間的管子被密封，并且滿的(廢物)袋被取下和丟棄。新取樣部位聯(lián)接器然后插入余下的袋中。細(xì)胞沉淀的細(xì)胞然后重新懸浮在殘余鹽水(如果有的話)中，以便獲得濃縮的再生細(xì)胞。再懸浮可以通過(guò)袋的輕柔操作來(lái)執(zhí)行(例如，擠壓和揉搓)。
實(shí)施本發(fā)明的系統(tǒng)的一個(gè)特定示例如圖4所示。圖4顯示了自動(dòng)化的系統(tǒng)和方法，用于從組織、例如脂肪組織中分離和濃縮出再生細(xì)胞，其適合于重新注入患者體內(nèi)。在如圖4所示系統(tǒng)的某些實(shí)施例中，系統(tǒng)還包括用于從患者吸出給定量的組織的自動(dòng)化步驟。如圖4所示系統(tǒng)包括
圖13所示一次性組，其連接在
圖14所示系統(tǒng)的可再用部件上，以便得到
圖15A所示系統(tǒng)的自動(dòng)化的實(shí)施例。一次性組例如通過(guò)互鎖或?qū)悠骷驑?gòu)造而連接在可再用部件上，所述互鎖或?qū)悠骷驑?gòu)造將一次性組連接在可再用部件上，使得一次性組以一定方式而安全地連接于并且相關(guān)聯(lián)于可再用的硬件部件，使得設(shè)在可再用部件上的處理器件可控制并對(duì)接、即發(fā)送信號(hào)至一次性組的各種部件以及可再用部件和其它相關(guān)的器件和系統(tǒng)的各種部件，以及從中接收信號(hào)。
使用者可將一次性組連接在可再用部件上，利用用戶(hù)界面來(lái)輸入某些參數(shù)、例如所采集的組織的體積，將系統(tǒng)連在患者，并且系統(tǒng)使用預(yù)定程序參數(shù)和/或使用者輸入?yún)?shù)，而以不間斷的順序自動(dòng)地執(zhí)行圖4所示的所有步驟。一個(gè)這種順序顯示于
圖15B中?；蛘撸M織可以通過(guò)使用者從患者人工地吸出，并且輸送至系統(tǒng)以便處理，即分離和濃縮再生細(xì)胞。
具體而言，如圖4所示，組織、例如脂肪組織可以使用導(dǎo)管12從患者抽取出，并且引入采集室20中。圖4所示采集室的詳細(xì)視圖如圖5所示。如圖5所示，采集室20可包括真空管線11，其使用標(biāo)準(zhǔn)的套管來(lái)促進(jìn)組織的取出。在這點(diǎn)上，使用者可輸入引導(dǎo)至采集室20的預(yù)估體積的組織。組織通過(guò)入口端口21而被引入采集室20中，入口端口21其是允許組織、鹽水和其它試劑以無(wú)菌的方式被添加至組織中的封閉式流體通路的一部分。系統(tǒng)的光學(xué)傳感器，例如傳感器29，可檢測(cè)何時(shí)使用者所輸入一定體積的組織存在于采集室20中。在某些實(shí)施例中，如果存在于采集室中的組織少于使用者的輸入，那么使用者可以選擇開(kāi)始處理存在于采集室20中的所述一定體積的組織。在某些實(shí)施例中，從患者取得的組織的一部分可以通過(guò)使用泵、例如蠕動(dòng)泵經(jīng)由導(dǎo)管而引導(dǎo)至樣品室60，所述泵可由使用者經(jīng)由用戶(hù)界面輸入而被啟動(dòng)。
傳感器29可發(fā)送信號(hào)至存在于可再用部件中的處理器件，以便啟動(dòng)洗滌和解集組織所需的步驟。例如，處理器件可基于采集的組織的體積，使用自動(dòng)化的閥和泵引入預(yù)定體積的洗滌試劑。這循環(huán)可以在采集室中重復(fù)，直到光學(xué)傳感器確定流出的液體足夠清澈并且沒(méi)有不需要的材料時(shí)為止。例如，沿著通往采集室12b或12d之外的導(dǎo)管而設(shè)置的光學(xué)傳感器29可檢測(cè)不需要的材料已經(jīng)被除去，并且可發(fā)送信號(hào)至處理器件，以便關(guān)閉所需的閥以及開(kāi)始下一步驟。
接下來(lái)，處理器件可基于采集的組織的體積而引入預(yù)定編程量的解集試劑。處理器件也可基于采集的組織的初始體積或基于使用者輸入，而啟動(dòng)對(duì)采集室中的組織進(jìn)行的攪動(dòng)達(dá)一定預(yù)定時(shí)間。在圖4所示的實(shí)施例中，一旦解集試劑如膠原酶通過(guò)膠原酶源24而被添加至采集室20，則采集室20中的電動(dòng)機(jī)就通過(guò)處理器件而被啟動(dòng)。電動(dòng)機(jī)啟動(dòng)包括磁性攪拌器和槳葉狀器件的旋轉(zhuǎn)軸25，其中一個(gè)或多個(gè)槳葉25a剛性地連接在前置于采集室28的過(guò)濾器的過(guò)濾籠27上。槳葉在存在解集試劑的情況下攪動(dòng)，使得再生細(xì)胞從組織中分離出。
采集室20中的溶液被允許沉淀達(dá)一定預(yù)定時(shí)間。溶液的漂浮部分可以上升至溶液頂部。一旦預(yù)定時(shí)間過(guò)去，則必要的閥和泵通過(guò)處理器件而被啟動(dòng)，以便將不漂浮部分去除到廢物室40中。進(jìn)入廢物室40中的傳送持續(xù)至沿著通往采集室12b或12d之外的導(dǎo)管的傳感器29可檢測(cè)到溶液的漂浮部分即將傳輸至廢物室30時(shí)為止。例如，沿著通往采集室12b或12d之外的導(dǎo)管的傳感器29可檢測(cè)到不需要的材料已經(jīng)被除去，并且可發(fā)送信號(hào)至處理器件，以便關(guān)閉所需的閥。
此時(shí)，溶液的不漂浮部分，即，再生細(xì)胞組合物被移送至處理室30。這通過(guò)使用必要的閥和蠕動(dòng)泵來(lái)實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施例中，在將再生細(xì)胞組合物傳送至處理室30之前，附加的體積的鹽水可被添加至留在采集室20中的溶液的漂浮部分中。可以重復(fù)另一洗滌循環(huán)。在這一循環(huán)之后，允許溶液靜置，不漂浮部分(其包含再生細(xì)胞)被輸送至處理室，并且漂浮部分被排至廢物室40中。附加的洗滌循環(huán)用于優(yōu)化全部分離的再生細(xì)胞至處理室30的傳送。
一旦再生細(xì)胞組合物通過(guò)導(dǎo)管12輸送至處理室30，組合物就可以在開(kāi)始濃縮處理階段之前經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)附加的洗滌步驟。這就確保從采集室20中除去了廢物和殘余雜質(zhì)。類(lèi)似地，在濃縮步驟之后，再生細(xì)胞組合物可以經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)附加的洗滌步驟，以便除去殘余雜質(zhì)。不需要的材料可以相同的方式從處理室30中除去而排至廢物室40，即，通過(guò)來(lái)自處理器件的信號(hào)來(lái)控制閥和泵，如上所述。
圖4所示處理室30的各種實(shí)施例如下詳述。圖4所示處理室30為離心室的形式。圖4所示處理室的詳細(xì)視圖如圖7和8所示。這種處理室30一般包括旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1，其包括外殼體30.2，一個(gè)或多個(gè)密封件30.3，一個(gè)或多個(gè)軸承30.4和連接點(diǎn)30.6，其用于將處理室連接在存在于系統(tǒng)的可再用部件中的離心器件上；導(dǎo)管形式的一個(gè)或多個(gè)流體路徑30.5從旋轉(zhuǎn)密封件向外延伸并在每一端終止于離心室內(nèi)，離心室是容納在框架53內(nèi)的輸出室50的形式，其中框架包括一個(gè)或多個(gè)端口52和一個(gè)或多個(gè)把手，以便人工地重新定位輸出室50。
旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1被包括進(jìn)來(lái)，以便確保處理室的流體通路可以保持在無(wú)菌的條件下。另外，處理室的流體通路可以在任何時(shí)候以無(wú)菌的方式來(lái)夠到(例如，用于添加試劑或洗滌溶液)，即使在處理室的離心室在自旋時(shí)也是如此。
圖7和圖8所示旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1包括旋轉(zhuǎn)軸，其包括兩個(gè)或多個(gè)軸承30.4，三個(gè)或多個(gè)唇形密封件30.3，和外殼體30.2。在該實(shí)施例中，軸承30.4還包括在本文中稱(chēng)為套圈的外軸和內(nèi)軸(未示出)。這些套圈可以通過(guò)精密磨光的球來(lái)分開(kāi)。構(gòu)成軸承的套圈和球優(yōu)選由適于與體液相接觸的材料來(lái)制成，或被涂覆上適于與體液相接觸的材料。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，套圈和球例如用氮化硅或氧化鋯來(lái)制成。另外，在該實(shí)施例中，三個(gè)唇形密封件包括圓形″U″形槽道(未示出)以及圓形彈簧(未示出)。圓形″U′形槽道優(yōu)選用柔性材料制成，使得可與旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1的旋轉(zhuǎn)軸一起形成防泄漏的接合。另外，唇形密封件優(yōu)選以一定方式定向成使得流過(guò)處理室的再生細(xì)胞組合物的壓力促進(jìn)密封組件通過(guò)增大拉力的方式來(lái)上緊其與旋轉(zhuǎn)軸的接合。密封件可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)圓形夾子(未示出)來(lái)固定就位，所述夾子能夠根據(jù)需要張大和/或收起，以便與旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1的外殼體30.2中的凹槽相接合。旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1或其附近所產(chǎn)生的熱必須得到控制，以防止將移動(dòng)通過(guò)通道的溶液中的細(xì)胞溶解。例如，可通過(guò)選擇用于構(gòu)成旋轉(zhuǎn)軸的硬質(zhì)材料，對(duì)旋轉(zhuǎn)軸的與密封件相接觸的部位進(jìn)行拋光，以及使旋轉(zhuǎn)軸和密封件之間的接觸最小，來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
在另一實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1包括單個(gè)橡膠密封30.3和空氣墊片(未示出)。該密封和墊片提供了用于任何生物物質(zhì)的曲折路徑，其會(huì)有損于系統(tǒng)的無(wú)菌性。在另一實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1包括多個(gè)彈簧裝載的密封件30.3，其隔離開(kāi)單獨(dú)的流體路徑。密封件30.3由可以進(jìn)行滅菌處理以及不用潤(rùn)滑劑來(lái)密封旋轉(zhuǎn)軸的材料制成。在另一實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1包括一對(duì)陶瓷盤(pán)(未示出)，其形成了不同的流體路徑并且可經(jīng)受系統(tǒng)的旋轉(zhuǎn)，而且不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞溶解。在另一實(shí)施例中，流體通路是柔性的，并且被允許相對(duì)于處理室纏繞和解開(kāi)。這通過(guò)在處理室30每回轉(zhuǎn)兩圈時(shí)使柔性的流體通路旋轉(zhuǎn)一圈來(lái)實(shí)現(xiàn)。這就使得不必一起需要旋轉(zhuǎn)密封件。
再生細(xì)胞組合物從采集室20中沿著流體路徑通過(guò)旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1的旋轉(zhuǎn)軸線而被泵送出，然后分成最小的兩個(gè)流體通路30.5，每一流體通路30.5從處理室30的中心軸線向外輻射出，并且終止于處理室30的外端附近，即，容納輸出室50(圖7和8)的離心室內(nèi)。因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，處理室30包括如圖7和8所示的兩個(gè)或多個(gè)輸出室50。這些輸出室50定位成使得它們?cè)谔幚?0.7過(guò)程中處于一個(gè)定向中，而在取出濃縮的再生細(xì)胞30.8時(shí)處于另一定向。例如，輸出變化在處理過(guò)程中傾斜一個(gè)角度，而對(duì)于細(xì)胞取出則傾斜另一角度。細(xì)胞取出角度比處理角度更垂直一些。輸出室50的兩個(gè)位置可以通過(guò)突出到處理室30外面的把手53來(lái)人工地操縱。當(dāng)再生細(xì)胞處在使用注射器來(lái)取出的定向30.8中時(shí)，再生細(xì)胞可以從輸出室50中被人工地收回。在另一實(shí)施例中，流體路徑30.5構(gòu)造成使得它在處理室外面分開(kāi)，然后連接在處理室30的外端上，即，容納輸出室50(未示出)的離心室內(nèi)。在該實(shí)施例中，大體積的再生細(xì)胞組合物和/或添加劑、溶液等等可以被直接地輸送至離心室和/或輸出室。
參見(jiàn)圖4和圖7-9，在采集室20和處理室30之間，可以提供泵34和一個(gè)或多個(gè)閥14。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，閥14是機(jī)電閥。另外，傳感器、例如壓力傳感器29可以設(shè)置成符合處理室30和采集室20。閥、泵和傳感器與設(shè)在可再用部件上的處理器件(
圖14)一起協(xié)同操作，以便使系統(tǒng)的濃縮步驟自動(dòng)化。
傳感器檢測(cè)再離心室中生細(xì)胞組合物的存在，并通過(guò)與系統(tǒng)的處理器件通訊來(lái)啟動(dòng)離心器件?；谠疾杉暮?或使用者輸入的組織數(shù)量，再生細(xì)胞組合物然后受到預(yù)定程序的負(fù)荷達(dá)一段預(yù)定程序的時(shí)間。在某些實(shí)施例中，這一步驟可以自動(dòng)地或通過(guò)使用者輸入來(lái)重復(fù)。例如，組合物是受到大約400倍重力的負(fù)荷達(dá)大約5分鐘的時(shí)間。輸出室50構(gòu)造成使得室的外極限形成了用于較大比重的微粒和細(xì)胞的小儲(chǔ)器。輸出室50保留了稱(chēng)為′細(xì)胞沉淀′的較大比重的微粒，而允許較輕的上清液通過(guò)流體路徑被取出，例如，沿著旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1的旋轉(zhuǎn)軸線并從處理室30中心較低點(diǎn)通過(guò)旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)30.1而行進(jìn)到廢物容器40的流體路徑。閥14和泵34發(fā)送信號(hào)至處理器件，以便啟動(dòng)步驟，從而將上清液去除到廢物容器40中，而不會(huì)擾動(dòng)存在于輸出室50中的細(xì)胞沉淀。
使用圖4所示系統(tǒng)獲得的細(xì)胞沉淀包括本發(fā)明的濃縮再生細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，在上清液被取出并被引導(dǎo)至廢物室40之后，流體路徑30.5可用于用另外的溶液和/或其它添加劑再懸浮起細(xì)胞沉淀，該細(xì)胞沉淀是在離心之后形成的。以這種方式再懸浮起細(xì)胞沉淀就允許用于進(jìn)一步洗滌再生細(xì)胞，以便除去不需要的蛋白質(zhì)和化學(xué)化合物，以及增加通給細(xì)胞的氧的流量。所得懸浮物可以受到另一為大約400倍重力的負(fù)荷達(dá)另一段大約5分鐘的時(shí)間。在形成第二細(xì)胞沉淀、并且所得上清液被去除至廢物室40之后，可以以如上所述的方式用鹽水或一些其它適當(dāng)?shù)木彌_劑溶液進(jìn)行最終的洗滌。這種重復(fù)的洗滌可以進(jìn)行多次，以便提高再生細(xì)胞溶液的純度。在某些實(shí)施例中，鹽水可以在任何被視為必要的步驟中添加，以便改進(jìn)處理。使用圖4所示系統(tǒng)獲得的再生細(xì)胞的濃度可根據(jù)所采集的組織的量，患者年齡，患者體格等等而不同。示例性的產(chǎn)量在表1中提供。
在輸出室50定位在適合于細(xì)胞取出的定向中之后，存在于輸出室50中的最終沉淀然后可以無(wú)菌的方式使用適當(dāng)?shù)淖⑸淦鱽?lái)取出。在其它實(shí)施例中，最終的沉淀可以自動(dòng)地移送至輸出室50中的容器中，其可以被取出和儲(chǔ)存，或根據(jù)需要而使用。該容器可以具有任何適當(dāng)?shù)男问交虺叽?。例如，該容器可以是注射器。在某些?shí)施例中，輸出容器50本身可以被(自動(dòng)地或人工地)熱密封，并且與處理室的其它部件隔開(kāi)，以便隨后取出和使用再生細(xì)胞而用于本文所述的治療應(yīng)用中，包括重新注入到患者體內(nèi)。如本文所述，細(xì)胞也可以在從輸出室中取出之前或在傳輸至第二系統(tǒng)或器件之后，經(jīng)受進(jìn)一步處理。如
圖14所示的可再用部件構(gòu)造成使得它可以連接在一個(gè)或多個(gè)附加的系統(tǒng)或器件上，以根據(jù)需要進(jìn)行進(jìn)一步處理。
如本文所述，使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法獲得的再生細(xì)胞可以基于它們?cè)谑纠兴龅男阅埽糜谥委烶VD和相關(guān)的疾病和病癥。例如，再生細(xì)胞具有合成和分泌可刺激新血管形成的生長(zhǎng)因子的能力，合成和分泌可刺激細(xì)胞存活和增殖的生長(zhǎng)因子的能力，以及增殖細(xì)胞和分化成細(xì)胞以便直接參與新血管形成的能力。因此，在本發(fā)明的一方面中，再生細(xì)胞利用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法而從供體的脂肪組織中抽取出，并且用于通過(guò)一種或多種本文所示的機(jī)理而為堵塞的血管提供治療益處。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞從人體的脂肪組織中抽取出，并且被給予/移植回該人體，因而減輕了與移植物的抗原和/或免疫原反應(yīng)有關(guān)的潛在并發(fā)癥?；颊咭话阃ㄟ^(guò)由醫(yī)生或其它臨床提供者進(jìn)行的一個(gè)或多個(gè)以下程序來(lái)評(píng)價(jià)，以便評(píng)估PVD患者的健康史、身體檢查和目標(biāo)數(shù)據(jù)。
在一個(gè)實(shí)施例中，在患者接受任何設(shè)計(jì)成用于減輕與治療PVD或相關(guān)病癥相關(guān)的血液凝集的產(chǎn)品之前，執(zhí)行采集程序。然而，在某些實(shí)施例中，患者可在采集程序之前接受阿斯匹林。另外，一種優(yōu)選方法包括，在任何意圖程序之前采集脂肪組織。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，采集的時(shí)機(jī)預(yù)期將會(huì)改變并且將取決于若干因素，包括患者穩(wěn)定性，患者凝血曲線，供應(yīng)商的可得到性，以及質(zhì)量管理標(biāo)準(zhǔn)。最后，采集的時(shí)機(jī)將由負(fù)責(zé)給予受影響患者治療的醫(yī)師來(lái)確定。
從患者采集的脂肪組織的體積可為大約0cc至大約2000cc，在一些實(shí)施例中高達(dá)大約3000cc。取下的脂肪的體積將根據(jù)不同的患者而變化，并且將取決于許多因素，包括但不限于年齡，體質(zhì)，凝血曲線，血液動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，疾病嚴(yán)重程度，并發(fā)癥發(fā)病率，和醫(yī)生的偏愛(ài)。
細(xì)胞例如可以通過(guò)注射而給予到任何產(chǎn)生PVD的患者。細(xì)胞可以提前抽取，并以冷藏方式儲(chǔ)存，或者可以在需要的時(shí)候或其附近抽取。如本文所公開(kāi)，細(xì)胞可以通過(guò)例如注射而被給予至患者，或通過(guò)例如注射而直接施加在受損組織上，或通過(guò)例如注射而施加在受損組織附近，而無(wú)需進(jìn)一步處理或遵循附加的程序以便進(jìn)一步提純、修飾、刺激或以其它方式來(lái)改變細(xì)胞。例如，從患者獲得的細(xì)胞可以在需要時(shí)被給予(例如注射)到患者，而無(wú)需在給予至患者之前培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，脂肪組織的采集將在患者的床邊進(jìn)行。血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)控可用于監(jiān)控患者的臨床狀況。
根據(jù)本發(fā)明，再生細(xì)胞可在從患者采集脂肪組織之后不久就傳送至患者。例如，可以在處理脂肪組織以便獲得再生細(xì)胞組合物之后，立即給予細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，如果被重新注入到患者的細(xì)胞要經(jīng)受附加的修飾，提純，刺激，或其它操作，如下文中所述，則用于傳送的定時(shí)可以相對(duì)較長(zhǎng)。另外，再生細(xì)胞可以被多次給予。例如，細(xì)胞可以在較長(zhǎng)一段時(shí)間(例如若干小時(shí))內(nèi)連續(xù)給予，或可以在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)以多次高濃度注射(bolus injection)的方式給予。在某些實(shí)施例中，初始細(xì)胞給予將在大約12小時(shí)內(nèi)給予，例如在6小時(shí)內(nèi)，并且將以12小時(shí)的間隔來(lái)給予單劑量或多劑量細(xì)胞。
給予至患者的細(xì)胞的數(shù)量可以與例如在脂肪組織處理之后的細(xì)胞產(chǎn)量有關(guān)。細(xì)胞總量的一部分可以被保留起來(lái)以便今后使用或冷藏起來(lái)。另外，所傳送的劑量將取決于傳送細(xì)胞至患者的途徑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，傳送至患者的再生細(xì)胞的數(shù)量預(yù)期為大約5.5×105細(xì)胞。然而，這一數(shù)量可以在數(shù)量級(jí)上進(jìn)行調(diào)節(jié)，以便實(shí)現(xiàn)所需的治療效果。
細(xì)胞也可以連同添加劑一起施加，以便增強(qiáng)，控制，或引導(dǎo)預(yù)期的治療效果。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，如本文所述，細(xì)胞可以通過(guò)使用抗體介導(dǎo)的正和/或負(fù)細(xì)胞選擇而進(jìn)一步提純，以便富集細(xì)胞群體來(lái)增加功效，減少發(fā)病率，或促進(jìn)程序的容易程度。類(lèi)似地，細(xì)胞可以連同生物相容性基體一起施加，該基體通過(guò)支持和/或引導(dǎo)移植細(xì)胞的命運(yùn)來(lái)促進(jìn)體內(nèi)組織工程。以相同的方式，細(xì)胞可以在基因操作之后來(lái)施加，使得它們表達(dá)出被視為或預(yù)期用于促進(jìn)細(xì)胞所提供治療反應(yīng)的基因產(chǎn)物。這些操作的示例包括用于控制(增加或降低)促進(jìn)血管生成或脈管生成的因子(例如VEGF)的表達(dá)的操作。細(xì)胞也可以在如本文所述進(jìn)行移植之前，在支架材料上經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)。
在一個(gè)實(shí)施例中，將細(xì)胞間接給予至預(yù)期受益部位是優(yōu)選的。這可以通過(guò)周?chē)o脈內(nèi)注射來(lái)實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的給予途徑包括但不限于，靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，并且基于傳送機(jī)理而可以包括或不包括血管內(nèi)導(dǎo)管。
細(xì)胞可以通過(guò)單次高濃度，通過(guò)緩慢輸液，或通過(guò)間隔若干小時(shí)、若干天或若干星期的交替系列施加來(lái)注射，只要細(xì)胞被適當(dāng)?shù)貎?chǔ)存。如上所述，細(xì)胞也可以通過(guò)使用導(dǎo)管來(lái)施加，使得細(xì)胞被直接傳送至局部缺血部位、受影響組織。隨著周?chē)o脈的途徑，細(xì)胞可以通過(guò)導(dǎo)管以單次高濃度或以多個(gè)更小等分量來(lái)注射。細(xì)胞也可以在開(kāi)放式周?chē)月吠饪剖中g(shù)時(shí)直接施加在受影響組織上。
在一個(gè)實(shí)施例中，傳送途徑將包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的周?chē)o脈內(nèi)導(dǎo)管、或中央靜脈導(dǎo)管而進(jìn)行靜脈內(nèi)傳送。細(xì)胞的流動(dòng)可以通過(guò)位于患者脈管系統(tǒng)內(nèi)的遠(yuǎn)端和近端橡皮球的連續(xù)充氣/泄氣來(lái)得以控制，因而產(chǎn)生了臨時(shí)性的不流動(dòng)區(qū)，這可促進(jìn)細(xì)胞的移入或細(xì)胞的治療作用。另外，細(xì)胞可以單獨(dú)地或連同上述一種或多種方法一起通過(guò)以下途徑來(lái)傳送皮下、肌肉內(nèi)和舌下。
給予患者的細(xì)胞劑量將取決于所采集的脂肪組織的量和供體的體重指數(shù)(作為可得到的脂肪組織量的測(cè)量數(shù)據(jù))。所采集的組織的量也將通過(guò)局部缺血的或受影響組織的分布來(lái)確定。使用多次組織采集物或使用單次采集物并在各次給予之間適當(dāng)儲(chǔ)存地細(xì)胞來(lái)進(jìn)行的多次治療也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
經(jīng)處理的脂肪抽取物的部分可以在給予至患者之前被儲(chǔ)存起來(lái)。對(duì)于短期儲(chǔ)存(不到6小時(shí))而言，細(xì)胞可以在室溫或以下而被儲(chǔ)存在密封式容器中，同時(shí)伴隨有或者沒(méi)有補(bǔ)充養(yǎng)分溶液。中期儲(chǔ)存(不到48小時(shí))優(yōu)選在2-8℃下在容器中的等滲緩沖溶液(例如Plasmalyte)中進(jìn)行，該容器由可防止細(xì)胞粘連的材料構(gòu)成或者涂覆上這種材料。長(zhǎng)期儲(chǔ)存優(yōu)選通過(guò)在可有助于保留細(xì)胞功能的條件下適當(dāng)?shù)乩洳睾蛢?chǔ)存細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，例如公開(kāi)于2002年9月13日提交的共同擁有和轉(zhuǎn)讓的PCT專(zhuān)利申請(qǐng)No.PCT/US02/29207以及2001年9月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No.60/322070，這兩件申請(qǐng)的內(nèi)容均通過(guò)引用而結(jié)合于本文中。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，給予患者的源自脂肪組織的細(xì)胞可用作生長(zhǎng)因子傳送媒介。例如，通過(guò)將細(xì)胞改造成可表達(dá)一種或多種適合于緩解周?chē)芗膊∠嚓P(guān)癥狀的生長(zhǎng)因子，細(xì)胞就可以被給予至患者，并且可改造成釋放出一種或多種生長(zhǎng)因子。這種釋放可以以受控的方式提供而達(dá)較長(zhǎng)一段時(shí)間。例如，這種釋放可以控制成使得生長(zhǎng)因子以脈沖或周期性的方式來(lái)釋放出，使得在被受影響組織部位附近，生長(zhǎng)因子的量局部升高，和/或生長(zhǎng)因子的量局部下降。
給予患者的細(xì)胞不僅有助于恢復(fù)受損或其它不健康組織的功能，而且也促進(jìn)了受損組織的重塑。細(xì)胞傳送可發(fā)生在以下位置但不限于以下位置診所，臨床工作室，透析中心，急診室，醫(yī)院病房，重點(diǎn)護(hù)理單元，手術(shù)室，導(dǎo)管插入術(shù)套房，和放射性治療套房。在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞傳送治療的效果將通過(guò)但不限于一種以下臨床測(cè)量來(lái)表現(xiàn)通過(guò)多普勒超聲波掃描術(shù)、血管造影術(shù)和磁共振血管造影術(shù)測(cè)量的血流改善；癥狀(跛行)的減輕；局部缺血潰瘍的痊愈；通過(guò)身體體積描記法測(cè)量到的組織氧含量增加；踝骨臂指數(shù)(ABI)的改善。細(xì)胞療法的效果可以在處理之后幾天或幾個(gè)星期內(nèi)是非常明顯的。然而，有益的效果可以早至在處理之后的若干小時(shí)內(nèi)觀察到，并且可持續(xù)若干年?；颊咭话阍诩?xì)胞傳送之前和此期間受到監(jiān)控。監(jiān)控程序可包括但不限于凝集研究，氧飽和度和血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)控。
提供以下示例，以便顯示特定的場(chǎng)合和設(shè)置，其中該技術(shù)可以被應(yīng)用并且并不試圖限制本發(fā)明的范圍和包括在本公開(kāi)中的權(quán)利要求。
示例在整個(gè)以下示例中使用的ADC或再生細(xì)胞可以通過(guò)本文公開(kāi)的方法來(lái)獲得，和/或通過(guò)以下丈獻(xiàn)中描述的方法獲得2002年12月9日提交的題目為“利用經(jīng)處理的脂肪抽取物細(xì)胞來(lái)治療患者的系統(tǒng)和方法”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/316127，其要求于2001年12月7日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No.60/338856的優(yōu)先權(quán)，以及2004年6月25日提交的題目為“用于從組織中分離和濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)和方法”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.中介紹的方法，其要求于2002年12月9曰提交的題目為“利用經(jīng)處理的脂肪抽取物細(xì)胞來(lái)治療患者的系統(tǒng)和方法”的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.10/316127的優(yōu)先權(quán)，所有上述申請(qǐng)都被共同地轉(zhuǎn)讓?zhuān)⑶移渌袃?nèi)容都通過(guò)這種引用而清楚地結(jié)合于本文中。
示例1血管生成性生長(zhǎng)因子VEGF通過(guò)再生細(xì)胞的表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是血管生成的其中一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑(Nagy等人，2003；Folkman，1995)。VEGF家族的另一成員胎盤(pán)生長(zhǎng)因子，也在血管生成以及動(dòng)脈生成中起到類(lèi)似的作用。具體而言，將野生型(PIGF+/+)細(xì)胞移植到P1GF敲除的小鼠體內(nèi)，恢復(fù)引起從后肢局部缺血癥狀中快速康復(fù)的能力(Scholz等人，2003)。
由于血管生成和動(dòng)脈生成對(duì)于血管再形成過(guò)程的重要性，使用從三個(gè)供體得到的源自脂肪的再生細(xì)胞，利用ELISA試驗(yàn)(R&D系統(tǒng)，Minneapolis，MN)檢測(cè)本發(fā)明再生細(xì)胞的PIGF和VEGF表達(dá)來(lái)進(jìn)行檢查。一個(gè)供體具有高血糖病史和2型糖尿病(與微血管和大血管疾病高度相關(guān)的狀態(tài))。從每一供體得到的再生細(xì)胞以1000細(xì)胞/cm2在補(bǔ)充有10％FCS和5％HS的DMEM/F-12培養(yǎng)基中平板培養(yǎng)，并且生長(zhǎng)至融合。取出上清液樣品，化驗(yàn)PIGF和VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)。如
圖16A和16B所示，結(jié)果顯示，VEGF(
圖16A)和PIGF(
圖16B)都由本發(fā)明的源自脂肪的再生細(xì)胞大量表達(dá)。
在單獨(dú)的研究中，測(cè)量取自正常成年小鼠的培養(yǎng)再生細(xì)胞所分泌的血管生成相關(guān)細(xì)胞因子的相對(duì)量。再生細(xì)胞在具有10％FBS的α-MEM中培養(yǎng)達(dá)細(xì)胞融合后五天，此時(shí)，采集細(xì)胞培養(yǎng)基并通過(guò)抗體化驗(yàn)分析來(lái)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)(RayBio小鼠細(xì)胞漿抗體化驗(yàn)II(RayBiotech，Inc.)。檢測(cè)到以下血管生成相關(guān)生長(zhǎng)因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，bFGF，IGF-II，Eotaxin，G-CSF，GM-CSF，IL-12p40/p70，IL-12p70，IL-13，IL-6，IL-9，瘦蛋白，MCP-1，M-CSF，MIG，PF-4，TIMP-1，TIMP-2，TNF-α和血栓蛋白。以下與血管生成相關(guān)生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子與具有10％FBS的空白對(duì)照培養(yǎng)基相比至少升高了兩倍血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，Eotaxin，G-CSF，IL-6，MCP-1和PF-4。
這些數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的再生細(xì)胞表達(dá)出了許多種血管生成性和動(dòng)脈生成性生長(zhǎng)因子。另外發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者表達(dá)出的VEGF和P1GF與正?；颊咛幱谙嗟鹊乃?，這表明，糖尿病患者可以是通過(guò)源自脂肪的自體再生細(xì)胞來(lái)進(jìn)行血管生成治療的候選者。
示例2包含參與血管生成的細(xì)胞群體的再生細(xì)胞已知內(nèi)皮細(xì)胞和它們的前體細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)參與血管生成。為了確定EPC是否存在于源自脂肪的再生細(xì)胞中，評(píng)價(jià)源自人體脂肪的再生細(xì)胞的EPC細(xì)胞表面標(biāo)記，例如CD-34。
通過(guò)酶催化消化人體皮下脂肪組織來(lái)分離ADC。ADC(100微升)在含有0.2％胎牛血清(FBS)的磷酸鹽水緩沖液(PBS)中進(jìn)行培養(yǎng)，并與導(dǎo)向人內(nèi)皮標(biāo)記CD-31(分化的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記)、CD-34(EPC標(biāo)記)以及人體ABCG2(ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體，選擇性表達(dá)在多能細(xì)胞上)的熒光標(biāo)記抗體在4℃下孵育20至30分鐘。在洗滌之后，利用FACSAria Sorter(Beckton Dickenson-Immunocytometry)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析。然后通過(guò)FACSDiva軟件(BD-Immunocytometry，CA)來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)獲得和分析。結(jié)果(未示出)顯示，來(lái)自于健康成年人的源自脂肪的再生細(xì)胞表達(dá)EPC標(biāo)記CD-34和ABCG2，但不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD-31。在來(lái)自具有糖尿病病史的供體的再生細(xì)胞中檢測(cè)到類(lèi)似頻率的表達(dá)EPC標(biāo)記CD-34和ABCG2的細(xì)胞。
為了確定在人源自脂肪的再生細(xì)胞中EPC的頻率，在內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，再生細(xì)胞在包被了纖連蛋白的板上平板培養(yǎng)，并且在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天，以便除去成熟內(nèi)皮細(xì)胞。未粘連的細(xì)胞被取出，并且重新進(jìn)行平板培養(yǎng)。在14天之后，通過(guò)用FITC-綴合的Ulex europaeus Agglutinin-1(VectorLabs，Burlingame，CA)和Dil-標(biāo)記的乙?；疞DL(Molecular Probes，Eugene，OR)染色來(lái)識(shí)別集落。如
圖17所示，結(jié)果顯示，EPC的頻率為大約500EPC/106ADC細(xì)胞。
EPC在源自脂肪組織的再生細(xì)胞內(nèi)的存在表明，這些細(xì)胞可直接地參與新血管的發(fā)育和改善血管生成和再灌注。
示例3再生細(xì)胞中血管結(jié)構(gòu)的體外發(fā)育本領(lǐng)域已知的用于血管生成的化驗(yàn)是，其中在成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育出CD31陽(yáng)性管的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，其令人回想初生毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)(Donovan等人，2001)。由于源自脂肪的再生細(xì)胞包含內(nèi)皮細(xì)胞、EPC和其它基質(zhì)細(xì)胞前體，因此，就檢測(cè)這些再生細(xì)胞在沒(méi)有滋養(yǎng)層的條件下形成毛細(xì)狀結(jié)構(gòu)的能力。從正常小鼠的腹股溝脂肪層獲得的再生細(xì)胞在培養(yǎng)之后的兩個(gè)星期發(fā)育出毛細(xì)網(wǎng)絡(luò)(
圖18A)?？梢宰⒁獾?，來(lái)自于患有鏈佐星(STZ)誘發(fā)的1型糖尿病八星期的高血糖癥小鼠的再生細(xì)胞在給予STZ之后形成了與正常小鼠的細(xì)胞所形成毛細(xì)網(wǎng)絡(luò)相同的毛細(xì)網(wǎng)絡(luò)(
圖18B)。
在隨后的研究中，源自脂肪的再生細(xì)胞在沒(méi)有其它生長(zhǎng)因子的完全培養(yǎng)基(α-MEM，補(bǔ)充有10％FCS)中進(jìn)行培養(yǎng)。這些再生細(xì)胞也形成了毛細(xì)網(wǎng)絡(luò)。另外，所形成的血管結(jié)構(gòu)對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31、CD34、VE-鈣黏著蛋白和馮威勒布蘭德氏因子/因子VIII的染色顯示為陽(yáng)性，但對(duì)于泛淋巴細(xì)胞標(biāo)記CD45則不顯陽(yáng)性。
為了將來(lái)自于年輕小鼠的再生細(xì)胞與來(lái)自于老年小鼠的再生細(xì)胞形成毛細(xì)網(wǎng)絡(luò)的能力進(jìn)行比較，將來(lái)自于年輕和老年小鼠(年齡為1，12，或18個(gè)月)的再生細(xì)胞在沒(méi)有其它生長(zhǎng)因子的完全培養(yǎng)基(α-MEM，補(bǔ)充有10％FCS)中進(jìn)行培養(yǎng)達(dá)2個(gè)星期。在來(lái)自于所有供體的再生細(xì)胞的培養(yǎng)物中，觀察到了相同的毛細(xì)狀網(wǎng)絡(luò)(未示出)。
前述數(shù)據(jù)證明，從正常人和糖尿患者以及從年輕患者和老年患者得到的源自脂肪的再生細(xì)胞可形成與初生毛細(xì)網(wǎng)絡(luò)形成一致的血管結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明的再生細(xì)胞可以用于治療血管生成不足。
示例4再生細(xì)胞中的血管結(jié)構(gòu)的體內(nèi)發(fā)育如果細(xì)胞不參與體內(nèi)血管生成活動(dòng)的話，那么其體外血管生成能力盡管是有希望的，但也是沒(méi)有什么價(jià)值的。手術(shù)引起的后肢局部缺血是體內(nèi)模型，其能夠鑒別給定治療的血管生成能力。這種模型在免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠中發(fā)育出，其中可以觀察到人體細(xì)胞驅(qū)動(dòng)再灌注的能力。
如下所述地測(cè)定雙后肢的外科手術(shù)前血流值。被麻醉的小鼠的脈管系統(tǒng)用4-0絲線在以下部位捆扎1)其近側(cè)分叉的髂動(dòng)脈，2)正深股動(dòng)脈起始的遠(yuǎn)側(cè)，3)正淺股動(dòng)脈分支的近端。在捆扎之后，整體取下脈管系統(tǒng)。在創(chuàng)口封閉之前，大致可觀察到的從扎緊股動(dòng)脈分支出的側(cè)支也被扎緊。24小時(shí)之后，129S小鼠被注入5×106個(gè)同源小鼠的源自脂肪的再生細(xì)胞，并且NODSCID小鼠通過(guò)尾部靜脈而被注入人體的源自脂肪的再生細(xì)胞。在外科手術(shù)之后立即使用LaserDoppler Flow Imager(Moor Instruments Inc.，Wilmington，DE)對(duì)血流進(jìn)行成像，并且以一定的間隔進(jìn)行以下處理。每星期三次取值24天，測(cè)量值對(duì)該肢體在外科手術(shù)前的值歸一化，并且相對(duì)于對(duì)照(未進(jìn)行手術(shù))肢體顯示。
后肢局部缺血的模型對(duì)所使用小鼠的種系非常敏感。NODSCID小鼠是免疫缺陷動(dòng)物，缺乏引起急性炎癥反應(yīng)的能力。對(duì)于這些小鼠，該手術(shù)方法產(chǎn)生了嚴(yán)重的局部缺血，使得三分之二的未治療動(dòng)物喪失股切除部位以下的后肢結(jié)構(gòu)。未接受細(xì)胞治療的動(dòng)物喪失了腳趾以上的任何結(jié)構(gòu)。然而，對(duì)于有免疫能力的129S小鼠而言，未治療動(dòng)物不會(huì)喪失趾骨以上的任何結(jié)構(gòu)，并且顯示了部分再生再灌注的內(nèi)源能力。這可能是由于與急性炎癥反應(yīng)相關(guān)的固有血管生成導(dǎo)致的。這就可解釋在比較不同種系的治療動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物時(shí)，再灌注較不極端的原因。
然而，結(jié)果顯示，用源自脂肪的再生細(xì)胞治療的小鼠與兩個(gè)種系的未治療小鼠相比，顯示出顯著地改善了灌注。到第12天，與未治療小鼠中的10±10％相比，在用人體再生細(xì)胞治療的NOD-SCID小鼠體內(nèi)血流恢復(fù)至50±11％(p＜0.05)。類(lèi)似地，與未治療小鼠的56±4％相比，有免疫能力的129S小鼠顯示出在第14天恢復(fù)了80±12％的血流。另外，小鼠粗略解剖顯示出用再生細(xì)胞治療的小鼠的后肢內(nèi)側(cè)支血管的出現(xiàn)，但在未治療小鼠或任何小鼠的健康肢體中未觀察到。
示例5增加ADC劑量與移植物存活和血管生成改善相關(guān)自體脂肪組織的移植在整形和重構(gòu)外科手術(shù)中是比較常見(jiàn)的手術(shù)程序{Fulton，1998；Shiffman，2001}。然而，這種程序受到這樣的限制，即，脂肪組織碎片在沒(méi)有血管供應(yīng)的情況下轉(zhuǎn)移，結(jié)果，移植物的存活依賴(lài)于新血管生成(Coleman，1995；Eppley等人，1990)。因此，移植的組織以有限的方式代表局部缺血的組織。
進(jìn)行Fisher大鼠中的研究，其中脂肪組織碎片被移植到外大腿肌肉上的皮下部分中。右腿被單獨(dú)地移植上0.2g的脂肪組織碎片，左腿被移植上0.2g的脂肪組織碎片再加上三種不同劑量的源自脂肪的干細(xì)胞(1.7×105-1.3×106細(xì)胞/移植物；每一劑量三個(gè)動(dòng)物)；這樣對(duì)側(cè)的腿用作對(duì)照。在一種方法中，可以通過(guò)注射來(lái)施加一種或多種劑量。這些動(dòng)物然后被保持達(dá)一個(gè)月，之后，對(duì)這些動(dòng)物執(zhí)行安樂(lè)死，并且回收移植物，稱(chēng)量，在福爾馬林中固定，并且包埋在石蠟中，以便用于組織分析。
如圖9A所示，結(jié)果顯示，在對(duì)照腿中保留了最少的移植組織，而在治療腿中以劑量依賴(lài)性增加了保留的移植物重量。另外，移植物的免疫組織化學(xué)分析顯示，在源自脂肪的干細(xì)胞治療的移植物中出現(xiàn)了大量的新血管生成和灌注(圖20B中的箭頭所示)。這也與脂肪組織形態(tài)的保持相關(guān)(圖20B)。
因此，示例1-5顯示，本發(fā)明的源自脂肪的再生細(xì)胞分泌出血管生成性和動(dòng)脈生成性生長(zhǎng)因子；體外形成初生毛細(xì)網(wǎng)絡(luò)；增強(qiáng)脂肪移植物的存活；以及增強(qiáng)局部缺血的再灌注。因此，本發(fā)明的再生細(xì)胞能夠促進(jìn)血管生成和動(dòng)脈生成，并且可以用于治療具有潛在循環(huán)不足的多種疾病。
許多公開(kāi)出版物和專(zhuān)利已經(jīng)如上所述被引用。每一被引用的公開(kāi)出版物和專(zhuān)利都通過(guò)其整體引用而結(jié)合于本文中。
等效形式僅使用常規(guī)的試驗(yàn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到或能夠確定本文所述的本發(fā)明的具體實(shí)施例的許多等效形式。這些等效形式旨在被所附權(quán)利要求來(lái)涵括。
權(quán)利要求
1.一種用于治療患者中周?chē)芗膊?PVD)的方法，包括將濃縮的再生細(xì)胞通過(guò)注射而給予所述患者。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述接受者是人。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述再生細(xì)胞包括干細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述再生細(xì)胞包括祖細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述再生細(xì)胞包括干細(xì)胞和祖細(xì)胞的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給予所述再生細(xì)胞以便治療血管的缺陷或病癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給予所述再生細(xì)胞以便治療周?chē)鷦?dòng)脈疾病(PAD)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給予所述再生細(xì)胞以便治療動(dòng)脈硬化、血管外傷和動(dòng)脈炎癥中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，給予所述再生細(xì)胞以便治療所述患者冠外組織的缺陷或病癥。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括高濃度給予所述再生細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括給予多劑量的所述再生細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給予一種或多種血管生成因子。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給予一種或多種免疫抑制藥物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，經(jīng)由靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下給予途徑中的至少一條途徑來(lái)給予所述再生細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括給予所述再生細(xì)胞至所述患者的脈管系統(tǒng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述再生細(xì)胞在給予至所述患者之前在細(xì)胞培養(yǎng)物中生長(zhǎng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述再生細(xì)胞在促進(jìn)朝著血管生成表型分化的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)條件促進(jìn)朝著內(nèi)皮表型的分化。
19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)在支架材料上進(jìn)行，以便產(chǎn)生可放置在所述患者身上或體內(nèi)的兩維或三維構(gòu)造。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述支架材料可在體內(nèi)被吸收。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述再生細(xì)胞通過(guò)基因轉(zhuǎn)移來(lái)修飾，使得所述修飾再生細(xì)胞中的一種或多種基因的表達(dá)發(fā)生變化。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述修飾導(dǎo)致改變所述接受者中的血管生成水平。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述修飾導(dǎo)致改善了所述接受者中現(xiàn)有小血管的氧供應(yīng)。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述修飾導(dǎo)致改變所述再生細(xì)胞的所述歸巢性質(zhì)。
25.一種治療患者中PVD的方法，包括將一定濃度的源自脂肪組織的再生細(xì)胞通過(guò)注射而給予至所述患者，其中，所述組合物被給予至最初從其采集所述脂肪組織的同一接受者。
26.一種促進(jìn)患者中血管生長(zhǎng)的方法，包括，通過(guò)注射使組織局部區(qū)域與一定濃度的再生細(xì)胞相接觸，以便誘發(fā)所述組織區(qū)域內(nèi)的血管生長(zhǎng)。
全文摘要
存在于脂肪組織內(nèi)的細(xì)胞用于治療患者，包括患有PVD和相關(guān)疾病或病癥的患者。治療患者的方法包括，處理脂肪組織，以便將一定濃度量的從脂肪組織獲得的干細(xì)胞傳送至患者。該方法可在封閉的系統(tǒng)中進(jìn)行，使得干細(xì)胞在給予至患者之前不會(huì)暴露于外部環(huán)境。因此，在一種優(yōu)選方法中，存在于脂肪組織內(nèi)的細(xì)胞連同促進(jìn)、引起或支持治療益處所必須的這種添加劑一起，而被直接地置于接受者中。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1878470SQ200480033368
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2004年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月17日
發(fā)明者J·K·弗拉塞爾, M·H·赫德里克, E·丹尼爾斯 申請(qǐng)人:馬克羅珀?duì)柹锿饪乒?br>