專利名稱：基因捕獲系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種搜索在一定條件下表達的基因的方法，更具體地，本發(fā)明涉及一種基因捕獲系統(tǒng)(gene-trap system)，其將一個基因在一定條件下的瞬時表達固定為報道基因的組成型表達。
現(xiàn)有技術(shù)通過人基因組計劃已經(jīng)明確產(chǎn)生了大多數(shù)染色體DNA序列。然而，需要全面地搜索與生理學功能直接相關(guān)的功能基因，以在藥物發(fā)現(xiàn)和安全性測試領域揭示新的方面。
作為全面捕獲特異細胞類型內(nèi)的轉(zhuǎn)錄的基因和功能基因(表達的基因)的方法，已經(jīng)報道了三種方法如增強子捕獲、啟動子捕獲和外顯子捕獲。然而，由于現(xiàn)有方法中的捕獲載體自身伴隨有報道基因功能(基因捕獲的一種指征功能)，因此可以捕獲組成型和穩(wěn)定表達的基因，但不能捕獲在細胞改變?nèi)绶只蛺盒赞D(zhuǎn)化過程中瞬時表達的基因(Nature 1998 Apr.9；392(6676)608-11)。
本發(fā)明解決的問題本發(fā)明的目的是提供一種基因捕獲系統(tǒng)(基因捕獲的方法)，其可以捕獲任何基因，包括在細胞改變?nèi)绶只蛺盒赞D(zhuǎn)化過程中瞬時表達的基因。
解決問題的手段本發(fā)明的方法包括通過捕獲載體捕獲基因，其應用來自噬菌體P1的Cre重組酶，并將捕獲基因的表達轉(zhuǎn)變?yōu)樘砑拥膱蟮阑虻慕M成型表達。結(jié)果，所述方法可以全面搜索先前是不可能被捕獲的“在細胞生理學改變過程中瞬時表達的基因”以及先前捕獲的基因。該系統(tǒng)使得可以構(gòu)建一個數(shù)據(jù)庫以了解基因表達的動態(tài)改變。
本發(fā)明提供了一種基因捕獲方法，包括如下步驟(第一步)用報道基因載體轉(zhuǎn)化靶細胞，(第二步)用捕獲載體轉(zhuǎn)染在前一步驟中轉(zhuǎn)化的細胞，(第三步)從在前一步驟獲得的細胞中選擇無報道基因活性的細胞，(第四步)將在前一步驟中選擇的細胞暴露于給定條件，及(第五步)從前一步驟的細胞中選擇具有報道基因活性的細胞，其中報道基因載體具有通過將在靶細胞中起作用的啟動子、第一個LoxP序列、藥物抗性基因、轉(zhuǎn)錄終止的STOP序列、第二個LoxP序列及一個報道基因依次連接而組成的一個單元，而且基因捕獲載體具有通過將剪接受體(splicing acceptor，SA)、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)、添加有核定位信號的Cre(nl-Cre)、第一個剪接供體(SD)、組成型表達基因啟動子、藥物抗性基因和第二個剪接供體(SD)依次連接而組成的一個單元。
另外，所述方法可進一步包括第六步，即在第五步選擇的細胞中克隆與捕獲載體最接近的DNA并確定核苷酸序列。
再者，本發(fā)明提供了包含一個報道基因載體和一個基因捕獲載體的一套基因捕獲載體，其中報道基因載體包含通過將在靶細胞中起作用的啟動子、第一個LoxP序列、藥物抗性基因、轉(zhuǎn)錄終止的STOP序列、第二個LoxP序列和一個報道基因依次連接而組成的一個單元，且基因捕獲載體包含通過將剪接受體(SA)、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)、添加有核定位信號的Cre(nl-Cre)、第一個剪接供體(SD)、組成型表達基因啟動子、藥物抗性基因和第二個剪接供體(SD)依次連接而組成的一個單元。
另外，本發(fā)明提供了通過該套載體轉(zhuǎn)化的細胞或者含有所述細胞的非人動物。
附圖簡述


圖1示出本發(fā)明的捕獲載體的基本單元。
圖2示出本發(fā)明的報道基因載體的基本單元。
圖3示出實施例2中構(gòu)建的報道基因載體的基本單元。
圖4示出解釋實施例4中每個步驟的示意圖。標記A和B代表LacZ陽性樣品，標記B示出標記的細胞含有一個捕獲的基因，其在ES細胞分化期間誘導捕獲載體中Cre基因的表達。
圖5代表細胞的照片，示出LacZ陽性僅在分化的誘導之后。LacZ陽性細胞團在細胞簇(clump)的中心檢測到(箭頭所示)，顏色是深藍色。這些細胞相應于圖4右側(cè)的標記B。
發(fā)明詳述本發(fā)明的系統(tǒng)包含兩個元件捕獲載體和報道基因載體。
(1)捕獲載體pMIE這個捕獲載體的基本單元示于
圖1。該基本單元結(jié)構(gòu)大致由兩部分組成。
第一部分由剪接受體(SA)、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)、添加有核定位信號的Cre(nl-Cre)及第一個剪接供體(SD)依次連接組成。
第二部分由組成型表達基因啟動子(例如PGK基因啟動子)、藥物抗性基因(例如Neo基因)和第二個剪接供體(SD)依次連接組成。
另外，可以在這些部分的每個元件之間插入無功能活性的DNA序列。
剪接受體(SA)是一個信號序列，位于剪接(切下內(nèi)含子并與編碼氨基酸的部分連接的步驟)必需的內(nèi)含子的下游，作為轉(zhuǎn)錄后控制。
剪接供體(SD)是SA的一個“剪接控制順式元件”，是位于內(nèi)含子上游的一個功能序列。
IRES是啟動蛋白質(zhì)合成的核糖體的復合形成或進入位點。
IRES是人腦心肌炎病毒基因組的一部分，商購載體的相應部分的分離的PCR產(chǎn)物可用作IRES。
Cre是一種重組酶。
PGK基因啟動子是一種管家基因啟動子，其不易于受染色體包埋位點(chromosomal embedded site)(捕獲的位點)的影響。
藥物抗性基因可以是任何基因，其編碼的蛋白質(zhì)抵消對哺乳動物細胞的藥物毒性作用。最常用的是Neo抗性基因。
將這些單元導入合適的載體中。作為載體，可以使用BluescriptSK II(Stratagene)。
捕獲載體具有如下功能特點第一部分中的剪接受體除了基因的啟動子捕獲之外還使得發(fā)生5’(上游側(cè))外顯子捕獲。
由IRES捕獲的不具翻譯起始序列的基因得以從Cre基因開始翻譯，這不依賴于基于mRNA的帽結(jié)構(gòu)的翻譯起始。
第二部分中的藥物抗性基因伴隨下游的剪接供體，但無polyA添加信號。因此，基于藥物抗性的選擇使得3’外顯子的捕獲和polyA添加信號得以發(fā)生。使用藥物抗性基因序列作為引物，分離自捕獲的ES細胞克隆的RNA使得一部分捕獲的基因通過3’RACE可以擴增并迅速鑒別。
無polyA添加信號的捕獲載體使得可以進行低背景篩選。另外，針對捕獲的EC細胞克隆分離的RNA使得捕獲基因的一部分核苷酸序列可以通過3’RACE擴增并迅速鑒別。
(2)報道基因載體pRMIE
如圖2所示，報道基因載體包含由在靶細胞中起作用的啟動子、第一個LoxP序列、藥物抗性基因、轉(zhuǎn)錄終止的STOP序列、第二個LoxP序列及一個報道基因依次連接組成的一個單元。另外，在所述單元的每個元件之間可以插入非功能性的DNA序列。
用于轉(zhuǎn)錄終止的STOP序列可以是含有終止密碼子的基因(cDNA)或者是polyA添加信號?？梢允褂煤衟olyA添加信號和翻譯終止密碼子的部分商購載體。
將這些單元導入適當?shù)妮d體中。作為載體，可以使用BluescriptSK II(Stratagene)。
本發(fā)明的方法包括如下步驟第一步在這個步驟中，將在兩種細胞狀態(tài)如分化或惡性轉(zhuǎn)化之間可改變的靶細胞用報道基因載體轉(zhuǎn)染并建立細胞系。任何細胞均可用作靶細胞，但胚胎干細胞(ES細胞)具有如下三個優(yōu)點。
可以在多能(pluripotent)ES細胞的趨異細胞分化期間搜索用于細胞分化的瞬時表達的關(guān)鍵基因。
由于捕獲的基因通常導致功能異常(缺失或降低)，因此可以使用捕獲的ES細胞克隆構(gòu)建突變的動物。
由于Cre基因用基于本發(fā)明捕獲載體的結(jié)構(gòu)的捕獲基因的表達取代，因此通過捕獲的ES細胞克隆構(gòu)建的動物可以用作“Cre動物”(組織和細胞類型特異性遺傳重組必需的動物)。
第二步在這個步驟中，將捕獲載體轉(zhuǎn)導至在前一步驟中轉(zhuǎn)化的靶細胞中。
第三步從通過第二步獲得的細胞中選擇無報道基因活性的細胞。
第四步將在前一步驟中選擇的細胞暴露于給定條件，可以特別檢測在由新條件引起的細胞中瞬時表達的基因。
第五步從前一步驟的細胞中選擇具有報道基因活性的細胞。在這個步驟中，足以通過依賴于報道基因性質(zhì)的合適方法分析所述活性。
第六步克隆在前一步驟中選擇的細胞中與捕獲載體最接近的DNA并測定這個序列。這個步驟可以通過常規(guī)方法進行。另外，只是為了獲得在第五步中選擇的細胞則可以省略這個步驟。
如下實施例舉例闡述了本發(fā)明，然而，這些實施例無限制本發(fā)明之意。
實施例1捕獲載體的構(gòu)建捕獲載體(pMIE-nlCre，
圖1)通過在BluescriptSKII(-)(一種克隆載體，Stratagene，USA))中XbaI-SalI位點之間依次連接剪接受體(SA)、內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)、具有核定位信號的Cre(nl-Cre)、剪接供體(SD)、PGK基因啟動子、藥物抗性基因(例如Neo)及剪接供體(SD)而構(gòu)建。
作為剪接受體，使用II型ryanodine受體基因中第二個外顯子的受體區(qū)域(SEQ ID NO1，大約50bp的BglII-PstI片段的DNA，分離及純化自商購自Stratagene，USA的基因組文庫“LamdaFIXII”)。
作為IRES，使用從商購的pCITE表達載體(Novagen)的相應部分中使用SEQ ID NO2和3所示引物擴增的PCR片段。
由于重組Cre蛋白在核內(nèi)是功能性的，因此使用具有編碼翻譯起始位點的序列上游的SV40 T抗原核定位信號的nl-Cre(SEQ IDNO4)作為Cre基因。
作為PGK啟動子，使用小鼠磷酸甘油酸激酶基因的啟動子，其不影響整合基因的轉(zhuǎn)錄控制。
使用pQG44(O’Gorman S，F(xiàn)ox DT，Wahl GM(1991)，Recombinase-mediated gene activation and site specific integration inmammalian cells.Science，251(4999)1351-1355)中合成內(nèi)含子的PCR擴增的XbaI-SacII片段(SEQ ID NO5)作為剪接供體。
使用合成的寡聚物(SEQ ID NO6)，BluescriptSKII(-)的SpeI位點被改變?yōu)镻meI位點，以在導入靶細胞之前將BluescriptSKII(-)部分與捕獲載體分開。
實施例2報道基因載體(pRMIE-nlLacZ)的構(gòu)建報道基因載體pRMIE-nlLacZ通過在用于基因克隆的載體BluescriptSKII(-)的NotI-SalI位點之間插入并依次連接在所有類型的靶細胞中均起作用的CAG啟動子、第一個LoxP序列、嘌呤霉素抗性基因(Pac)、轉(zhuǎn)錄終止的STOP序列、第二個LoxP序列、大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因和polyA添加信號而制備(圖3)。
CAG啟動子是一種合成的啟動子，包含巨細胞病毒增強子、雞β-肌動蛋白啟動子和兔β-珠蛋白基因的一個外顯子。STOP序列是衍生自pBS302(GENEBANK NOU51223)的HindIII-BamHI片段(大約1.3Kb)。
將核定位信號加入大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因。
由于這個結(jié)構(gòu)，Cre蛋白的存在導致LoxP序列的重組、STOP序列的切除及位于起始處下游的β-半乳糖苷酶基因的轉(zhuǎn)錄。
實施例3報道基因載體轉(zhuǎn)導入ES細胞及報道基因細胞的選擇RW4(Genome System)用作ES細胞?；旧细鶕?jù)報道的方法進行細胞培養(yǎng)和靶定程序(Suzuki N et.al，Development.，122(11)，3587-95(1996))。
首先，將5×107個ES細胞和用NotI和SaiI消化后的50μg報道基因載體在0.8ml的緩沖溶液中混和，并通過用Gene Pulser(Bio-Rad，400V，25μF，電極寬度0.4cm)進行電脈沖將DNA轉(zhuǎn)導入細胞中。
在電脈沖后，將細胞在已經(jīng)在10cm培養(yǎng)皿底部培養(yǎng)為單層的飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)。作為飼養(yǎng)細胞，將來自12.5天齡胚胎的胚胎成纖維細胞通過用0.1mg/ml的絲裂霉素C處理2小時滅活并且喪失其有絲分裂活性。在開始培養(yǎng)后24、60和96小時向ES細胞加入1.33μg/ml的抗生素嘌呤霉素，再持續(xù)12小時，洗滌并更換為正常培養(yǎng)基。通過重復這些步驟，選擇在其染色體中摻入了報道基因載體的嘌呤霉素抗性ES克隆。
在開始培養(yǎng)7天后，將大約200個嘌呤霉素抗性菌落移至96孔平板中并繼續(xù)培養(yǎng)。當細胞充分生長時，將每個平板分成三個96孔平板。在細胞進一步生長后，將第一個平板在-85℃保存在冰箱中，第二個平板用于分析β-半乳糖苷酶活性，第三個平板用于分析在導入Cre表達載體(pBSCAGCre)后β-半乳糖苷酶活性。
報道基因細胞中大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因是沉默的并且不被翻譯為蛋白質(zhì)，因為其上游存在在兩個LoxP序列之間插入的嘌呤霉素基因和STOP序列。因此，大腸桿菌β-半乳糖苷酶活性在沒有Cre表達的報道基因細胞中檢測不到。從僅在導入Cre表達載體之后具有β-半乳糖苷酶活性的細胞中選擇一些克隆，生長并以冷凍狀態(tài)保存作為報道基因-ES細胞以進行基因捕獲。使用Rosch的Fugenekit，將Cre強制表達載體pBSCAGCre轉(zhuǎn)導進入細胞中。
實施例4基因捕獲載體轉(zhuǎn)導進報道基因ES細胞及基因捕獲的候選細胞的選擇圖4示出解釋這個實施例的每個步驟的示意圖。將5×107個報道基因ES細胞與用PmeI和SalI線性化的50μg捕獲載體pMIE混和，并用Gene Pulser(Bio-Rad，400V，25μF，電極寬度0.4cm)通過電脈沖將線性化的載體轉(zhuǎn)導入細胞中。轉(zhuǎn)導24小時后，向培養(yǎng)基中加入160μg效價/ml的抗生素G418，并開始選擇抗性菌落。在開始培養(yǎng)后7天，將大約200個菌落的G418抗性細胞移至96孔平板中并將細胞充分生長。
在此階段，細胞克隆的G418抗性歸因于從Neo基因開始的穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄和翻譯，其保證通過捕獲載體經(jīng)過Neo基因的下游加入的第二個剪接供體而捕獲基因的外顯子，或者通過捕獲載體直接捕獲polyA添加信號。
然后，將每個平板分成三個平板以制備復制品。使其生長并將一個平板在-85℃在冰箱中冷凍貯存(圖4左側(cè))，第二個平板用于分析β-半乳糖苷酶活性(圖4中間)及第三個平板用于分析分化后β-半乳糖苷酶活性(圖4右側(cè))。之后，根據(jù)報道的方法進行體外誘導分化和LacZ染色(Gajovic S.et.al.，Experimental Cell Research 242(1)，138-143(1998))。
使用96孔平板(圖4中間)在用4％低聚甲醛固定及LacZ染色后證實LacZ陽性細胞的存在。圖4中間標記A代表LacZ陽性。
然后，將另一個96孔平板中的細胞(圖4右側(cè))在飼養(yǎng)層中充分生長，簡單地經(jīng)胰蛋白酶消化，并在未包被的平板中在存在含有0.00lmM視黃酸的DMEM培養(yǎng)基(5％胎牛血清)中培養(yǎng)4天以形成胚體(embryonal body)。然后，將細胞移至用明膠包被的培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)4天。胚體喪失其結(jié)構(gòu)，附著于培養(yǎng)皿的表面，并分化為多種細胞類型，包括神經(jīng)細胞。接下來，將細胞用4％低聚甲醛固定，針對LacZ活性染色并核實LacZ陽性細胞的存在與否。一部分附著于培養(yǎng)皿的細胞被證實是陽性LacZ活性。在圖4右側(cè)，標記A和B代表LacZ陽性。
圖5中的照片示出在兩個平板(圖4中間和右側(cè))中僅在誘導分化后有LacZ陽性細胞。這些照片示出在ES細胞分化期間或之后誘導捕獲載體的Cre基因表達的基因被捕獲。
實施例5通過RT-PCR對捕獲基因的鑒別基本根據(jù)報道的方法進行鑒別(Frohman M.A.et.al.，Proc.NatlAcad Sci USA 85(23)8998-9002(1988))。
由于捕獲載體中PGK啟動子具有組成型轉(zhuǎn)錄活性，因此不論分化狀態(tài)與否在抗生素G418抗性細胞中均有Neo基因轉(zhuǎn)錄物。另外，由于捕獲載體的特性，捕獲的基因序列位于Neo和polyA序列之間。
因此，可以在從大量培養(yǎng)的捕獲克隆未分化的ES細胞中提取RNA之后，在Neo基因轉(zhuǎn)錄物的polyA序列和Neo基因序列之間通過PCR擴增鑒別和分析捕獲的基因。
使用TRIzol試劑盒(Invitrogen)從ES細胞捕獲克隆中提取RNA。
cDNA是使用dT17接頭(adapter)引物(SEQ ID NO7)及分離的RNA作為模板通過逆轉(zhuǎn)錄而制備。使用cDNA合成試劑盒(Promega)進行cDNA合成。在第一次PCR中使用了接頭引物(SEQ ID NO8)、作為Neo基因序列的一部分的一個引物(第一NEO引物，SEQ IDNO9)、及合成的cDNA的一部分。然后，為了增加擴增效力和純度，使用接頭引物(SEQ ID NO10)和包含位于第一個引物下游的序列的第二NEO引物進行第二次PCR。
基于上述程序，證實鑒別的基因是具有新的DNA序列的一個基因(數(shù)據(jù)未示出)及所述捕獲系統(tǒng)是有功能的。
序列表<110>獨立行政法人科學技術(shù)振興機構(gòu)<120>基因捕獲系統(tǒng)<130>PS04-405PCT<160>11<170>PatentIn version3.3<210>1<211>58<212>DNA<213>murine<400>1agatctcact tagcccatcc atttggaatc tcacctttct tcctgtttct ttctgcag 58<210>2<211>31<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>2aactgcagcg ctccggttat tttccaccat a 31<210>3<211>32<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>3ccctcgagta ttatcatcgt gtttttcaaa gg 32<210>4<211>55<212>DNA<213>artificial sequence<220>
<223>primer<400>4catcatgagc ggccctccaa aaaagaagag aaaggtagaa gacccgggcg gccgc 55<210>5<211>129<212>DNA<213>artificial sequence
<220>
<223>splicing donor<400>5tctagaattc gctgtctgcg agggccggct gttggggtga gtactccctc tcaaaagcgg60gcatgacttc tgcgctaaga ttgtcagttt ccaaaaacga ggaggatttg atattcacct120ggcccgcgg129<210>6<211>10<212>DNA<213>artificial sequence<220>
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<223>primer<400>11ccttcttgac gagttcttct g 2權(quán)利要求
1.一種基因捕獲方法，包括如下步驟用一種報道基因載體轉(zhuǎn)化靶細胞，用捕獲載體轉(zhuǎn)染前一步驟中的轉(zhuǎn)化細胞，從在前一步驟中獲得的細胞中選擇無報道基因活性的細胞，將在前一步驟中選擇的細胞暴露于給定條件并從前一步驟的細胞中選擇具有報道基因活性的細胞，其中所述報道基因載體具有通過將在靶細胞中起作用的啟動子、第一個LoxP序列、藥物抗性基因、轉(zhuǎn)錄終止的STOP序列、第二個LoxP序列和一個報道基因依次連接而組成的一個單元，且所述基因捕獲載體具有通過將剪接受體、IRES、添加有核定位信號的Cre、第一個剪接供體、組成型表達基因啟動子、藥物抗性基因和第二個剪接供體依次連接而組成的一個單元。
2.權(quán)利要求1的方法，進一步包括克隆在選擇的細胞中與捕獲載體鄰近的DNA及確定核苷酸序列的步驟。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述靶細胞是ES細胞。
4.一套基因捕獲載體，其包含一個報道基因載體和一個基因捕獲載體，其中所述報道基因載體包含通過將在靶細胞中起作用的啟動子、第一個LoxP序列、藥物抗性基因、轉(zhuǎn)錄終止的STOP序列、第二個LoxP序列和一個報道基因依次連接而組成的一個單元，且所述基因捕獲載體包含通過將剪接受體、IRES、添加有核定位信號的Cre、第一個剪接供體、組成型表達基因啟動子、藥物抗性基因和第二個剪接供體依次連接而組成的一個單元。
5.以權(quán)利要求4的一套載體轉(zhuǎn)化的細胞或包含所述細胞的非人類動物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基因捕獲系統(tǒng)，通過其可以捕獲任何基因，包括瞬時表達的基因?；蚩梢詰脕碜允删wP1的Cre重組酶基因通過捕獲載體而被捕獲，而且被捕獲基因的表達被轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N報道基因的組成型表達。
文檔編號A01K67/02GK1761755SQ20048000682
公開日2006年4月19日 申請日期2004年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月13日
發(fā)明者鈴木昇 申請人:獨立行政法人科學技術(shù)振興機構(gòu)