專利名稱：副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物疫病防控領(lǐng)域，特別是涉及一種副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載 體及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, Hps)是巴氏桿菌科成員，革蘭氏陰性小 桿菌，主要引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎；出現(xiàn)以發(fā)熱、咳嗽和呼吸障礙等為特征的呼 吸道疾病癥候群。可以并發(fā)或繼發(fā)于藍(lán)耳病、偽狂犬病、細(xì)小病毒病、圓環(huán)病毒病、豬瘟等 疫病，使疫情復(fù)雜化，經(jīng)濟(jì)損失加重。Glasser(1910)首次報(bào)道了該菌與豬的纖維素性漿 膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)之間的聯(lián)系，故該病也稱Glasser’ s病，Kilianl976證明了該菌生長(zhǎng) 時(shí)不需要X因子(血紅素和其它卟啉類物質(zhì))，將該菌命名為副豬嗜血桿菌(Bouchet B， Vanier G, Jacques Μ, et al. Studies on the interactions of Haemophilus parasuis with porcine epithelial tracheal cells :Limitedrole of LOS in apoptosis and pro-inflammatory cytokine release[J]. Microbial Pathogenesis. 2009,46(2) 108-113)。芳香族氨基酸在細(xì)菌中只有一條通過分枝酸的合成途徑，打斷這一途徑中的任何 一個(gè)關(guān)鍵基因，如aroA，axoD, aroC等，都能阻斷細(xì)菌芳香族氨基酸的合成，而芳香族氨基 酸在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)不是一種代謝產(chǎn)物，含量甚微，故細(xì)菌從宿主體內(nèi)獲得這些化合物的 可能性極小，因此這些基因發(fā)生突變的細(xì)菌在宿主體內(nèi)只能有限生長(zhǎng)繁殖從而導(dǎo)致減毒效 應(yīng)(劉英杰，芮賢良，徐永強(qiáng)，等.志賀氏菌芳香族氨基酸缺陷減毒株的構(gòu)建[J].武警醫(yī) 學(xué)· 1999(02) 68-70.)。自殺質(zhì)粒是指那些在某些特定的細(xì)菌中自主復(fù)制而在其它細(xì)菌中不能自主復(fù)制 的質(zhì)粒，它的復(fù)制需要一種特殊蛋白，大多數(shù)細(xì)菌不產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)，因此，當(dāng)進(jìn)入寄主細(xì) 胞時(shí)，要么不能復(fù)制，被消除，要么被整合到染色體上和染色體一起復(fù)制，利用自殺質(zhì)粒的 這一特點(diǎn)，將基因工程技術(shù)構(gòu)建的基因突變DNA片段，克隆入自殺質(zhì)粒，利用突變基因兩端 的同源片段與基因組發(fā)生同源交換重組構(gòu)建精確的基因缺失株(徐建國(guó)主編.分子醫(yī)學(xué)細(xì) 菌學(xué)[M].北京科學(xué)出版社，2000:296)，基因缺失株可作為動(dòng)物疫病防治的疫苗。徐引弟等構(gòu)建了重組自殺性質(zhì)粒，獲得了豬霍亂沙門氏菌突變株(徐引弟，郭愛 珍，陳煥春.豬霍亂沙門氏菌C500株crp _/gfp +缺失株的構(gòu)建及鑒定[J].農(nóng)業(yè)生 物技術(shù)學(xué)報(bào).2008 (02) :196-201.)。羅曉松等通過自殺質(zhì)粒構(gòu)建了嗜水氣單胞菌aopB-/ aopD-/aroA-缺失株(羅曉松，尚書，侯化鵬，等.魚源嗜水氣單胞菌aopB -/aoopD -/ aroA -缺失株的構(gòu)建及鑒定[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).2009 (01) :440_442.)。胡奕等利 用自殺性載體和同源重組的原理構(gòu)建了 045的Ier基因缺失突變菌株P(guān)EPEC 045 ( Δ ler)， 并對(duì)該菌株的Vero細(xì)胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠和乳豬的被動(dòng)免疫保護(hù)作用進(jìn) 行了研究，并證明所構(gòu)建的045 (Aler)基因缺失突變?nèi)醵揪昕勺鳛轭A(yù)防PEPEC 045感染 的疫苗候選株(胡奕，宋杰，趙寶華.腸致病性大腸桿菌045基因缺失疫苗菌株的構(gòu)建及其免疫原性分析[J].生物工程學(xué)報(bào).2009 (02) :181-188.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)防治副豬嗜血桿菌所致動(dòng)物疫病的需要，提供一種副豬嗜血桿菌aroA 基因自殺載體及構(gòu)建方法，該載體可用于構(gòu)建篩選的副豬嗜血桿菌的弱毒力突變菌株，以 作為防治疫病的疫苗候選株。 一種副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體，包括骨架載體和突變的aroA基因，所述骨 架載體包含條件復(fù)制起點(diǎn)、抗生素抗性選擇位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)，所述突變的aroA基因插入 在所述多克隆位點(diǎn)上，所述條件復(fù)制起點(diǎn)指使所述自殺載體不在副豬嗜血桿菌中自主復(fù)制 的起始序列，所述突變的aroA基因指aroA基因序列中插入了抗生素表達(dá)盒，所述抗生素表 達(dá)盒與所述抗生素抗性選擇位點(diǎn)為分別針對(duì)不同的抗生素選擇的基因位點(diǎn)。所述骨架載體的核苷酸序列如Seq ID No. 1所示，帶有一個(gè)R6K條件復(fù)制起點(diǎn)，卡 那抗性選擇標(biāo)記位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI和SphI，。所述抗生素表達(dá)盒為具有如SEQ ID N02所示的核苷酸序列的氯霉素表達(dá)盒。所述副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體，其核苷酸序列如SEQ ID N03所示。一種副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)以 EZ-Tn5 <R6K y ori/KAN_2> 轉(zhuǎn)座子為模板，PCR 擴(kuò)增得到如 Seq ID No. 1 所 示的核苷酸序列，酶切連接環(huán)化為骨架質(zhì)粒PSD ；(2)以副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)的基因組為模板，PCR擴(kuò)增aroA基 因，如SEQ ID N04所示，并連接到質(zhì)粒pGM-T上得到重組質(zhì)粒pT_aroA ；(3)以PACYC184質(zhì)粒為模板擴(kuò)增氯霉素表達(dá)盒片段cm，擴(kuò)增氯霉素表達(dá)盒片段cm 的引物5’端設(shè)置有aroA基因序列中任意一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，(4)使用cm的引物中酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶酶切氯霉素表達(dá)盒片段cm和 pT-aroA，連接獲得重組質(zhì)粒pT-aroA-cm ；(5)酶切pT-aroA-cm和pSD，然后連接得到重組自殺載體pSD-aroA-cm。所述擴(kuò)增骨架載體的引物含有Nolt位點(diǎn)，序列如下SD-F 5ATAGCGGCCGCGATGAATTGCTTCGTTAATACAG3SD-R 5TAGCGGCCGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCC3。所述擴(kuò)增aroA基因的引物如下 aroA-F 5TATGGATCCCGTTACTTTCACAACCGCCTCG3，aroA-R 5TATGTCGACTGTTTAAAATAGCCTCAATCCC3，所述酶切pt-aroA-cm和pSD的限制性內(nèi)切酶為BamHI、SalI。所述擴(kuò)增氯霉素表達(dá)盒片段cm的引物5’端設(shè)置有HindIII酶切位點(diǎn)，序列如下ChlF 5TGAAGCTTTTTAAGGGCACCAATAAC3，ChlR 5AGAAGCTTAAATACCTGTGACGGAAGA3 ；所述酶切氯霉素表達(dá)盒片段 cm 和 pT-aroA的限制性內(nèi)切酶為HindIII。篩選aroA基因插入突變的副豬嗜血桿菌突變菌株的方法，將所述副豬嗜血桿菌 aroA基因自殺載體轉(zhuǎn)化到副豬嗜血桿菌中進(jìn)行共培養(yǎng)發(fā)生同源單交換，通過所述抗生素表 達(dá)盒所對(duì)應(yīng)的抗生素篩選陽性克隆獲得突變菌株。
本發(fā)明提供一種副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體，該載體的骨架載體包含一個(gè)條件復(fù)制起點(diǎn)、抗生素抗性標(biāo)記位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)，本發(fā)明將突變的aroA基因插入到骨架 載體的多克隆位點(diǎn)后獲得自殺載體。突變的aroA基因?yàn)樵赼roA基因的插入一段抗生素表 達(dá)盒，一方面作為篩選陽性突變菌株的抗性標(biāo)記位點(diǎn)，另一方面可以作為aroA基因突變插 入序列，該抗生素表達(dá)盒中斷了 aroA基因的表達(dá)，從而打斷了副豬嗜血桿菌自身芳香族氨 基酸的合成，而哺乳動(dòng)物不具備芳香族氨基酸的合成途徑，故細(xì)菌從宿主體內(nèi)獲得這些化 合物的可能性極小，因此在宿主體內(nèi)只能有限生長(zhǎng)繁殖，從而導(dǎo)致其對(duì)寄主細(xì)胞的毒力大 大減弱；該自殺載體環(huán)化連接后得到自殺質(zhì)粒，其中條件復(fù)制起點(diǎn)限制其只能在表達(dá)η蛋 白的細(xì)菌中自主復(fù)制，而副豬嗜血桿菌不表達(dá)η蛋白，因此轉(zhuǎn)入副豬嗜血桿菌后，超螺旋 的自殺質(zhì)粒便會(huì)被線性化，因自殺質(zhì)粒上含有受體菌副豬嗜血桿菌的基因同源序列一突 變的aroA基因中抗生素表達(dá)盒的兩側(cè)序列，線性化的自殺質(zhì)粒便會(huì)雜交到受菌體的染色 體上，隨著副豬嗜血桿菌基因組的復(fù)制，自殺質(zhì)粒與受體菌的aroA基因發(fā)生置換，即同源 單交換，隨著受體菌的分裂和染色體的復(fù)制，產(chǎn)生含有突變的aroA基因的副豬嗜血桿菌突 變菌株，自殺質(zhì)粒的aroA基因中插入的抗生素表達(dá)盒為作為篩選陽性突變菌株的標(biāo)記位 點(diǎn)，因此可加入該抗生素選出副豬嗜血桿菌aroA基因突變株。本發(fā)明進(jìn)一步提供具體的骨架載體如Seq ID No. 1所示，帶有一個(gè)R6K條件復(fù)制 起點(diǎn)R6K，卡那抗性選擇標(biāo)記位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)NotI、BamHI, XbaI, Sail、AccI、HincII, PstI和SphI。該骨架載體只能在表達(dá)π蛋白的細(xì)菌中增殖，副豬嗜血桿菌不表達(dá)π蛋白， 因此限制該自殺載體在副豬嗜血桿菌中的自主復(fù)制。本發(fā)明的自殺載體中，突變的aroA基因插入序列為氯霉素表達(dá)盒，氯霉素是一種 常用抗性篩選物，并與卡那霉素相區(qū)別，共同用于篩選本發(fā)明的所要獲得的陽性重組自殺 載體，其中氯霉素用于篩選本發(fā)明所要獲得的陽性突變菌株。所述氯霉素表達(dá)盒插入在aroA基因的HindIII位點(diǎn)，該位點(diǎn)處于aroA基因的中 上游位置，如Seq ID No. 4的aroA基因起始密碼子后第170bp位置，有利于及時(shí)阻斷aroA 基因表達(dá)。本發(fā)明獲得的自殺載體轉(zhuǎn)入副豬嗜血桿菌中，由于不能自主復(fù)制，因此只能整合 到副豬嗜血桿菌得基因組DNA中，因發(fā)生同源重組單交換而將副豬嗜血桿菌中的aroA基因 置換成突變的aroA基因，通過抗生素篩選獲得aroA基因突變株。將基因突變株接種到哺 乳動(dòng)物細(xì)胞后，由于宿主細(xì)胞不產(chǎn)生芳香族氨基酸，因此接種的突變株細(xì)菌的增殖受到嚴(yán) 重減弱甚至不能復(fù)制繁殖，因此對(duì)宿主的毒力大大減弱，但能夠使宿主對(duì)副豬嗜血桿菌產(chǎn) 生抗體，因此這樣的突變株可作為預(yù)防副豬嗜血桿菌感染所致疫病的疫苗候選株。根據(jù)本發(fā)明的提供的自殺載體的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建該自殺載體的方法是本領(lǐng)域常用的實(shí) 驗(yàn)方法，其中主要涉及到限制性酶切、連接，及在擴(kuò)增各段序列的引物中設(shè)置酶切位點(diǎn)，以 便于下一步與載體或其他片段連接。本發(fā)明進(jìn)一步提供構(gòu)建該自殺載體的方法。以EZ-Tn5TM<R6K y ori/KAN-2>轉(zhuǎn)座 子為模板，PCR擴(kuò)增得到2000bp的如Seq ID No. 1所示的骨架載體片段，擴(kuò)增引物5’端含 有NotI位點(diǎn)，用NotI內(nèi)切酶酶切后，連接得到環(huán)化的骨架質(zhì)粒pSD，其中順次包括條件復(fù) 制起點(diǎn)R6K，卡那抗性選擇標(biāo)記和多克隆位點(diǎn)NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI 和SphI。以副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)的基因組為模板，上下游擴(kuò)增引物5’端分別設(shè)計(jì)有BamHI和SalI位點(diǎn)，以便于連接到骨架載體的多克隆位點(diǎn)上，PCR擴(kuò)增含 有aroA基因的片段，如SEQ ID N04所示，克隆到質(zhì)粒pGM_T上得到重組質(zhì)粒pT_aroA ；以 PACYC184質(zhì)粒為模板擴(kuò)增氯霉素表達(dá)盒片段cm，如SEQ ID N02所示，擴(kuò)增cm的引物5，端 設(shè)置有aroA基因序列中任意一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，本發(fā)明優(yōu)選HindIII酶切位點(diǎn)，cm插入 到pT-aroA的aroA基因中HindIII酶切位點(diǎn)使aroA基因突變，并獲得含突變的aroA基因 的重組質(zhì)粒pT-aroA-cm ；以BamHI和SalI雙酶切pT-aroA-cm和pSD，然后連接得到重組自 殺載體 pSD-aroA-cm，如 SEQ ID NO. 3 所示。綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建的自殺載體，可轉(zhuǎn)化到副豬嗜血桿菌中，用于篩選基因突變 株，基因突變株不能自身合成芳香族氨基酸，也不能從宿主細(xì)胞獲得足夠的芳香族氨基酸， 只能有限繁殖，因此對(duì)宿主毒力非常弱，但能像野生菌株一樣對(duì)宿主的免疫系統(tǒng)能產(chǎn)生誘 導(dǎo)，可作為預(yù)防副豬嗜血桿菌所致疫病的疫苗候選株。


圖1.自殺載體質(zhì)粒pSD的構(gòu)建及鑒定1.載體骨架 PCR 擴(kuò)增(2000bp) ；2. Marker DL15000 ;3_5· BamHI\SalI\NotI 單酶 切鑒定PSD載體圖2. aroA基因的擴(kuò)增1. Marker DL15000, 2-3. aroA 基因 PCR 產(chǎn)物 2304bp圖3.圖3氯霉素基因的擴(kuò)增1. Marker DL2000 ；2-3.氯霉素基因 PCR 產(chǎn)物，906bp圖4. pT-aroA 的鑒定1. Marker DL15000 ；2.載體骨架 PCR 擴(kuò)增 2001bp ；3. pT-aroA 的 EcoRI 酶切鑒 定，三條帶(3. 0kb+l. 4kb+0. 9kb) ；4. pT-aroA 的 NotI 酶切鑒定，兩條帶(3. Okb+2. 3kb)； 5. pT-aroA 的 HindIII 酶切鑒定，一條帶(5. 3kb)圖5.重組質(zhì)粒pT-aroA-cm的酶切鑒定1. Marker DL15000bp ；2. pT-aroA-cm 的 BamHI+Sall 雙酶切鑒定，兩條帶 (3. Okb+3. 2kb) ；3. pT-aroA-cm 的 EcoRI 鑒定，四條帶(3. Okb+1. 7kb+0. 9kb+0. 6kb)； 4. pT-aroA-cm 的 HindIII 單酶切鑒定，兩條帶(5. 3kb+0. 9kb) ；5. pT-aroA-cm 的 NotI 酶切 鑒定，兩條帶(3. Okb+3. 2kb)圖6.重組自殺質(zhì)粒pSD-aroA-cm的構(gòu)建及鑒定1. Marker DL15000bp ；2. pSD-aroA-cm 的 BamHI 單酶切鑒定，一條帶(5. 2kb)； 3. pSD-aroA-cm 的 BamHI+Sall 雙酶切鑒定，兩條帶(2. Okb+3. 2kb)圖7重組自殺質(zhì)粒pSD-aroA-cm的分子構(gòu)成示意圖
具體實(shí)施例方式1材料與方法1. 1.菌株和質(zhì)粒副豬嗜血桿菌5型標(biāo)準(zhǔn)菌株HS80，本實(shí)驗(yàn)室有保存，可向公眾發(fā)放(實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的 目的，也可以用任何別的副豬嗜血桿菌菌株)質(zhì)粒pGM-T和大腸桿菌T0P10購自天根生物技術(shù)有限公司；
EZ-Tn5 <R6K y ori/KAN_2>轉(zhuǎn)座子和表達(dá)π蛋白的感受態(tài)大腸桿菌EC100D pir-116 購于 EPICENTRE 公司；pACYC184質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)室有保存可向公眾發(fā)放，也可購買到。1. 2主要試劑PCR預(yù)混體系2 XPCR superMix、小量質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試 劑盒購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司，T4DNA連接酶購自TaKaRa公司，細(xì)菌基因 組提取試劑盒購自QIAGEN公司，引物(表1)合成及測(cè)序由Irwitrogen公司完成。核酸限 制性內(nèi)切酶BamH I、SalI和Hind III均為TaKaRa(大連)公司產(chǎn)品。1. 3PCR引物設(shè)計(jì)本發(fā)明使用引物(表1)由Invitrogen公司合成。表1本研究中所用引物Table lprimers used in this paper 注下劃線為酶切位點(diǎn)序列實(shí)施例1.骨架載體pSD的構(gòu)建以EZ-Tn5 <R6K y ori/KAN_2>為模板，擴(kuò)增長(zhǎng)度2000bp載體骨架，帶有一個(gè)R6K 條件復(fù)制起點(diǎn)R6K，卡那抗性選擇標(biāo)記位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)NotI、BamHI, XbaI, Sail, AccI、 HincII, PstI和SphI，用于擴(kuò)增的上下游引物SD-F/SD-R的5’端設(shè)計(jì)NotI限制性內(nèi)切酶 位點(diǎn)(見表1)，PCR體系及條件PCR預(yù)混體系2 X PCR superMix 25 μ L，H2O 22 μ L，上下游 引物 SD-F/SD-R 各 1 μ L，模板 1 μ L。95°C變性 5min ；94°C 30s, 56°C 45s, 72°C 30s, 30 個(gè)循 環(huán)；72°C IOmin0 PCR驗(yàn)證擴(kuò)增片段大小約2000bp，大小與預(yù)期相符，如圖1第2泳道，測(cè)序 結(jié)果正確；PCR產(chǎn)物通過引物上的NotI位點(diǎn)進(jìn)行酶切、連接環(huán)化得到質(zhì)粒pSD，酶切鑒定質(zhì) 粒pSD，結(jié)果如圖1 ；pSD轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌EC100D pir-116。實(shí)施例2.突變的aroA基因的制備步驟1.使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取Hps基因組為模板，使用表1中的引物 aroA-F/aroA-R擴(kuò)增aroA基因，引物5’端分別設(shè)入了 BamHI、SalI位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增片段序列如Seq ID NO. 4所示，包括整個(gè)aroA基因(1314bp)及其上游約952bp片段和下游部分片 段，與引物設(shè)計(jì)所預(yù)期的大小相符約2300bp (見圖2)，擴(kuò)增片段與質(zhì)粒pGM-T連接，得到重 組質(zhì)粒pT-aroA，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌ToplO中，增菌后提取質(zhì)粒pT-aroA，pT-aroA的 EcoRI酶切鑒定，得到三條帶3. 0kb、l. 4kb、0. 9kb ；NotI酶切鑒定得到兩條帶3. Okb+2. 3kb ； Hindlll酶切鑒定，一條帶(5. 3kb)酶切結(jié)果與預(yù)期相符，如圖4所示。步驟2.以pACYC184質(zhì)粒為模板，使用表1中的引物ChlF/ChlR擴(kuò)增氯霉素表達(dá) 盒片段cm，氯霉素基因片段長(zhǎng)約906bp，擴(kuò)增大小與預(yù)期相符(見圖3)。步驟3.如Seq ID NO. 4所示，在Seq ID NO. 4所示核苷酸序列的第1124bp位點(diǎn)即 在aroA基因起始密碼子后第173bp位點(diǎn)處有一個(gè)Hindlll位點(diǎn)，可以用來制備aroA插入突 變載體。cm和質(zhì)粒pT-aroA經(jīng)Hindlll酶切消化，連接后篩選陽性重組質(zhì)粒pT-aroA-cm， 酶切鑒定pT-aroA-cm，見圖5，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符合。實(shí)施例3.含突變aroA基因的自殺質(zhì)粒的構(gòu)建pT-aroA-cm重組質(zhì)粒和pSD都經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BamHI與Sail的消化后，回收 aroA-cm片段，核苷酸序列如Seq ID NO. 5所示，經(jīng)連接反應(yīng)插入到骨架載體pSD上，構(gòu)建成 pSD-aroA-cm重組自殺載體，結(jié)構(gòu)如圖7所示，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌EC100D pir_116，用氯 霉素和卡那霉素篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒pSD-aroA-cm，用PCR、酶切進(jìn)行鑒定，如圖6所示 BamHI單酶切鑒定，一條帶(約5. 2kb) ；3. pSD-aroA-cm的BamHI+Sall雙酶切鑒定，兩條帶 (約2. Okb+3. 2kb)，證明構(gòu)建獲得自殺載體。SEQUENCE LISTING<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院<120>副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體及構(gòu)建方法<130>P09528/NLK<160>11<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>2000<212>DNA<213>骨架載體<400>1ggtgtctcaa aatctctgataaaactgtct gcttacataaaacgtcttgc tcgaggccgcatgggctcgc gataatgtcgcgatgcgcca gagttgtttctgagatggtc agactaaacttatccgtact cctgatgatgccaggtatta gaagaatatccctgcgccgg ttgcattcgatcgtctcgct caggcgcaat
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13
<213>擴(kuò)增氯霉素表達(dá)盒的引物ChlR<400>11agaagcttaa atacctgtga cggaaga2權(quán)利要求
一種副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體，包括骨架載體和突變的aroA基因，所述骨架載體包含條件復(fù)制起點(diǎn)、抗生素抗性選擇位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)，所述突變的aroA基因插入在所述多克隆位點(diǎn)上，所述條件復(fù)制起點(diǎn)指使所述自殺載體不在副豬嗜血桿菌中自主復(fù)制的起始序列，所述突變的aroA基因指aroA基因序列中插入了抗生素表達(dá)盒，所述抗生素表達(dá)盒與所述抗生素抗性選擇位點(diǎn)為分別針對(duì)不同的抗生素選擇的基因位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體，所述骨架載體的核苷酸序 列如Seq ID No. 1所示，帶有一個(gè)R6K條件復(fù)制起點(diǎn)，卡那抗性選擇標(biāo)記位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn) NotI、BamHI、XbaI、SalI、AccI、HincII、PstI 和 SphI。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體，所述抗生素表達(dá)盒為 具有如SEQ ID N02所示的核苷酸序列的氯霉素表達(dá)盒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體，其核苷酸序列如SEQ IDN03所示。
5.一種副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)以EZ-Tn5 <R6KYori/KAN-2>轉(zhuǎn)座子為模板，PCR擴(kuò)增得到如SeqID No. 1所示的 核苷酸序列，連接環(huán)化為骨架質(zhì)粒PSD ；(2)以副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)的基因組為模板，PCR擴(kuò)增aroA基因， 如SEQ ID N04所示，并連接到質(zhì)粒pGM-T上得到重組質(zhì)粒pT_aroA ；(3)以pACYC184質(zhì)粒為模板擴(kuò)增氯霉素表達(dá)盒片段cm，擴(kuò)增氯霉素表達(dá)盒片段cm的 引物5’端設(shè)置有aroA基因序列中任意一個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，(4)使用cm的引物中酶切位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶酶切氯霉素表達(dá)盒片段cm和pT-aroA， 連接獲得重組質(zhì)粒pT-aroA-cm ；(5)酶切pT-aroA-cm和pSD，然后連接得到重組自殺載體pSD-aroA-cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，所述擴(kuò)增骨架載體的引物含有NotI位點(diǎn)，序列如下SD-F 5-ATAGCGGCCGCGATGAATTGCTTCGTTAATACAG-3SD-R :5-TAGCGGCCGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCC-3。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，所述擴(kuò)增aroA基因的引物如下aroA-F 5-TATGGATCCCGTTACTTTCACAACCGCCTCG-3，aroA-R 5-TATGTCGACTGTTTAAAATAGCCTCAATCCC-3，所述酶切pT-aroA-cm和pSD的限制性內(nèi)切酶為BamHI、Sail。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，所述擴(kuò)增氯霉素表達(dá)盒片段cm的引物5’端設(shè)置 有HindIII酶切位點(diǎn)，序列如下ChlF 5-TGAAGCTTTTTAAGGGCACCAATAAC-3,ChlR :5-AGAAGCTTAAATACCTGTGACGGAAGA-3 ；所述酶切氯霉素表達(dá)盒片段 cm和 pT-aroA 的限制性內(nèi)切酶為HindIII。
9.篩選aroA基因插入突變的副豬嗜血桿菌突變菌株的方法，指將權(quán)利要求1 4任一 所述的副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體轉(zhuǎn)化到副豬嗜血桿菌中進(jìn)行共培養(yǎng)發(fā)生同源單交 換，通過所述抗生素表達(dá)盒所對(duì)應(yīng)的抗生素篩選陽性克隆獲得突變菌株。
全文摘要
本發(fā)明“一種副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體及構(gòu)建方法”，屬于動(dòng)物疫病防控領(lǐng)域，一種副豬嗜血桿菌aroA基因自殺載體，包括骨架載體和突變的aroA基因，所述骨架載體包含條件復(fù)制起點(diǎn)、抗生素抗性選擇位點(diǎn)和多克隆位點(diǎn)，所述突變的aroA基因插入在所述多克隆位點(diǎn)上，所述條件復(fù)制起點(diǎn)指使所述自殺載體不在副豬嗜血桿菌中自主復(fù)制的起始序列，所述突變的aroA基因指aroA基因序列中插入了抗生素表達(dá)盒，所述抗生素表達(dá)盒與所述抗生素抗性選擇位點(diǎn)為分別針對(duì)不同的抗生素選擇的基因位點(diǎn)。本發(fā)明提供的自殺載體能夠用于選擇aroA基因突變的弱毒副豬嗜血桿菌菌株。
文檔編號(hào)C12N15/74GK101875944SQ20091023804
公開日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者葉飛, 孫慧玲, 張培君, 張莉, 徐慧, 徐福洲, 王宏俊, 賀云霞, 龔玉梅 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院