專利名稱：高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域或植物基因工程領(lǐng)域，尤其是一種高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在果樹上得到了廣泛的應(yīng)用。由于果樹具有多年生、童期長、自交不親和、雜合程度高、多無性繁殖等特點，使采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植物新品種逐漸成為果樹育種的重要手段。最早是1988年以核桃體系為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。而后又在許多果樹上進行了研究，如在核桃上又相繼導(dǎo)入了ICP基因和CHS基因，獼猴桃上已轉(zhuǎn)入水稻的homebox基因，Sagi等在香蕉中轉(zhuǎn)入控制開花的基因，Gervera等在柑橘中轉(zhuǎn)入了耐鹽基因HAL2，并已得到再生植株，Bell等在梨中轉(zhuǎn)入了rolC基因。
蘋果是1989年英國East Malling園藝研究所的James等首先報道轉(zhuǎn)化成功的，此外還有綠袖(Green sleeves)、元帥(Delicious)、皇家嘎拉(Royal Gala)、新喬納金和營養(yǎng)系砧木M26等轉(zhuǎn)基因的報道；轉(zhuǎn)化的基因除報告基因外還有胭脂堿合成酶基因、殺蟲結(jié)晶蛋白及豇豆胰蛋白酶抑制基因和MADbox基因等。
總之，蘋果、香蕉、獼猴桃、枳殼、杏、枇杷、龍眼、櫻桃、李、木瓜、懸鉤子、葡萄、胡桃、樹莓、甜橙等都有轉(zhuǎn)基因報道，絕大多數(shù)建立了轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)，不少還建立了再生系統(tǒng)，有的已成功導(dǎo)入外源優(yōu)良基因，并且已得到轉(zhuǎn)基因植株。因此，采用生物技術(shù)手段將這些基因?qū)胫仓陙斫鉀Q因缺鐵引起的果樹營養(yǎng)不平衡問題，補充及擴展常規(guī)育種、并進而獲得果樹鐵高效基因型或新品種將成為可能。
然而對蘋果來講，其雜交比較困難。原因是雜交選育時間比較長，常規(guī)育種不可行，另外，抗缺鐵基因很少，目前主要采用基因槍和砧木來解決這個問題。但采用基因槍不好打；采用砧木也不很理想，抗缺鐵能力較低，存在一定的排斥作用，仍然表現(xiàn)出缺鐵生長。此外，基因轉(zhuǎn)化到蘋果外植體中，難度較大，外植體再生很難，發(fā)芽率很低，再生植株容易受到污染。
把抗缺鐵基因轉(zhuǎn)化到擬南芥上已經(jīng)成功。依據(jù)這個原理，天津農(nóng)學院已經(jīng)成功地采用RT-PCR技術(shù)從擬南芥植株克隆全長FRO2基因，為采用農(nóng)桿菌導(dǎo)入法獲得抗缺鐵蘋果的再生轉(zhuǎn)化株打下了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的難題，提供一種高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法。該方法采用基因工程技術(shù)，通過克隆全長的FRO2基因，將轉(zhuǎn)化FRO2基因進入蘋果，以此得到高鐵含量的蘋果。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法，其轉(zhuǎn)化方法的步驟為(1).取蘋果樹的莖尖組織在MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)；(2).培養(yǎng)后的莖尖組織在擴繁培養(yǎng)基上進行再培養(yǎng)，產(chǎn)生的無菌苗的外植體待用；(3).取攜帶FRO2基因的農(nóng)桿菌的單菌落接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基上并在搖床上培養(yǎng)；(4).將無菌苗的外植體在培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌內(nèi)浸泡，然后將該外植體接種到分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，產(chǎn)生再生轉(zhuǎn)化芽；(5).將該轉(zhuǎn)化芽在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行伸長培養(yǎng)；(6).植入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)；(7).生根移栽；(8).入土栽培。
而且，所述的蘋果樹的莖尖組織在MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)前要采用含氯離子濃度為2.8％的次氯酸鈉溶液消毒10～15分鐘，之后接種到MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)的條件為溫度25～28℃，每天12小時左右光照，光強2500～5000LUX，培養(yǎng)時間為1～2周；培養(yǎng)后用無菌水沖洗三次；而且，所述的擴繁培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基內(nèi)還需添加2～4mg/L的6-BA生長激素和0.2～0.4mg/L的NAA，擴繁條件為溫度為25～28℃，每天12小時左右光照，光強2500～5000LUX，擴繁時間為4～6周。
而且，將攜帶FRO2基因的農(nóng)桿菌的單菌落接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基上并在25～28℃溫度條件下放置在100轉(zhuǎn)/min搖床上，搖擺48小時左右，該YEB液體培養(yǎng)基內(nèi)需要添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的慶大霉素。
而且，將無菌苗的外植體在25～28℃溫度條件下在培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌內(nèi)浸泡10分鐘左右，然后首先將該外植體接種到分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，該分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2～6mg/L的BA以及0.4～0.6mg/L的NAA組成；在該分化培養(yǎng)基上放一層濾紙，把該外植體放置在濾紙上，在25～28℃溫度下的密閉、暗條件下，培養(yǎng)48小時左右取出，然后在一個添加5mg/L的除草劑和500mg/L的羧變青霉素的分化培養(yǎng)基所構(gòu)成的篩選培養(yǎng)基上將外植體所形成的轉(zhuǎn)化芽放入，進行轉(zhuǎn)化芽篩選，在25～28℃溫度、晝夜光照、光強2500～5000LUX的條件下進行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4周后，進行再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4～6周，產(chǎn)生再生轉(zhuǎn)化芽；而且，所述的伸長培養(yǎng)為將再生轉(zhuǎn)化芽在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行伸長培養(yǎng)，該伸長培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2mg/L的BA、0.5mg/L的NAA、5mg/L的除草劑和500mg/L的羧變青霉素組成，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下光照每天12小時左右。
而且，所述的生根移栽為待再生轉(zhuǎn)化芽生長到2～3cm長度時切下，植入生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，該生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、0.2～0.4mg/L的NAA、5mg/L的除草劑和500mg/L的羧變青霉素組成，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下光照每天12小時左右，促其生根。
而且，所述的入土栽培為將生根的轉(zhuǎn)化苗取出，沖洗掉其根部的培養(yǎng)基，將其栽到蛭石培養(yǎng)基內(nèi)，澆MS培養(yǎng)液，保持每天3～4小時直射光照，在25～28℃溫度條件下自然生長，當生長3～4個葉片時，入土栽培。
而且，所述的無菌苗的外植體為無菌苗的葉柄、去掉生長點的莖尖、節(jié)尖、葉片之一。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是據(jù)資料報道，在世界上，有10億多人由于缺鐵而引起缺鐵性貧血，尤其在青年婦女和青少年中特別嚴重。據(jù)估計，在發(fā)展中國家，有50％的孕婦和40％的非孕婦婦女患有缺鐵性貧血。在我國召開的第三界國際婦幼營養(yǎng)會議上報道，我國約有1億兒童患營養(yǎng)性貧血。若膳食中長期供鐵不足，就會影響人體的免疫力。這是由于缺鐵時，與殺菌有關(guān)的許多含鐵酶或依賴鐵的酶活性明顯下降，嗜中性白細胞內(nèi)過氧化物酶活性降低，并且可以直接影響淋巴組織的發(fā)育。另外，缺鐵性貧血還可影響兒童的生長發(fā)育、智能發(fā)育，體力活動下降，引起行為改變，主要表現(xiàn)為注意力分散、對周圍不感興趣、易煩躁、表情淡漠等。
我國大部分果園存在果樹缺鐵黃化問題，大量的柑桔、落葉果樹等都不同程度失綠。我國北方干旱、半干旱地區(qū)的果園土壤多為堿土和鹽堿土，果樹黃化癥發(fā)病率高達30％～60％，丁紹夫在山東、河北、山西、河南、江蘇、北京等五省一市考察表明，蘋果樹缺鐵黃化發(fā)生普遍，所到單位罹病園發(fā)病株率多在50％以上，病株上的病梢率多在70％以上。轉(zhuǎn)基因抗缺鐵黃化品種的培育是一條根本途徑。
本發(fā)明的產(chǎn)生是首次在國際上將影響植株鐵素吸收和代謝的關(guān)鍵性限速酶基因Fe3+-螯合物還原酶基因--FRO2導(dǎo)入蘋果，首次建立了蘋果的高效農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化方法，科學合理，植株的再生率高，轉(zhuǎn)化率高；通過本發(fā)明所生長的轉(zhuǎn)基因蘋果，含有抗缺鐵基因，較大地提高了對鐵的吸收力，從根本上解決蘋果的缺鐵問題，對其他水果的基因轉(zhuǎn)化具有很強的借鑒作用。
具體實施例方式
下面對本發(fā)明實施例做進一步詳述本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化方法由以下步驟構(gòu)成1.取蘋果樹的莖尖組織在MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)取蘋果樹的莖尖組織，首先采用含氯離子濃度為2.8％的次氯酸鈉溶液消毒10～15分鐘，之后接種到MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為1～2周，培養(yǎng)的環(huán)境條件是溫度為25～28℃，光照每天12小時左右，光強2500～5000LUX，然后用無菌水沖洗三次。
2.培養(yǎng)后的莖尖組織在擴繁培養(yǎng)基上進行再培養(yǎng)將培養(yǎng)后的莖尖組織接種到擴繁培養(yǎng)基內(nèi)擴繁4～6周，該擴繁培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基添加2～4mg/L的6-BA生長激素和0.2～0.4mg/L的NAA(奈乙酸)構(gòu)成，條件為溫度為25～28℃，光照每天12小時，光強2500～5000LUX，可獲得10倍左右的增殖率；取擴繁后所產(chǎn)生的無菌苗的外植體(無菌苗的葉柄、去掉生長點的莖尖、節(jié)尖、葉片之一)進行下一步的外植體轉(zhuǎn)化，以下以無菌苗的葉柄為例。
3.取攜帶FRO2基因的農(nóng)桿菌的單菌落接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基上并在搖床上培養(yǎng)取攜帶FRO2基因的農(nóng)桿菌的單菌落接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基上，并放置在搖床上，在25～28℃溫度條件下，以100轉(zhuǎn)/min搖擺48小時，該液體培養(yǎng)基內(nèi)需要添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的慶大霉素。
4.將無菌苗的外植體在培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌內(nèi)浸泡，然后將該外植體接種到分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，產(chǎn)生再生轉(zhuǎn)化芽取葉柄，用培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌在25～28℃溫度條件下浸泡10分鐘，之后取出，然后用無菌濾紙吸干，將葉柄接種到分化培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，該分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2～6mg/L的BA、0.4～0.6mg/L的NAA等構(gòu)成。在該分化培養(yǎng)基上放一層濾紙，把該葉柄放置在濾紙上，25～28℃溫度下的密閉、暗條件下培養(yǎng)48小時取出，然后在一個添加5mg/L的除草劑和500mg/L的羧變青霉素的分化培養(yǎng)基所構(gòu)成的篩選培養(yǎng)基上將外植體所形成的轉(zhuǎn)化芽放入，進行轉(zhuǎn)化芽篩選。在此過程中，葉柄的創(chuàng)口要充分接觸培養(yǎng)基，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下，晝夜光照，培養(yǎng)四周；四周以后，再轉(zhuǎn)接一次。目的是除草劑在長時間條件下有效性會有降低，營養(yǎng)性降低，每4周轉(zhuǎn)接一次，共培養(yǎng)8～10周后，產(chǎn)生再生轉(zhuǎn)化芽。
5.將該轉(zhuǎn)化芽在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行伸長培養(yǎng)把該轉(zhuǎn)化芽切下，在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行長大培養(yǎng)，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下光照每天12小時左右。該伸長培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2mg/L的BA、0.5mg/L的NAA、5mg/L的除草劑和500mg/L的羧變青霉素構(gòu)成。
6.植入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)待再生轉(zhuǎn)化芽生長到2～3cm長度時切下，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下光照每天12小時左右，植入生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，促其生根，形成再生苗。該生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、0.2～0.4mg/L的NAA、5mg/L的除草劑和500mg/L的羧變青霉素構(gòu)成。
7.生根移栽生根后，取出再生苗，沖洗掉再生苗根部的培養(yǎng)基，將其栽到蛭石培養(yǎng)基內(nèi)，澆MS培養(yǎng)液，保持每天3～4小時直射光照，在25～28℃溫度條件下，當生長3～4個葉片時，入土栽培。
權(quán)利要求
1.一種高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于該轉(zhuǎn)化方法的步驟為(1).取蘋果樹的莖尖組織在MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)；(2).培養(yǎng)后的莖尖組織在擴繁培養(yǎng)基上進行再培養(yǎng)，產(chǎn)生的無菌苗的外植體待用；(3).取攜帶FRO2基因的農(nóng)桿菌的單菌落接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基上并在搖床上培養(yǎng)；(4).將無菌苗的外植體在培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌內(nèi)浸泡，然后將該外植體接種到分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，產(chǎn)生再生轉(zhuǎn)化芽；(5).將該轉(zhuǎn)化芽在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行伸長培養(yǎng)；(6).植入生根培養(yǎng)基進行生根培養(yǎng)；(7).生根移栽；(8).入土栽培。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的蘋果樹的莖尖組織在MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)前要采用含氯離子濃度為2.8％的次氯酸鈉溶液消毒10～15分鐘，之后接種到MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)的條件為溫度25～28℃，每天12小時左右光照，光強2500～5000LUX，培養(yǎng)時間為1～2周；培養(yǎng)后用無菌水沖洗三次；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的擴繁培養(yǎng)基為在MS培養(yǎng)基內(nèi)還需添加2～4mg/L的6-BA生長激素和0.2～0.4mg/L的NAA，擴繁條件為溫度為25～28℃，每天12小時左右光照，光強2500～5000LUX，擴繁時間為4～6周。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于將攜帶FRO2基因的農(nóng)桿菌的單菌落接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基上并在25～28℃溫度條件下放置在100轉(zhuǎn)/min搖床上，搖擺48小時左右，該YEB液體培養(yǎng)基內(nèi)需要添加50mg/L的卡那霉素和100mg/L的慶大霉素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于將無菌苗的外植體在25～28℃溫度條件下在培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌內(nèi)浸泡10分鐘左右，然后首先將該外植體接種到分化培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，該分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2～6mg/L的BA以及0.4～0.6mg/L的NAA組成；在該分化培養(yǎng)基上放一層濾紙，把該外植體放置在濾紙上，在25～28℃溫度下的密閉、暗條件下，培養(yǎng)48小時左右取出，然后在一個添加5mg/L的除草劑和500mg/L的羧變青霉素的分化培養(yǎng)基所構(gòu)成的篩選培養(yǎng)基上將外植體所形成的轉(zhuǎn)化芽放入，進行轉(zhuǎn)化芽篩選，在25～28℃溫度、晝夜光照、光強2500～5000LUX的條件下進行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4周后，進行再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4～6周，產(chǎn)生再生轉(zhuǎn)化芽；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的伸長培養(yǎng)為將再生轉(zhuǎn)化芽在伸長培養(yǎng)基內(nèi)進行伸長培養(yǎng)，該伸長培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2mg/L的BA、0.5mg/L的NAA、5mg/L的除草劑和500mg/L的羧變青霉素組成，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下光照每天12小時左右。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的生根移栽為待再生轉(zhuǎn)化芽生長到2～3cm長度時切下，植入生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，該生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、0.2～0.4mg/L的NAA、5mg/L的除草劑和500mg/L的羧變青霉素組成，在25～28℃溫度條件下，光強2500～5000LUX的條件下光照每天12小時左右，促其生根。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的入土栽培為將生根的轉(zhuǎn)化苗取出，沖洗掉其根部的培養(yǎng)基，將其栽到蛭石培養(yǎng)基內(nèi)，澆MS培養(yǎng)液，保持每天3～4小時直射光照，在25～28℃溫度條件下自然生長，當生長3～4個葉片時，入土栽培。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述的無菌苗的外植體為無菌苗的葉柄、去掉生長點的莖尖、節(jié)尖、葉片之一。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域的一種高效蘋果基因轉(zhuǎn)化方法。主要技術(shù)特征是取組織在MS培養(yǎng)基上進行初級培養(yǎng)、在擴繁培養(yǎng)基上進行再培養(yǎng)，取攜帶FRO2基因的農(nóng)桿菌培養(yǎng)、分化培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接培養(yǎng)、伸長培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、入土栽培。本發(fā)明科學合理，植株的再生率高，轉(zhuǎn)化率高；通過本發(fā)明所生長的轉(zhuǎn)基因蘋果，含有抗缺鐵基因，較大地提高了對鐵的吸收力，從根本上解決蘋果的缺鐵問題，對其他水果的基因轉(zhuǎn)化具有很強的借鑒作用。
文檔編號A01H4/00GK1778931SQ20041007285
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
發(fā)明者劉艷軍, 楊靜慧, 楊恩芹, 柳樹梧, 劉玉冬 申請人:天津農(nóng)學院