一種對生產(chǎn)二十二碳六烯酸隱甲藻進行基因轉化的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領域，具體涉及一種對生產(chǎn)二十二碳六烯酸隱甲藻進行基因轉化的方法。
【背景技術】
[0002]二十二碳六稀酸(Docosahexaenoic Acid, DHA)是人腦發(fā)育、成長的重要物質(zhì)之一，是大腦和視網(wǎng)膜的重要構成成分，在人體大腦皮層中含量高達20%，在眼睛視網(wǎng)膜中所占比例最大，約占50%。因此，它對胎兒和嬰幼兒的大腦和視網(wǎng)膜的發(fā)育，以及成年人腦功能的維修等方面有著重要的作用。此外，DHA對冠心病、中風、高血壓等心血管系統(tǒng)的疾病、神經(jīng)失常、老年癡呆癥和抑郁癥等神經(jīng)系統(tǒng)的疾病也有積極的影響。DHA作為一種必需脂肪酸，其增強記憶與思維能力、提高智力等作用更為顯著。人群流行病學研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)DHA含量高的人的心理承受力較強，智力發(fā)育指數(shù)也高。DHA還可用于癌癥治療，抑制發(fā)炎等。據(jù)荷蘭帝斯曼公司的估計，DHA的全球市場價值約為25-26.2億美元，并且以每年15%以上的速度增長。
[0003]截止目前為止，深海魚油一直是市售的DHA的主要來源。但這一主要來源存在諸多缺點，比如海洋污染造成的對魚油安全性的擔憂，魚油質(zhì)量會隨著魚的種類、捕撈季節(jié)和地點的不同而不同，含EPA、易受環(huán)境污染、純化成本高，魚油的特殊氣味也限制了魚油來源的DHA作為一種食品添加劑的應用。尤其是考慮到DHA的主要消費者是懷孕婦女和年幼的孩子，其可能的不利影響更令人擔憂；此外，世界漁業(yè)資源的逐年萎縮對DHA的可持續(xù)性供應的影響也值得考慮。
[0004]利用隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)發(fā)酵生產(chǎn)DHA，與傳統(tǒng)魚油來源相比，具有一系列優(yōu)點，如發(fā)酵周期短，培養(yǎng)方式簡單，微生物生長快，易于大規(guī)模培養(yǎng)；多不飽和脂肪酸含量高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，氧化穩(wěn)定性較好，不飽和脂肪酸成分單一，不含EPA或EPA含量低，易于分離純化；同時克服了傳統(tǒng)的從魚油中獲取DHA受原料、氣候、產(chǎn)地、生產(chǎn)周期等諸多限制因素的影響。因此微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA可替代魚油來源的DHA，具有廣泛的應用前景。
[0005]鑒于隱甲藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA的優(yōu)勢，有必要發(fā)展相關的分子生物學技術對其體內(nèi)積累油脂的代謝途徑及其調(diào)控進行深入的研究，同時發(fā)展相關的基因工程改造策略以進一步提高隱甲藻合成DHA的產(chǎn)率。然而，目前針對隱甲藻尚缺乏有效的基因轉化手段，使得相關的研究和提高產(chǎn)率的工作無法進行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種針對隱甲藻敏感的抗生素，以及提供一種對隱甲藻進行基因轉化的方法。
[0007]本發(fā)明的技術方案如下:
(O隱甲藻敏感抗生素潮霉素B作用濃度的確定: ①培養(yǎng)基的配制:
在C9N2培養(yǎng)基(葡萄糖9 g，酵母浸粉2 g，海鹽25 g，加水至I L)中對潮霉素B設置濃度梯度，10 mg/L- 50 mg/L ；
②潮霉素B敏感濃度的確定:
隱甲藻在25°C，180 rpm條件下振蕩培養(yǎng)48 h，取50 μ I細胞懸浮液均勻涂布在5個梯度平板上，25°C倒置培養(yǎng)2周(無抗平板培養(yǎng)作為陽性對照)，最終確定隱甲藻對潮霉素B的敏感濃度為40 mg/L ;
(2)基因轉化體系的建立:
①隱甲藻感受態(tài)細胞的制備:
取隱甲藻懸浮培養(yǎng)48h的細胞10 mL, 4°C, 3500 rpm離心5 min，棄上清，加入I mL 25mM DTT溶液，30°C水浴15 min，離心5 min，棄上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗細胞三次，I mL山梨糖醇重懸細胞備用；
②焚光標記大分子FITC-Dextran(70 kDa)的轉化:
FITC-Dextran (70 kDa)是一種熒光標記的大分子物質(zhì)，在進入細胞內(nèi)部之后能夠自發(fā)綠色熒光使細胞帶有綠色熒光標記。因此，為了驗證隱甲藻感受態(tài)細胞的轉化效率和確定最佳的電擊條件，選擇焚光標記的大分子聚合物FITC-Dextran (70 kDa)作為轉化的分子。在無菌條件下取200 μ I隱甲藻感受態(tài)細胞至于2 μπ?電極杯中，加入I μ I鮭魚精DNA和2 μ g FITC-Dextran混勾，冰浴5 min，其中不加入FITC-Dextran的作為陰性對照，加入FITC-Dextran但不電擊的作為陽性對照，設置電壓1.4 kV，1.6 kV，1.8 kV，2.0 kV，
2.2 kV和2.4 kV，電阻200 Ω，電容25和50 μ F進行電擊轉化，電擊結束之后在冰上冰浴5 min，用2 mL C9N2培養(yǎng)基重懸細胞并加入胰蛋白酶37°C培養(yǎng)30 min，熒光顯微鏡鏡檢細胞，觀察是否有發(fā)綠色熒光的細胞，熒光分光光度計測定轉化之后細胞懸浮液的熒光值。通過比較細胞懸浮液之間熒光值的差異最終確定電擊轉化條件為電壓2.0 kV，電阻200 Ω，電容25 μ F ；
(3)外源基因片段的準備:
①隱甲藻18S基因上游片段的擴增:
取隱甲藻基因組溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP 0.4 μ I,10 μΜ上游引物I μ1、10 μΜ下游引物I μ?，Phus1n酶0.2 μ?，無菌水12.4 μ I,在PCR管中混勻；將PCR管放入PCR儀中進行擴增循環(huán)，擴增程序為:98°C 30 s ;98°C 10s，55°C 30 s’72V 30 s，共30個循環(huán)，4°C 5 min，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得隱甲藻18S的上游片段；
②隱甲藻18S基因下游片段的擴增:
取隱甲藻基因組溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP 0.4 μ I,10 μΜ 上游引物 I μ1、10 μΜ 下游 I μ I，Phus1n 酶 0.2 μ?，無菌水 12.4 μ?，在 PCR管中混勻；將PCR管放入PCR儀中進行擴增循環(huán)，擴增程序為:98°C 30 s ；98°C 10 s，55°C30 s，72°C 30 s，共30個循環(huán)，4°C 5 min，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得隱甲藻18S的下游片段；
③潮霉素抗性基因(如?)的擴增
取 PCAMBIA1301 植物表達載體溶液 10 ng, 5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的dNTP 0.4 μ 1,10 μΜ 上游引物 I μ1、10 μΜ 下游 I μ 1，Phus1n酶0.2 μ?，無菌水 12.4μ 1，在PCR管中混勻；將PCR管放入PCR儀中進行擴增循環(huán)，擴增程序為:98°C 30 s ；98°C10 s，55°C 30 s’72V 40 s，共30個循環(huán)，4°C 5 min，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得潮霉素抗性基因片段；
④用于同源雙交換整合的基因片段的構建:
取擴增后的隱甲藻18s上游片段、18s下游片段、以及Hpt片段各10 ng為模板，5XPhus1n HF buffer 4 μ 1,10 μΜ 的 dNTP0.4 μ 1，Phus1n 酶 0.2 μ 1，無菌水 10.4μ?，以10 μΜ上游引物I μ1、10 μΜ下游引物I μ 1，在PCR管中混勾，將PCR管放入PCR儀中進行擴增循環(huán)，擴增程序為:98°C 30 s ；98°C 10 s，60°C 90 s，72°C 30 s，共30個循環(huán)，4°C 5 min。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得目的片段(上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段融合PCR產(chǎn)物)；
(4)外源目的基因片段對隱甲藻的轉化；
①隱甲藻感受態(tài)細胞的制備:
取隱甲藻懸浮培養(yǎng)48 h的細胞10 mL, 4°C, 3500 rpm離心5 min，棄上清，加入I mL25 mM DTT溶液，30°C水浴15 min，離心5 min，棄上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗細胞三次，I mL山梨糖醇重懸細胞備用；
2外源目的基因片段的轉化:
在無菌條件下取200 μ I隱甲藻感受態(tài)細胞至于2 μπ?電極杯中，加入I μ I鮭魚精DNA和2 μ g目的片段混勻，冰浴5 min,電擊轉化條件為2.0 kV，電阻200 Ω，電容25μ F，電擊之后冰浴5 min,加入2 mL新鮮C9N2培養(yǎng)基25°C，180 rpm震蕩復蘇48 h，取50μ I細胞懸浮液均勻圖涂布在含有40 mg/L潮霉素B的C9N2固體平板上，倒置培養(yǎng)2周，將平板上長出的單克隆細胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上劃線，進行轉化子的復篩，待長出單克隆細胞，轉接液體培養(yǎng)。通過基因組PCR對轉化子進一步驗證。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明通過抗生素耐性實驗，鑒定出一種隱甲藻敏感的抗生素潮霉素B，采用潮霉素B作為篩選標記建立了有效的隱甲藻轉化體系，這對開展針對隱甲藻的基因工程改造，進而提高DHA產(chǎn)率有著現(xiàn)實的應用價值。
[0009]
【附圖說明】
[0010]圖1為隱甲藻在不同潮霉素濃度下的生長。
[0011]圖2為電擊轉化FITC-Dextran熒光顯微鏡檢測轉化細胞的圖。(左邊為明視野下的隱甲藻細胞，右邊為該細胞在暗視野下發(fā)熒光)。
[0012]圖3為抗潮霉素B的突變株和野生株在潮霉素B抗性平板上生長狀況的對照圖(其中，5#是第一輪初篩得到的轉化子，WT為野生型隱)。
[0013]圖4為轉化后的突變株的PCR鑒定圖(其中，M是DNA Maeker III ;分別用野生型(1、
2泳道)和5#突變株(3、4泳道)的基因組模板做PCR ；18s用作PCR陽性對照)。
[0014]
【具體實施方式】
[0015]下面的實施例是為了本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明但不用于限制本發(fā)明。
[0016]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0017]實施例1
一種對隱甲藻ATCC 30556進行基因轉化的方法，包括下述步驟:
(O隱甲藻ATCC 30556敏感抗生素潮霉素B作用濃度的確定:
隱甲藻ATCC 30556敏感抗生素潮霉素B作用濃度的確定是通過抗生素濃度梯度實現(xiàn)的；
步驟為:在C9N2培養(yǎng)基中對潮霉素B設置濃度梯度，10 mg/L- 50 mg/L。隱甲藻在25°C, 180 rpm條件下振蕩培養(yǎng)48 h，取50 μ I細胞懸浮液均勻涂布在5個梯度平板上，25°C倒置培養(yǎng)2周(無抗平板培養(yǎng)作為陽性對照)；最終確定隱甲藻ATCC 30556對潮霉素B敏感濃度為40 mg/L ο
[0018](2)隱甲藻ATCC 30556感受態(tài)細胞的制備及熒光標記大分子FITC-Dextran (70kDa)的轉化:
隱甲藻ATCC 30556感受態(tài)細胞的制備是通過DTT溶液預處理細胞，使細胞的細胞壁變薄，通過高滲透壓的山梨糖醇溶液的反復洗滌去掉細胞懸浮液中混有的其他離子，保證電擊的效率；
步驟為:取隱甲藻ATCC 30556懸浮培養(yǎng)48 h的細胞10 mL, 4°C, 3500 rpm離心5 min,棄上清，加入I mL 25 mM DTT溶液，30°C水浴15 min，離心5 min，棄上清，10 mL I M山梨糖醇(sorbitol)清洗細胞三次，I mL山梨糖醇重懸細胞備用；
在無菌條件下取200 μ I隱甲藻ATCC 30556感受態(tài)細胞至于2 μπ?電極杯中，加入Iμ I娃魚精DNA和2 μ g FITC-Dextran混勾，冰浴5 min，其中不加入FITC-Dextran的作為陰性對照，加入FITC-Dextran但不電擊的作為陽性對照，設置電壓1.4 kV，電阻200 Ω，電容25 μ F進行電擊轉化，電擊結束之后在冰上冰浴5 min，用2 mL C9N2培養(yǎng)基重懸細胞并加入胰蛋白酶37°C培養(yǎng)30 min，熒光顯微鏡鏡檢細胞，觀察是否有發(fā)綠色熒光的細胞，熒光分光光度計測定