專利名稱：大規(guī)模生產(chǎn)蟲草菌和靈芝菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌特別是蟲草菌和/或靈芝菌、菌絲體、孢子和糊狀物的大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于大規(guī)模生產(chǎn)所述真菌的設(shè)備和生長(zhǎng)參數(shù)，也涉及培養(yǎng)基，以及生產(chǎn)真菌的方法。本發(fā)明也涉及提取蟲草菌和靈芝菌的活性成分的方法。本發(fā)明也涉及制備含有依據(jù)本發(fā)明的真菌和/或真菌糊狀物的飲料和食品。特別地，提供了含有牛奶和所述真菌和/或真菌糊狀物的乳產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
蟲草菌，真菌的一科，例如(冬蟲夏草)cordyceps Sinensis(中國(guó)稱為冬蟲夏草)，在傳統(tǒng)中藥中(TCM)被認(rèn)為是一種高級(jí)的中草藥，被認(rèn)為可用于增強(qiáng)免疫、降痰、補(bǔ)肺、強(qiáng)腎以及增強(qiáng)性能力。蟲草菌菌株生長(zhǎng)在毛蟲或昆蟲幼體宿主的體內(nèi)，蟲體由于蟲草菌的菌絲在體內(nèi)糾結(jié)而變枯干。最后，一個(gè)大的，有時(shí)長(zhǎng)度為10-15厘米的棒狀基質(zhì)從枯干的宿主長(zhǎng)出來(lái)，并且在其上面的部分產(chǎn)生一個(gè)被侵入的子囊殼。
Ganoderma lucidum(中國(guó)稱為紅靈芝)，是真菌的另一科，在TCM中也被認(rèn)為是高級(jí)草藥。被認(rèn)為能夠防癌、降低膽固醇和用于治療心臟和肺的疾病。靈芝覃的子實(shí)體和孢子在TCM處方中是主要的形式。被使用的靈芝的其它菌株包括Ganoderma japonicum(紫靈芝)和Ganoderma tsugae松杉靈芝，兩者被認(rèn)為與紅靈芝有不同的治療效果。
野生的蟲草菌和靈芝菌可能有高濃度的重金屬，而且也可以帶有微生物的污物。因此，難于確保這種野生栽培的質(zhì)量。工業(yè)化生產(chǎn)的蟲草菌和靈芝菌，其質(zhì)量可以通過(guò)純菌株的分離和篩選以及通過(guò)加入到菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的底物的選擇和數(shù)量來(lái)控制，迄今為止，主要局限于不適于大規(guī)模生產(chǎn)的瓊脂培養(yǎng)或搖瓶培養(yǎng)。雖然搖瓶培養(yǎng)可以使真菌容易生長(zhǎng)，但按比例放大生產(chǎn)，例如利用生物反應(yīng)器，需要嚴(yán)格地控制參數(shù)如溶氧、攪拌方式和強(qiáng)度、溫度、生長(zhǎng)物質(zhì)的量如碳源和氮源等等，而且這些參數(shù)的最佳范圍不容易測(cè)定。結(jié)果顯示靜止/搖瓶液體培養(yǎng)僅有1％的收率(這里生物量產(chǎn)量是經(jīng)過(guò)45到72小時(shí)周期后以每100ml的發(fā)酵培養(yǎng)基或液體的干菌絲來(lái)定義的)。靜止/搖瓶培養(yǎng)的合理的培養(yǎng)周期至少是深層發(fā)酵系統(tǒng)的兩倍長(zhǎng)。一些菌株，例如C.Gracilis、大團(tuán)囊蟲草、蛹蟲草甚至不適于在靜止/搖瓶中液態(tài)培養(yǎng)。此外，靈芝菌細(xì)胞在深層發(fā)酵系統(tǒng)中傾向于成球，特別是用US5,334,704中介紹的馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基，導(dǎo)致了菌絲的生長(zhǎng)受到影響。
除了靈芝菌的子實(shí)體外，靈芝菌和蟲草菌的孢子在TCM中會(huì)非常有價(jià)值。不幸的是，雖然靈芝菌和蟲草菌在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中能被培養(yǎng)到一定程度，但還從來(lái)沒(méi)有成功地被培養(yǎng)到產(chǎn)生擔(dān)子孢子。所以迄今為止大規(guī)模生產(chǎn)孢子還沒(méi)有成功。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一方面大體上提供一種用于大規(guī)模生產(chǎn)蟲草菌和/或靈芝菌的設(shè)備，優(yōu)選包含生物反應(yīng)器。特別地，如果被用于培養(yǎng)蟲草菌，它可以產(chǎn)生至少5％的收率，如果被用于培養(yǎng)靈芝菌，它可以產(chǎn)生至少3％的收率。
另一方面，本發(fā)明提供一種用于多階段的液態(tài)發(fā)酵的方法，使得蟲草菌至少5％的收率或靈芝菌至少3％的收率。
另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)靈芝菌和/或蟲草菌孢子的方法。特別地，該方法包括在生長(zhǎng)周期中應(yīng)用壓力為2巴和更高來(lái)培養(yǎng)靈芝菌和/或蟲草菌的步驟。
另一方面，本方面提供一種用于培養(yǎng)靈芝菌和/或蟲草菌的新培養(yǎng)基。
另一方面，本方面提供一種用于培養(yǎng)具有硝酸鈉和/或核黃素(維生素B2)的靈芝菌和/或蟲草菌的培養(yǎng)基。特別地，本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)由硝酸鈉和/或核黃素(維生素B2)增強(qiáng)的蛹蟲草或赤芝的培養(yǎng)基。
另一方面，本發(fā)明提供一種包括熱水提取靈芝菌和/或蟲草菌活性成分在內(nèi)的方法。
另一方面，本發(fā)明提供利用靈芝菌孢子(例如赤芝孢子)、蟲草菌孢子、靈芝菌菌絲體和/或蟲草菌菌絲體和依據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
而提供的流程或系統(tǒng)產(chǎn)生的靈芝菌糊狀物和/或蟲草菌糊狀物作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品。
另一方面，本發(fā)明提供單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌。本發(fā)明進(jìn)一步提供基本上單細(xì)胞形式的靈芝菌和/或蟲草菌培養(yǎng)物。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含100％的單細(xì)胞培養(yǎng)的靈芝菌和/或蟲草菌培養(yǎng)物。
另一方面，本發(fā)明提供包含依據(jù)本發(fā)明在培養(yǎng)基中制備的任何靈芝菌和/或蟲草菌的菌絲體、孢子或糊狀物的飲料和食物。特別地，本發(fā)明提供采用在本發(fā)明的培養(yǎng)基中生產(chǎn)的至少一種靈芝菌菌絲體、蟲草菌菌絲體、靈芝菌孢子、蟲草菌孢子、靈芝菌糊狀物和蟲草菌糊狀物來(lái)強(qiáng)化的牛奶。
另一方面，本發(fā)明提供了含有至少一種在本發(fā)明培養(yǎng)基中生產(chǎn)的靈芝菌菌絲體、蟲草菌菌絲體、靈芝菌孢子、蟲草菌孢子、靈芝菌糊狀物和蟲草菌糊狀物的藥物組合物。
本發(fā)明也提供了由本發(fā)明培養(yǎng)基中生產(chǎn)的靈芝菌菌絲體、蟲草菌菌絲體、靈芝菌孢子、蟲草菌孢子、靈芝菌糊狀物和蟲草菌糊狀物的用途，其可用于制造有治療用途的藥物組合物、飲料(例如牛奶)和/或食物(例如營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品)。治療的用途包括，但不局限于此，治療腫瘤、巨噬細(xì)胞活性的刺激、或免疫系統(tǒng)的刺激、腎和呼吸功能的刺激、增強(qiáng)身體的循環(huán)的作用等等。因此，本發(fā)明也提供一種用于治療處理的方法，特別地(但不局限于此)用于治療腫瘤、巨噬細(xì)胞活性的刺激、或免疫系統(tǒng)的刺激、腎和呼吸功能的刺激、增強(qiáng)身體的循環(huán)的作用，以及其它給病人用藥的方法至少由本發(fā)明培養(yǎng)基中生產(chǎn)的靈芝菌菌絲體、蟲草菌菌絲體、靈芝菌孢子、蟲草菌孢子、靈芝菌糊狀物和/或蟲草菌糊狀物，或一種藥物組合物、飲料(例如牛奶)和/或(例如，營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品)包含至少由本發(fā)明培養(yǎng)基中生產(chǎn)的靈芝菌菌絲體、蟲草菌菌絲體、靈芝菌孢子、蟲草菌孢子、靈芝菌糊狀物和/或蟲草菌糊狀物。
本發(fā)明涉及一種用于大規(guī)模生產(chǎn)真菌的設(shè)備，包含
一種生物反應(yīng)器；和一種液體培養(yǎng)基，包括具有至少一種碳源的水和至少500升的體積且pH至少是pH5；和用于攪拌液體培養(yǎng)基的工具；和用于保持液體培養(yǎng)基溫度至少在17℃的工具；和以至少1∶0.5v/v/m的比率向液體培養(yǎng)基通氣的工具；和消泡劑。
本發(fā)明還涉及一種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌的多階段方法提供真菌來(lái)源；將真菌接種到第一階段的液體培養(yǎng)基中；攪動(dòng)第一階段的液體培養(yǎng)基，讓真菌生長(zhǎng)一段時(shí)間；將第一階段的培養(yǎng)物接種到第二階段的液體培養(yǎng)基中；攪動(dòng)第二階段的液體培養(yǎng)基，讓培養(yǎng)物生長(zhǎng)一段時(shí)間；將第二階段的培養(yǎng)物接種到容納在生物反應(yīng)器中至少500升的液體培養(yǎng)基中；攪動(dòng)第三階段的液體培養(yǎng)基，讓培養(yǎng)物生長(zhǎng)一段時(shí)間；保持每個(gè)階段液體培養(yǎng)基的pH值至少大約是pH5；添加至少一種碳源到每個(gè)階段的液體培養(yǎng)基中。
本發(fā)明還涉及一種培養(yǎng)蛹蟲草的方法，包含使蛹蟲草在含有硝酸鈉的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
本發(fā)明還涉及一種培養(yǎng)蛹蟲草的方法，包含使蛹蟲草在含有核黃素(維生素B2)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
本發(fā)明還涉及一種用于培養(yǎng)蟲草菌或靈芝菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，包含葡萄糖；和麥芽糖；和水。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)靈芝菌和/或蟲草菌孢子的方法，包含使用至少2巴的壓力來(lái)培養(yǎng)靈芝菌和/或蟲草菌。
本發(fā)明還涉及一種提取蟲草菌成分的方法，包含；在溫度高于90℃的熱水中浸泡蟲草菌菌絲體至少12小時(shí)以獲得混合物；
過(guò)濾混合物分成濾液部分和殘?jiān)糠?；用溶劑混合濾液以獲得水溶性榨取物的沉淀；用溶劑混合殘?jiān)⑤p輕攪動(dòng)；除去溶劑以獲得可溶于溶劑的榨取物。
本發(fā)明還涉及包含至少下述成分的蟲草菌總蛋白質(zhì)27-28％、總水溶性多糖至少20％、蟲草酸至少5％、蟲草菌絲至少0.1％和腺苷至少0.15％。
本發(fā)明還涉及包含至少下述成分的靈芝菌，總蛋白質(zhì)28-30％，和總水溶性多糖至少15％。
一種根據(jù)上述方法制備的蟲草菌和/或靈芝菌糊狀物。
一種單細(xì)胞的蟲草菌和/或靈芝菌。
一種單細(xì)胞培養(yǎng)物包含基本上單細(xì)胞菌株的蟲草菌和/或靈芝菌。
本發(fā)明還涉及一種飲料和/或食品，包含至少下述一種物質(zhì)如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述的靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、如上所述的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物、如上所述的單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌以及如上所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明還涉及一種強(qiáng)化牛奶產(chǎn)品，包含使牛奶與下述至少一種物質(zhì)混合如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述的靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、如上所述的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物、如上所述的單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌以及如上所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明還涉及一種制備強(qiáng)化牛奶產(chǎn)品的方法，包含使牛奶與下述至少一種物質(zhì)混合如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、如上所述的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物、如上所述的單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌以及如上所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明還涉及一種藥用組合物，包含至少下述一種物質(zhì)如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、如上所述的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物、如上所述的單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌以及如上所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明還涉及下述至少一種物質(zhì)的用途如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述的靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、如上所述的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物，用于制造藥物組合物，這種藥物組合物至少可用于治療腫瘤、巨噬細(xì)胞的活性刺激、系統(tǒng)刺激、腎和呼吸功能的刺激和增強(qiáng)身體循環(huán)功能。
本發(fā)明還涉及一種腫瘤治療、巨噬細(xì)胞活性刺激、和/或免疫反應(yīng)刺激的方法，包含給予受體所需的下述至少一種物質(zhì)如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述的蟲草菌、如上所述的靈芝菌、如上所述的靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物、以及如上所述的單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌、以及如上所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物、如上所述的食品或飲料、如上所述的強(qiáng)化牛奶、如上所述的藥物組合物。
附圖簡(jiǎn)述為便于敘述，現(xiàn)參考下列附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選特征，其中


圖1是顯示菌絲體干重的收率對(duì)不同成分濃度的圖表。試驗(yàn)是用搖瓶發(fā)酵進(jìn)行的。
圖2是顯示麥芽糖糖漿對(duì)蟲草菌收率影響的圖表。試驗(yàn)是在75升生物反應(yīng)器中通過(guò)深層發(fā)酵進(jìn)行的。添加的無(wú)機(jī)物是1.5g/l的KH2PO4和0.3g/l的MgSO47H2O。
圖3是顯示通氣率對(duì)蟲草菌收率影響的圖表。試驗(yàn)是在75升生物反應(yīng)器中深層發(fā)酵進(jìn)行的。
圖4是顯示攪拌速率對(duì)蟲草菌收率影響的柱形圖。試驗(yàn)是在75升生物反應(yīng)器中深層發(fā)酵進(jìn)行的。
圖5顯示通過(guò)液體培養(yǎng)生產(chǎn)的靈芝菌孢子的顯微鏡觀測(cè)。
圖6顯示通過(guò)SDS-PAGE在赤芝和冬蟲夏草活性成分中發(fā)現(xiàn)的蛋白、糖蛋白和多糖的剖面圖。
圖7顯示通過(guò)蛋白質(zhì)印跡在赤芝冬蟲夏草活性成分中發(fā)現(xiàn)的蛋白、糖蛋白和多糖的剖面圖。
圖8顯示根據(jù)本發(fā)明得到的冬蟲夏草的菌絲和孢子的顯微鏡觀測(cè)。
圖9顯示根據(jù)本發(fā)明得到的冬蟲夏草的菌絲和孢子的顯微鏡觀測(cè)。
圖10涉及隨著溫度的升高，蛹蟲草在含有YM培養(yǎng)基(參見(jiàn)表2)的瓊脂斜面/平板上的生長(zhǎng)。圖片左邊的斜面/平板涉及生長(zhǎng)溫度為20℃，中間的斜面/平板涉及的溫度為25℃，以及右邊的斜面/平板涉及的溫度為29℃。
圖11是依據(jù)本發(fā)明的強(qiáng)化牛奶制備的一般方法的概要。
具體實(shí)施例方式
在現(xiàn)有技術(shù)中，蟲草菌或靈芝菌的液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)限于采用靜止或搖動(dòng)培養(yǎng)，例如在搖動(dòng)器上的厄倫美厄燒瓶或其相似物等等。利用搖瓶培養(yǎng)的一般的多階段液體發(fā)酵方法已經(jīng)被US5,334,704公開(kāi)。但是，在理論和實(shí)踐上，本發(fā)明大規(guī)模生物反應(yīng)器生產(chǎn)和現(xiàn)有技術(shù)靜止/搖動(dòng)液體長(zhǎng)操作臺(tái)面培養(yǎng)基本原理的差異，意味著現(xiàn)有技術(shù)不能通過(guò)直接放大搖動(dòng)培養(yǎng)用來(lái)成功地大量生產(chǎn)真菌。無(wú)論利用多少階段，利用長(zhǎng)操作臺(tái)面發(fā)酵培養(yǎng)方法都不能實(shí)現(xiàn)所述真菌的大量生產(chǎn)。由于玻璃儀器的設(shè)計(jì)和長(zhǎng)操作臺(tái)面裝置的攪拌方式比較簡(jiǎn)單，不能優(yōu)化諸如通風(fēng)、攪拌和混合效果等參數(shù)，蟲草菌的一些株系比如C.Gracilis、大團(tuán)囊蟲草、蛹蟲草，不適宜在靜止/搖動(dòng)的液態(tài)培養(yǎng)中生長(zhǎng)。
在搖瓶培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)增加了液體培養(yǎng)基的粘度因而妨礙了最佳的通氣。這是阻止蟲草菌大量生長(zhǎng)的一個(gè)因素。
本發(fā)明提供了用于深層需氧發(fā)酵/培養(yǎng)蟲草菌和靈芝菌生長(zhǎng)的設(shè)備、生長(zhǎng)培養(yǎng)基和方法。本發(fā)明具體實(shí)施方式
提供的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和方法可以消除，或至少大體上降低重金屬污染物和不需要的微生物的水平(表8和表9與表7相比較)。所選擇的純菌株可用于生產(chǎn)，并且小心控制生物技術(shù)參數(shù)，從而可確保產(chǎn)物質(zhì)量的可靠性和一致性。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種設(shè)備，包括用于大規(guī)模生產(chǎn)的生物反應(yīng)容器，該容器中含有攪拌工具以連續(xù)和有規(guī)律地?cái)嚢枧囵B(yǎng)基。這樣就提高了通氣比率和效率以及不斷地將氧傳遞到活細(xì)胞中，而且能防止細(xì)胞成塊或沉到容器的底部。其結(jié)果，依據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的靈芝菌和/或蟲草菌大體上是單細(xì)胞形式。相反地，現(xiàn)有技術(shù)的靈芝菌和蟲草菌是多細(xì)胞形式。多細(xì)胞培養(yǎng)與有性生殖和/或細(xì)胞分化有關(guān)。就像人類，始于受精卵，并且生長(zhǎng)是通過(guò)細(xì)胞的分化發(fā)展成許多不同的細(xì)胞系，最終形成包含多器官的個(gè)體，換句話說(shuō)就是“多細(xì)胞培養(yǎng)”。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了靈芝菌和/或蟲草菌的單細(xì)胞。表示靈芝菌和/或蟲草菌單細(xì)胞特性的定性分析可見(jiàn)圖9和
圖10，它們顯示細(xì)胞學(xué)的形態(tài)數(shù)據(jù)。本發(fā)明進(jìn)一步提供靈芝菌和/或蟲草菌大體上單細(xì)胞形式的培養(yǎng)物。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含100％的靈芝菌和/或蟲草菌單細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)物。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供一種用于大規(guī)模生產(chǎn)真菌的設(shè)備，包括一種生物反應(yīng)器；和一種液體培養(yǎng)基，包括至少含有一種碳源的水且體積至少500升以及pH至少是5；和用于液體培養(yǎng)基的攪拌工具；和用于使液體培養(yǎng)基溫度穩(wěn)定在至少17℃的工具；和以至少1∶0.5v/v/m的比率向液體培養(yǎng)基通氣的工具；和消泡劑。
舉例來(lái)說(shuō)，攪拌工具就是攪拌器。攪拌的速度至少100rpm。包括含有至少一種碳源的水在內(nèi)的液體培養(yǎng)基可以是依照本發(fā)明具體實(shí)施方式
所描述的任何一種培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包含酵母提取物，特別是酵母提取物的濃度至少為15g/l。液體培養(yǎng)基可進(jìn)一步含有蛋白胨源，比如含有的濃度至少為15g/l。液體培養(yǎng)可以含有葡萄糖作為一種碳源，例如葡萄糖的濃度至少為30g/l。液體培養(yǎng)基也可以含有麥芽糖作為一種碳源，例如麥芽糖的濃度至少為30g/l。液體培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有至少一種無(wú)機(jī)源，例如硫酸鎂。特別地，硫酸鎂的濃度至少為0.05g/l。液體培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有一價(jià)的磷酸鉀鹽作為無(wú)機(jī)源，例如作為無(wú)機(jī)源的一價(jià)磷酸鉀鹽的濃度至少為0.05g/l。液體培養(yǎng)基可以含有至少0.5g/l的硝酸鈉。設(shè)備中液體培養(yǎng)基的溫度優(yōu)選保持在至少17℃。
利用本發(fā)明的設(shè)備大規(guī)模生產(chǎn)的真菌可以是蟲草菌和/或靈芝菌。但是，任何其它的專業(yè)人員已知的和適用于本發(fā)明目的的真菌也可以被生產(chǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，真菌可以是蛹蟲草、冬蟲夏草、Cordyceps gracilis，Cordyceps memorabilis，大團(tuán)囊蟲草、Cordyceps sphecocephala，Cordyceps hawkesii，Cordyceps martialis，小蟬草、Cordyceps capitata，紫芝、松杉靈芝和/或赤芝、Ganoderma anularis，樹(shù)舌靈芝、Ganodermaboniense，Ganoderma fornicatus，Ganoderma tenne，Ganodermatropicum。
本發(fā)明也提供使用本發(fā)明的培養(yǎng)基，通過(guò)依據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和/或方法得到或可得到的蟲草菌和/或靈芝菌。本發(fā)明進(jìn)一步提供使用本發(fā)明的培養(yǎng)基，依據(jù)本發(fā)明的設(shè)備和/或方法得到或可得到的蟲草菌和/或靈芝菌的糊狀物。本發(fā)明也提供分別具有如表8和表9所示成分和特性的蟲草菌和靈芝菌。
一般真菌生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基含有葡萄糖和/或馬鈴薯右旋糖、麥芽提取物和肉蛋白胨。這種標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基產(chǎn)生的蟲草菌或靈芝菌量不足，特別是在搖瓶培養(yǎng)中使用時(shí)。使用標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基且沒(méi)有調(diào)整好參數(shù)諸如攪拌、通氣、pH、溫度和發(fā)酵周期，就難以將蟲草菌或靈芝菌的生產(chǎn)按比例放大到“大規(guī)?！钡乃?這里“大規(guī)模”水平一般意味著使用400升或更多升的生長(zhǎng)培養(yǎng)基)。
本發(fā)明提供不同于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，它可以有效地提高真菌的產(chǎn)量，特別是在物理參數(shù)被最優(yōu)化的生物反應(yīng)器中。培養(yǎng)基特別適于深層培養(yǎng)，提供至少3％靈芝菌產(chǎn)量和至少5％的蟲草菌收率，優(yōu)選使用已經(jīng)計(jì)劃好的生產(chǎn)設(shè)備，但不限于此。物理參數(shù)包括通氣、攪拌速度、壓力、消泡劑的量、生長(zhǎng)基質(zhì)的選擇和分量等等。已知在生物反應(yīng)器中合適的通氣率和攪拌率可以提高菌絲的生長(zhǎng)(見(jiàn)圖3和圖4)。已發(fā)現(xiàn)溫度和pH的影響不是很厲害，只要在最佳的范圍內(nèi)，例如pH4.5到7，和優(yōu)選是pH5.5。發(fā)酵容器中可用高于大氣壓0.5-1.0巴的正壓，以防止培養(yǎng)污染。消泡的控制也可以作為抑止泡沫的方法被使用。本發(fā)明發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵時(shí)間一般是48-72小時(shí)，但不是必須的。實(shí)際的發(fā)酵周期可以從40延續(xù)到90小時(shí)或更長(zhǎng)。相對(duì)的，靜止/搖動(dòng)液體培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)間一般是15-30天。
因此，本發(fā)明提供一種生物反應(yīng)器和多步過(guò)程用于生產(chǎn)真菌，包括至少一種用于培養(yǎng)真菌例如蟲草菌和/或靈芝菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；生長(zhǎng)培養(yǎng)基至少包含葡萄糖、麥芽糖和水。生長(zhǎng)培養(yǎng)基也可以進(jìn)一步包含酵母提取物和/或維生素。可以使用含有維生素的酵母提取物。生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以含有的酵母提取物大體上濃度至少為15g/l，特別是15-30g/l，更特別是20g/l。生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有濃度至少為30g/l，特別是30-50g/l，更特別是40g/l的葡萄糖。生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有濃度至少為30，特別是30-60g/l，更特別是40g/l的麥芽糖。無(wú)機(jī)物可以是例如硫酸鈉、一元磷酸鈉、二元磷酸鈉、磷酸二氫鉀和/或硫酸鎂。特別地，生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有的無(wú)機(jī)物總濃度至少為0.5，特別是至少為1.0g/l。磷酸鎂的濃度可以是至少0.05g/l，特別是0.05-1.0g/l，更特別是0.3g/l。磷酸二氫鉀的濃度可以是至少0.5g/l，特別是0.05-2.0g/l，更特別是1.5g/l。硝酸鈉的濃度可以是至少0.5g/l，特別是0.5-3g/l，更特別是2g/l。特別地，依據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是如表1、表3和/或表6所示的培養(yǎng)基。
使用本發(fā)明具體實(shí)施方式
的系統(tǒng)，蟲草菌的收率一般平均值是大約5％，與使用靜止/搖動(dòng)液體培養(yǎng)的平均值1％相比較，收率提高了大約400％。相應(yīng)地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在許多其它的成分中，生物活性成分比如水溶的多糖和蟲草菌素(3’-脫氧腺苷，其是一種核酸類似物)的收率被提高。
靈芝菌易受生長(zhǎng)抑止的影響，因?yàn)樗谝后w生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如US5,334,704中介紹的馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基)中易于成球，結(jié)果影響了菌絲生長(zhǎng)。相比于靜止/搖動(dòng)液體培養(yǎng)的靈芝菌的0.5％的收率，新培養(yǎng)基的收率達(dá)到3％的平均數(shù)，也就是提高500％。表1顯示了利用新培養(yǎng)基蟲草菌產(chǎn)量的大體改善。表中所示的新培養(yǎng)基適于培養(yǎng)蟲草菌和靈芝菌。
通過(guò)本發(fā)明具體實(shí)施方式
提供的方法是生產(chǎn)蟲草菌和/靈芝菌的多階段發(fā)酵法。典型地，所需真菌的純菌株被分離(購(gòu)買或以某種方式獲得的，生長(zhǎng)并保存在斜面或平板瓊脂上)。隨后斜面培養(yǎng)物可被用來(lái)接種到第一階段的使用搖瓶培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基上。在適當(dāng)條件下燒瓶中真菌繁殖，使其濃度高到足以接種到第二階段發(fā)酵，該階段包括在較大容器中使用液體培養(yǎng)基。第二階段中，真菌在適當(dāng)條件下繼續(xù)生長(zhǎng)到濃度高到足以接種到第三階段發(fā)酵。在本發(fā)明具體實(shí)施方式
中，描述了三階段發(fā)酵的方法，但是發(fā)酵使用更多階段也是可能的。
具體實(shí)施例方式
也提供了蟲草菌和靈芝菌在大規(guī)模生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)的特殊條件，而且這些都在下面給出的本發(fā)明具體實(shí)施方式
的實(shí)例中被描述。
依據(jù)
具體實(shí)施例方式
，第一階段使用的培養(yǎng)基，也就是搖瓶階段，包含葡萄糖濃度范圍從30-50g/l或更多，優(yōu)選是大約40g/l。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在此葡萄糖濃度下，蟲草菌菌絲體的產(chǎn)量最適于搖瓶培養(yǎng)，正如
圖1所示。
依據(jù)
具體實(shí)施例方式
，用于中間和生產(chǎn)階段也就是第二和第三階段的培養(yǎng)基包含麥芽糖，在無(wú)機(jī)物存在下，范圍大約是30到60g/l，特別是40g/l。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如果在合適的無(wú)機(jī)物存在下使用，以麥芽糖40g/l的濃度，菌絲體的收率可以達(dá)到最佳。不添加無(wú)機(jī)物，同樣的收率只有在麥芽糖至少60g/l才能達(dá)到，正如圖2所示。所以，發(fā)酵系統(tǒng)中無(wú)機(jī)物的使用，將不含無(wú)機(jī)物的方法變成了更有生產(chǎn)價(jià)值的方法。實(shí)例中使用的無(wú)機(jī)物是KH2PO4和MgSO4。無(wú)機(jī)物的種類和濃度可以不同，只要它促進(jìn)菌絲體的生長(zhǎng)，例如K2SO4可以用來(lái)替代MgSO4。在這個(gè)具體實(shí)施方式
中，KH2PO4的濃度范圍可以從0.05-2.0g/l，特別是1.5g/l，具體實(shí)施方式
中MgSO4.7H2O的濃度范圍可以從0.05-1.0g/l，特別是0.3g/l。還優(yōu)選的，在用于靈芝菌或蟲草菌生產(chǎn)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中有足夠的維生素，而通常這些維生素在富含維生素的酵母提取物中被發(fā)現(xiàn)。必須注意的是市場(chǎng)上有些牌子的可利用的酵母提取物不含有有效量的維生素，而且對(duì)于以培養(yǎng)靈芝菌或蟲草菌為目的，這些不是優(yōu)選的。15-30g/l的酵母提取物，特別是20g/l，可被添加到培養(yǎng)基中。用于發(fā)酵的第二和第三階段的培養(yǎng)基可進(jìn)一步包含濃度在35到50g/l，特別是40g/l的葡萄糖，作為額外的碳源。
依據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例顯示在表1和表6中。在表1中，優(yōu)選值顯示在括號(hào)中。
對(duì)于蛹蟲草和紫芝生長(zhǎng)，硝酸鈉可被用于替代MgSO4.7H2O和KH2PO4作為無(wú)機(jī)源，濃度范圍在1到3g/l或更高，優(yōu)選是2g/l。見(jiàn)表3。
表1.標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和新培養(yǎng)基的比較

使用不同的試驗(yàn)方法。
因此，本發(fā)明提供一種在液體培養(yǎng)基中多階段培養(yǎng)真菌的方法，包括提供真菌來(lái)源；利用真菌接種到第一階段液體培養(yǎng)基中；攪拌第一階段的液體培養(yǎng)基，讓真菌生長(zhǎng)一段時(shí)間；用第一階段的培養(yǎng)物接種到第二階段的液體培養(yǎng)基中；攪拌第二階段的液體培養(yǎng)基， 讓培養(yǎng)物生長(zhǎng)一段時(shí)間；用第二階段的培養(yǎng)物接種到容納在生物反應(yīng)器中的至少500升的第三階段的液體培養(yǎng)基中；攪拌第三階段的液體培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物生長(zhǎng)一段時(shí)間；保持每個(gè)階段的液體培養(yǎng)基的pH值至少是大約pH5；添加至少一種碳源到每個(gè)階段的液體培養(yǎng)基中。
方法可進(jìn)一步地包含添加葡萄糖、麥芽糖、一元磷酸鉀、硫酸鎂和酵母提取物到第二和第三階段的液體培養(yǎng)基中的步驟。本方法可以進(jìn)一步包含將濃度至少是15g/l的酵母提取物添加到第二或第三階段的液體培養(yǎng)基中。本方法進(jìn)一步包含添加含有維生素的酵母提取物。本方法進(jìn)一步包含添加至少一種類型的無(wú)機(jī)物到第二或第三階段的液體培養(yǎng)基中的步驟。舉例來(lái)說(shuō)，無(wú)機(jī)物可以包含硫酸鎂和/或一元磷酸鉀。特別地，方法包含添加硫酸鎂到第二或第三階段的液體培養(yǎng)基中，濃度至少為0.05g/l。本方法進(jìn)一步包含添加一元磷酸鉀到第二或第三階段的液體培養(yǎng)基中的步驟，以至于濃度至少大約是0.05g/l。
特別地，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含在第一階段液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌至少48小時(shí)；其中，液體培養(yǎng)基的體積至少大約是500ml。
第一階段液體培養(yǎng)基的攪拌步驟可以包含以至少100轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)基容器的步驟，和/或包含以至少1∶0.5v/v/m的比率向第二階段的液體培養(yǎng)基充氣；和在體積至少大約50ml的第二階段的培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌至少40小時(shí)。第二階段液體培養(yǎng)基的攪拌步驟可以包含以至少100轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌第二階段的液體培養(yǎng)基和/或以至少1∶0.5v/v/m的比率向第三階段的液體培養(yǎng)基充氣；而且在體積至少大約500升的第三階段培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌至少48小時(shí)。
本發(fā)明任何具體實(shí)施方式
的方法可以進(jìn)一步包含保持液體培養(yǎng)基溫度至少17℃的步驟。特別地，本發(fā)明的方法中如果真菌是蛹蟲草；方法進(jìn)一步包含保持液體培養(yǎng)基溫度至少是17℃的步驟。實(shí)際上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蛹蟲草不會(huì)在高于25℃的溫度下生長(zhǎng)(見(jiàn)
圖10)。
圖10顯示在YM培養(yǎng)基(見(jiàn)表2)存在的斜面/平板上蛹蟲草在25℃下生長(zhǎng)減慢。在29℃發(fā)現(xiàn)不生長(zhǎng)。
本發(fā)明的方法中，蛹蟲草的培養(yǎng)包含使蛹蟲草在含有硝酸鈉的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的步驟。特別地，培養(yǎng)基中硝酸鈉的濃度至少是0.5％。
本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)基可以包含濃度至少0.01％的核黃素。
依據(jù)更多的方面，本發(fā)明提供由依照本發(fā)明的正在生長(zhǎng)的靈芝菌和/或蟲草菌菌絲體制備的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物并進(jìn)一步包含了收集菌絲體并將其過(guò)濾的步驟。任何已知的適于本發(fā)明糊狀物制備的過(guò)濾器和過(guò)濾系統(tǒng)都可以被使用。例如，利用重力穿過(guò)濾布或利用可調(diào)節(jié)的或被控制的真空過(guò)濾器，比如轉(zhuǎn)桶真空過(guò)濾器。獲得的濕菌絲體被收集(它大致含有10-15％的總固形物，也就是說(shuō)85-90％的水分)，然后洗滌(優(yōu)選兩次)，以去除發(fā)酵培養(yǎng)基的殘?jiān)ｌ`芝菌和/或蟲草菌糊狀物也可以由如實(shí)例中描述的蟲草菌和/或靈芝菌的孢子來(lái)制備。依據(jù)本發(fā)明任何具體實(shí)施方式
制備的靈芝菌和/或蟲草菌糊狀物可以被用于制備“強(qiáng)化”飲料和/或食品。例如，用于制備強(qiáng)化飲品和奶產(chǎn)品。特別地，蟲草菌糊狀物包含成分(在干重的基礎(chǔ)上)總蛋白質(zhì)27-28％；總水溶性多糖至少20％；蟲草酸(甘露糖醇)至少5％；蟲草菌素(3’-脫氧腺苷)至少0.1％；腺苷至少0.15％。糊狀物形式的蟲草菌的產(chǎn)品規(guī)格被顯示在表13中。糊狀物形式的靈芝菌的產(chǎn)品規(guī)格被顯示在表14中。
蟲草菌和靈芝菌種的孢子被分別歸做子囊孢子和擔(dān)子孢子的起源。子囊孢子被游離細(xì)胞結(jié)構(gòu)界限在子囊中，也就是孢子的邊界在細(xì)胞質(zhì)的物質(zhì)中被分開(kāi)而且脫離了與ascal質(zhì)膜的接觸，而擔(dān)子孢子基本上是非常均勻的，也就是說(shuō)，大體上橢圓形的細(xì)胞在尖端的擔(dān)子柄的頂部產(chǎn)生。
大體上，藥用真菌的孢子具有特殊的或獨(dú)特的治療性能，有別于它的子實(shí)體或菌絲體，盡管蟲草菌孢子的藥用性能不被完全了解。孢子區(qū)別于子實(shí)體是因?yàn)殒咦拥幕钚猿煞衷阪咦又斜仍谧訉?shí)體中更濃縮。因此，孢子的功效比子實(shí)體的要高。實(shí)際上，就赤芝的孢子而論，孢子的效果高于或強(qiáng)于子實(shí)體的75倍。
對(duì)于靈芝菌，孢子的商業(yè)產(chǎn)品是以農(nóng)業(yè)技術(shù)為基礎(chǔ)的。例如，靈芝(俗名靈芝)孢子的商業(yè)產(chǎn)品中，“產(chǎn)”在子實(shí)體傘狀形態(tài)上的孢子在成熟時(shí)用農(nóng)業(yè)技術(shù)收集。
至于蟲草菌種，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有可利用的技術(shù)方法來(lái)生產(chǎn)孢子。例如，對(duì)于野生的或農(nóng)田培養(yǎng)的冬蟲夏草(俗名冬蟲夏草或毛蟲真菌)形成的是一種特殊的子實(shí)體，一種基質(zhì)。但是，沒(méi)有科學(xué)的研究或著作曾經(jīng)介紹冬蟲夏草的孢子被“種植”而且可以由此被收集。
本發(fā)明發(fā)展了一種利用液體和深層培養(yǎng)系統(tǒng)商業(yè)生產(chǎn)靈芝菌和/或蟲草菌種的孢子的方法。
正如上面所提到的，靈芝菌孢子的生產(chǎn)依賴于農(nóng)業(yè)過(guò)程產(chǎn)生的子實(shí)體。對(duì)于蟲草菌來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有孢子生產(chǎn)的描述。本發(fā)明第一次提供一種商業(yè)制備蟲草菌孢子的方法。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法，大約1000kg的赤芝干子實(shí)體僅能產(chǎn)出1kg的干孢子，也就是說(shuō)收率大約是0.1％。通過(guò)利用本發(fā)明的方法，30kg的干菌絲可以生產(chǎn)2-3kg的靈芝菌干孢子，蟲草菌也是如此，有大約6-10％的收率。
因此，發(fā)明提供靈芝菌孢子和/或蟲草菌孢子和它們的制備過(guò)程。靈芝菌和/或蟲草菌孢子的藥用特性在后面提及。除了被用作健康補(bǔ)品或藥物之外，孢子也可以被用于食品強(qiáng)化和化妝品的應(yīng)用。例如，依據(jù)本發(fā)明，這樣的孢子用于制備靈芝菌和/或蟲草菌糊狀物和也可以制備強(qiáng)化飲料或食品。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種含有蟲草菌和/或靈芝菌菌絲體和孢子的食品和飲料，以及依據(jù)本發(fā)明任何具體實(shí)施方式
制備的蟲草菌和/或靈芝菌糊狀物。上述的飲料可以是酸乳酪、液體酸乳酪、果汁、牛奶、豆奶、酒精(酒精飲品)、咖啡、紅茶、綠茶、烏龍茶、運(yùn)動(dòng)飲品等等。上述食品可以是烘烤的甜品如餅干、面包、蛋糕、米餅等等；冷甜品如布丁、果凍、冰淇淋等等；糖果如口香糖、糖塊等等；點(diǎn)心如餅干、薄餅等等；面條等等；由魚或肉(魚餅)制成的醬肉食品、火腿和魚腸等等；調(diào)味品比如味噌、醬油、敷料、蛋黃醬和甜味劑等等；和各種菜肴如豆腐、魔芋、中國(guó)餃子、花卷、沙拉、湯、燉菜等等。飲料和食品可以依照已知的和標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將至少一種蟲草菌和/或靈芝菌菌絲體和孢子，或依據(jù)本發(fā)明任何具體實(shí)施方式
法制備的蟲草菌和/或靈芝菌糊狀物與合適的食物和/或飲料的配料混合一起制備而得。
特別地，本發(fā)明提供一種“強(qiáng)化”牛奶，包括將奶，例如任何一種液態(tài)牛奶，比如全奶、脫脂奶、配方奶等等，與至少一種在本發(fā)明培養(yǎng)基中生產(chǎn)的靈芝菌菌絲體、蟲草菌菌絲體、靈芝菌孢子、蟲草菌孢子、靈芝菌糊狀物和蟲草菌糊狀物混合。更特別地，這種由奶和本發(fā)明的靈芝菌糊狀物和/或蟲草菌糊狀物混合制成的強(qiáng)化奶保持了靈芝菌和/或蟲草菌成分的完整性，靈芝菌和/或蟲草菌糊狀物的物理特性，特別是在溶解度和分散性上，牛奶成分的完整性以及牛奶的味道和天然顏色的完整性方面。蟲草菌強(qiáng)化牛奶的分析在表16中給出。
另一方面，本發(fā)明提供一種藥用組合物，包含至少一種在本發(fā)明培養(yǎng)基中生產(chǎn)的靈芝菌菌絲體、蟲草菌菌絲體、靈芝菌孢子、蟲草菌孢子、靈芝菌糊狀物和/或蟲草菌糊狀物。任選地，藥用組合物至少含有一種制藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或稀釋液。
本發(fā)明也提供了一種在本發(fā)明培養(yǎng)基中生產(chǎn)的靈芝菌菌絲體、蟲草菌菌絲體、靈芝菌孢子、蟲草菌孢子、靈芝菌糊狀物和蟲草菌糊狀物的用途，用于制造優(yōu)治療用途的藥物組合物，飲料(如牛奶)和/或食品(例如營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品)。
藥典上已經(jīng)允許蟲草菌和靈芝菌用作以下用途●免疫系統(tǒng)、腎和呼吸功能的支持；●在維持健康的血液葡萄糖和膽固醇水平中的支持；●提高生命力；●增強(qiáng)身體的循環(huán)功能下述的靈芝菌和蟲草菌的藥用效果已經(jīng)通過(guò)動(dòng)物模型和/或人類(臨床)試驗(yàn)被進(jìn)行研究●免疫調(diào)節(jié)冬蟲夏草(CS)能明顯增強(qiáng)身體的免疫力。
●抗癌和抗微生物引起的影響與免疫調(diào)節(jié)相結(jié)合，CS顯示一種抗癌功效，并被報(bào)導(dǎo)可以抑止病毒、細(xì)菌和真菌的感染。
●抗糖尿病活性CS中的多糖被報(bào)導(dǎo)明顯降低血糖水平。
●能量代謝及其效能的增強(qiáng)CS刺激肝的能量代謝已被報(bào)導(dǎo)。
●呼吸和肺部的功能CS被報(bào)導(dǎo)可松弛支氣管壁以及具有鎮(zhèn)靜，止咳和抗炎特性，因此它有效防止咳嗽、粘痰、哮喘和其它呼吸疾病。
●膽固醇和脂肪的代謝報(bào)告顯示血漿甘油三酸酯、“不良膽固醇”比如LDL-c和vLDL-c和總膽固醇水平可以被CS降低。
●對(duì)腎功能紊亂的影響有顯示CS可以被用于治療Berger’s疾病(IgA腎病)。
●對(duì)性功能障礙和生殖紊亂有影響已報(bào)導(dǎo)通過(guò)攝取CS臨床改善陽(yáng)痿。
●其它報(bào)告暗示CS可以刺激小鼠骨髓細(xì)胞紅血球生成，和抑止血小板的聚合。
下面特別記述了關(guān)于赤芝和冬蟲夏草菌株的醫(yī)用效果1)赤芝子實(shí)體或孢子的醫(yī)用效果
●抗癌劑動(dòng)物中的癌癥研究顯示用赤芝(俗名靈芝)治療有50％的腫瘤衰退率(舉例來(lái)說(shuō)老鼠中連接的組織癌癥模型)。
●免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)(支氣管炎、哮喘、敏感癥、皰疹病和HIV感染)在中國(guó)包括2000例的老年慢性支氣管炎用濃縮的靈芝菇治療已經(jīng)顯示了好的反應(yīng)。該研究證明了好于60％的成功率。
●抗病毒活性靈芝提取物的一種特殊的蛋白抑止多糖成分，稱作GLhw-02，已經(jīng)顯示在試驗(yàn)條件下?lián)碛械挚拱捳顔渭儾《?型和2型有效的抗病毒特性。在試驗(yàn)條件下，靈芝菇提取物中的各種靈芝酸已經(jīng)顯示是積極的抗HIV劑，顯示了在保守劑量上減少50％的病毒復(fù)制的能力。
●心血管的健康(高血壓和減少血小板凝聚)兩例人對(duì)照研究顯示靈芝提取物可以降低高血壓到有意義的水平(心臟收縮和心臟舒張)，甚至在以前對(duì)已有的抗高血壓的藥物沒(méi)有反應(yīng)的病人中也是如此。
●肝臟保護(hù)效果(肝保護(hù)特性)在中國(guó)靈芝是用于治療慢性和急性肝炎的處方。靈芝菇中的各種靈芝酸有很強(qiáng)的抗肝毒素的特性，這種特性在試驗(yàn)條件下顯示保護(hù)肝細(xì)胞不受化學(xué)方法導(dǎo)致的傷害，包括保護(hù)不受高毒和致命物質(zhì)四氯化碳的傷害。
2)蟲草菌子實(shí)體、菌絲或孢子的醫(yī)用效果●免疫調(diào)節(jié)冬蟲夏草(CS)可以明顯增強(qiáng)身體的免疫力。
●抗癌和抗微生物的效果與免疫調(diào)節(jié)功能相連，CS顯示一種抗癌效果和被報(bào)導(dǎo)可抑止病毒、細(xì)菌和真菌的感染。
●抗糖尿病的活性CS中的多糖被報(bào)導(dǎo)明顯降低血糖水平。
●能量代謝和性能的增強(qiáng)CS刺激肝的能量代謝已被報(bào)導(dǎo)。
●呼吸和肺部的功能CS被報(bào)導(dǎo)可松弛支氣管壁以及具有鎮(zhèn)靜，止咳和抗炎特性，因此它有效防止咳嗽、粘痰、哮喘和其它呼吸疾病。
●膽固醇和脂肪的代謝報(bào)告顯示血漿甘油三酸酯，“不良膽固醇”比如LDL-c和vLDL-c和總膽固醇水平可以被CS降低。
●對(duì)腎功能紊亂的影響有顯示CS可以被用于治療Berger’s疾病(IgA腎病)。
●對(duì)性功能障礙和生殖紊亂有影響已報(bào)導(dǎo)通過(guò)攝取CS臨床改善陽(yáng)痿。
●其它報(bào)告暗示CS可以刺激小鼠骨髓細(xì)胞紅血球生成，和抑止血小板的聚合。
(Wang and Shiao，食品和藥物分析雜志，Vol.8，No.4，248-257，2000；天然產(chǎn)品研究協(xié)會(huì)，http//www.naturalproducts.org/inpr/monographs pdf/index.html；中國(guó)藥物大藥典(中國(guó))。1997，上海科學(xué)與技術(shù)出版社，上海，中國(guó)；Ming-Shang MIAO，食物療法中國(guó)藥物藥典(中國(guó))。2001，科學(xué)出版社，北京，中國(guó))因此，本發(fā)明也提供一種用于治療處理的方法，特別地(但不局限于此)用于治療腫瘤、巨噬細(xì)胞的活性刺激、或免疫系統(tǒng)的刺激，腎和呼吸功能的刺激、增強(qiáng)身體循環(huán)功能和其它上述提到的用途，包含給予至少一種在本發(fā)明培養(yǎng)基中生產(chǎn)的靈芝菌菌絲體、蟲草菌菌絲體、靈芝菌孢子、蟲草菌孢子、靈芝菌糊狀物和/或蟲草菌糊狀物、或含有至少一種在本發(fā)明培養(yǎng)基中生產(chǎn)的靈芝菌菌絲體、蟲草菌菌絲體、靈芝菌孢子、蟲草菌孢子、靈芝菌糊狀物和/或蟲草菌糊狀物的藥物組合物、飲料(如牛奶)和/或食品(例如營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品)。
下面給出生產(chǎn)不同種的蟲草菌和靈芝菌的實(shí)例。應(yīng)該指出的是給出的生長(zhǎng)條件的參數(shù)比如發(fā)酵周期，溫度，攪拌速度，通氣率，pH范圍等，不必局限于已給出的數(shù)值，可以在合理的范圍內(nèi)改變，因?yàn)檫@是本領(lǐng)域的技術(shù)人員的常識(shí)。
實(shí)施例實(shí)施例1在發(fā)酵裝置中培養(yǎng)紫芝本實(shí)例使用一種含有至少一種碳源、酵母提取物、維生素(盡管不總是，酵母提取物通常含有足夠的活性維生素而不需要補(bǔ)充添加維生素)、無(wú)機(jī)物和其它生長(zhǎng)元素如蔗糖、葡萄糖、蛋白胨和食物級(jí)化學(xué)物質(zhì)。已發(fā)現(xiàn)酵母提取物富含維生素，特別利于靈芝菌的生長(zhǎng)。
為了生產(chǎn)紫芝APN3-1(FIRDI-36445)合適菌株的孢子，比如在平滑的斜面或平板瓊脂培養(yǎng)基(表2)上，25-30℃下(優(yōu)選29℃)培養(yǎng)和保存赤芝APN3-1(FIRDI-37177)3-5天。然后收獲合適量的真菌，并用于接種到搖瓶中的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以制備一級(jí)種子培養(yǎng)物。
搖動(dòng)培養(yǎng)的一個(gè)典型制備實(shí)例包含，在Erlenmeyer搖瓶中的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基，5升圓錐形搖瓶中的1升肉湯培養(yǎng)基(表3)，121℃下高壓滅菌20分鐘，并接種入6個(gè)赤芝APN3-1的斜面培養(yǎng)基，并置于下述生長(zhǎng)條件●pH5.5(在接種前調(diào)整)●29℃●搖瓶在搖動(dòng)器上以大約160轉(zhuǎn)/分鐘速度旋轉(zhuǎn)●培養(yǎng)周期72小時(shí)當(dāng)生長(zhǎng)速率達(dá)到穩(wěn)定階段，終止一級(jí)種子培養(yǎng)。然后來(lái)自一級(jí)培養(yǎng)的適量細(xì)胞用于在小攪拌罐中液體培養(yǎng)基中二級(jí)種子的培養(yǎng)。
二級(jí)種子的培養(yǎng)使用在75升生物反應(yīng)器中50升或更多的發(fā)酵培養(yǎng)基(表1)，例如BioLafitte牌的或更大的生物反應(yīng)器(比如800升或更大)。系統(tǒng)在121℃滅菌30分鐘并接入2升一級(jí)種子培養(yǎng)物(或大約4％接種量，也就是2升到50升)。保持下述生長(zhǎng)條件●pH5.5(在接種前調(diào)整)●25℃●通氣率1∶0.5v/v/m到1∶0.9v/v/m(也就是對(duì)于600升的液體培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，1500-2700升/小時(shí))，這里“v/v/m”是指培養(yǎng)基體積/通氣流量。
●渦輪攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘●培養(yǎng)周期48小時(shí)對(duì)于赤芝菌絲體的大規(guī)模生產(chǎn)，大約50升或更多的二級(jí)種子培養(yǎng)物，或8％的接種量，被用來(lái)接種到800升或更大的攪拌罐反應(yīng)器(BioLafitte)中，一般裝有600升或更多的合適的發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的體積范圍實(shí)際地可以從至少400升和更多。裝有培養(yǎng)基的罐首先在121℃滅菌30分鐘，并保持下述條件●pH5.5(在接種前調(diào)整)●25℃●攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘●通氣率1∶1v/v/m(600升大約36.0m3/小時(shí))
●培養(yǎng)周期72小時(shí)對(duì)于紫芝可以得到至少3％的收率。
通過(guò)從反應(yīng)器中排除培養(yǎng)物，并用真空過(guò)濾器、壓濾機(jī)或液壓機(jī)將其過(guò)濾而收集菌絲體。每個(gè)反應(yīng)器獲得高達(dá)60-100公斤的含有30％干物質(zhì)的菌絲餅。然后菌絲餅在雙橢圓旋轉(zhuǎn)真空干燥器上被干燥或通過(guò)冷凍干燥，得到含有28-30％蛋白質(zhì)的絲狀粉末。絲狀粉末用碾磨機(jī)磨成100-200目大小的顆粒。得到的粉末隨后包裝到鋁袋中。
實(shí)施例2在發(fā)酵裝置中的赤芝和松杉靈芝的培養(yǎng)赤芝APN3-2(FIRDI-37177)或松杉靈芝APN3-3(FIRDI-36090)首先生長(zhǎng)并保存在斜面或平板瓊脂培養(yǎng)基(表2)上，在24℃下3-5天然后赤芝或松杉靈芝的斜面培養(yǎng)物被用來(lái)接種到250毫升Erlenmeyer搖瓶中的50毫升的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基(表3)中。菌絲體在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上以160轉(zhuǎn)/分鐘，在25-29℃(優(yōu)選27℃)搖動(dòng)培養(yǎng)72小時(shí)。
對(duì)于赤芝和松杉靈芝的商業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，使用實(shí)施例1提到的多階段發(fā)酵。赤芝和松杉靈芝的菌絲產(chǎn)量與紫芝的收率接近。
表2YM斜面/平板瓊脂培養(yǎng)基

表3蛹蟲草和紫芝肉湯培養(yǎng)基

但是用于培養(yǎng)所有其它靈芝菌種的培養(yǎng)基(表1)與特殊用于培養(yǎng)紫芝的培養(yǎng)基稍有不同(表3)。對(duì)于所有其它的靈芝菌種來(lái)說(shuō)，KH2PO4和MgSO4.7H2O被用作無(wú)機(jī)源，但是對(duì)于赤芝來(lái)說(shuō)，具有如表3所示組分的培養(yǎng)基是優(yōu)選使用的(其中無(wú)機(jī)物是NaNO3)。
實(shí)施例3發(fā)酵裝置中冬蟲夏草的培養(yǎng)使用一種液體培養(yǎng)基，其含有一種碳源、一種氮源、維生素、無(wú)機(jī)物和其它來(lái)自葡萄糖原始材料、麥芽糖或粉末、酵母提取物和食品級(jí)化合物的生長(zhǎng)因子。為了生產(chǎn)蟲草菌，例如冬蟲夏草，分離的菌株首先接到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。冬蟲夏草的APN4-1(FIRDI-36421)菌株在YM斜面或平板瓊脂培養(yǎng)基(表2)或PDA(表4)試管或瓊脂平板上的培養(yǎng)基上25℃生長(zhǎng)和/或保持3天。
對(duì)于一級(jí)種子培養(yǎng)物，使用實(shí)施例1描述的Erlenmeyer燒瓶搖動(dòng)培養(yǎng)。每5升的圓錐燒瓶含有1升的肉湯培養(yǎng)基(表5或表6)在121℃滅菌20分鐘，并接種入3-6個(gè)冬蟲夏草APN4-1的斜面或平板培養(yǎng)物，隨后在下述條件下生長(zhǎng)●pH5.5(在接種前調(diào)整)●25℃●燒瓶以大約150轉(zhuǎn)/分鐘的速度在振蕩器上旋轉(zhuǎn)●培養(yǎng)周期48小時(shí)。
冬蟲夏草二級(jí)種子的培養(yǎng)，每個(gè)含有50升或更多的發(fā)酵培養(yǎng)基的75升(或更大的)攪拌生物反應(yīng)器(BioLafitte)在(表1)121℃滅菌30分鐘后用2升來(lái)自一級(jí)種子培養(yǎng)物的細(xì)胞接種(4％的接種量)。保持下述生長(zhǎng)條件●pH5.5●25℃●1∶0.2-1∶0.9v/v/m的通氣率(對(duì)于50升的培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，1500-2700升/小時(shí))●攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘●培養(yǎng)周期48小時(shí)對(duì)于冬蟲夏草的培養(yǎng)，800升(或更大)的攪拌罐反應(yīng)器(例如，BioLafitte)，每個(gè)含有600升或更多體積的發(fā)酵培養(yǎng)基(表1)被接入50升或更多的二級(jí)種子培養(yǎng)物(8％的接種量)。罐和發(fā)酵培養(yǎng)基在接種前121℃滅菌30分鐘。
●pH5.5●25-29℃●攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘●一般1∶0.5-1∶1v/v/m的通氣率(對(duì)于600升的培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，18-36.0m3/小時(shí))●培養(yǎng)周期48-72小時(shí)當(dāng)菌絲體到了指數(shù)生長(zhǎng)期末期時(shí)或達(dá)到生產(chǎn)目的繁殖足夠的量時(shí)，800升生物反應(yīng)器底部的閥門被打開(kāi)，收集冬蟲夏草的菌絲體并在真空過(guò)濾器或壓濾機(jī)過(guò)濾；每個(gè)生物反應(yīng)器得到高達(dá)100公斤的含有30％干物質(zhì)的菌絲餅。然后菌絲餅在雙橢圓旋轉(zhuǎn)真空干燥器上被干燥或通過(guò)冷凍干燥，得到含有27-28％蛋白質(zhì)的絲狀粉末。絲狀粉末用碾磨機(jī)磨成100-200目大小的顆粒。得到的粉末隨后包裝到鋁袋中。
表4.馬鈴薯右旋糖瓊脂培養(yǎng)基

表5.燒瓶培養(yǎng)基-1

表6.燒瓶培養(yǎng)基-2

實(shí)施例4發(fā)酵裝置中g(shù)racilis蟲草，memorabilis蟲草和大團(tuán)囊蟲草的培養(yǎng)gracilis蟲草APN4-2(FIRDI 32217)，memorabillis蟲草APN4-3(FIRDI 32218)和大團(tuán)囊蟲草的菌株在YM斜面或平板瓊脂培養(yǎng)基(表2)上25℃生長(zhǎng)和保持3-5天。gracilis蟲草，memorabillis蟲草或大團(tuán)囊蟲草的斜面培養(yǎng)物被接種到250-ml Erlenmeyer燒瓶中的50ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基(表5，6記述的)中。菌絲體在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上以150轉(zhuǎn)/分鐘，25℃搖動(dòng)培養(yǎng)72小時(shí)。
對(duì)于gracilis蟲草，memorabillis蟲草和大團(tuán)囊蟲草的商業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，采用實(shí)例3記述的多階段發(fā)酵。
實(shí)施例5蛹蟲草發(fā)現(xiàn)在溫度高于25℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)不好，而且在瓊脂斜面/平板上也不能很好地生長(zhǎng)。通過(guò)將0.6％的NaNO3或0.01％的核黃素(維生素B2)添加到Y(jié)M瓊脂培養(yǎng)基(對(duì)照，表2)中，培養(yǎng)時(shí)間從7天縮短到3天(在強(qiáng)化培養(yǎng)基上生長(zhǎng))。蛹蟲草APN4-5(FIRDI32219)在用其接種到實(shí)例3的多階段發(fā)酵中之前，在強(qiáng)化YM培養(yǎng)基上17-23℃，優(yōu)選20℃生長(zhǎng)和保存3天。
因此，用來(lái)培養(yǎng)其它所有蟲草菌菌株的培養(yǎng)基(表1)稍不同于特定用于蛹蟲草的培養(yǎng)基(表3)。對(duì)于其它所有的蟲草菌，KH2PO4和MgSO4.7H2O被用作無(wú)機(jī)源，而對(duì)于蛹蟲草來(lái)說(shuō)，則使用NaNO3(表3)來(lái)替代。
蟲草菌或靈芝菌中活性成分的提取方法目前在現(xiàn)有技術(shù)中被使用，不包含任何熱水提取步驟。本發(fā)明提供一種包括熱水提取步驟在內(nèi)的方法，這種方法提高了來(lái)自藥用真菌的可重獲的活性成分量。使用的水也可以與pH緩沖液混合，調(diào)整到大約pH10。
實(shí)施例6蟲草菌生物活性成分的提取過(guò)程根據(jù)本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)方法，蟲草菌或靈芝菌的活性成分被提取成為溶于水和溶于乙醇的混合物。但是，這些傳統(tǒng)的提取方法不包括具體實(shí)施方式
中提供的和下面記述的熱水提取。傳統(tǒng)方法中沒(méi)有熱水提取步驟，這樣不能有效提取水溶的多糖。為了更有效，熱水也可以緩沖到pH10。
大約1700g的濕蟲草菌用大約6升的熱水(大約90℃)浸濕過(guò)夜，也就是大約24小時(shí)或更長(zhǎng)，伴隨輕輕地?cái)噭?dòng)。隨后過(guò)濾蟲草菌，然后濾渣與2體積的99％的乙醇混合(每體積6升)。接著，添加乙醇到濾渣后得到的沉淀物被收集并在50％的乙醇中洗滌，隨后凍干，得到2.9克的蟲草菌多糖。
然后殘?jiān)挥脕?lái)提取活性成分，用4倍的大約4升的80％乙醇溶解，并伴隨輕輕的攪動(dòng)。隨后乙醇被蒸發(fā)掉，冷凍干燥所得濃縮物，得到101克的固體。除了乙醇之外可以使用其它溶劑，在本領(lǐng)域明顯可以使用丙酮。
水提取物和乙醇提取物兩者都可以被用于治療。
實(shí)施例7靈芝菌的孢子形成根據(jù)實(shí)施例1-5，靈芝菌在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)48-72小時(shí)后，其中壓力被升到至少2巴，并且通氣率調(diào)整1∶0.4到1∶0.6v/v/m(大約1350-1500升/小時(shí))，每升肉湯產(chǎn)生0.1克靈芝菌孢子。在這種壓力下，發(fā)現(xiàn)靈芝菌產(chǎn)生如圖5所示的擔(dān)子孢子。
通過(guò)從反應(yīng)器中汲取培養(yǎng)物，菌絲體被收集，并用真空過(guò)濾器或壓濾機(jī)過(guò)濾以得到含有30％干物質(zhì)的菌絲體餅?？梢岳弥亓蚩刂普婵諌毫?，兩者任選其一，通過(guò)聚酯針氈過(guò)濾介質(zhì)來(lái)過(guò)濾培養(yǎng)基，制得總固體占10-20％的濕菌絲。
靈芝菌孢子穿過(guò)過(guò)濾器并保留在被過(guò)濾過(guò)的發(fā)酵液中(液體殘?jiān)?。對(duì)于不同種類的靈芝菌來(lái)說(shuō)，每毫升過(guò)濾的發(fā)酵液中可獲得的孢子數(shù)量的范圍是106-107個(gè)。過(guò)濾的發(fā)酵液通過(guò)噴射式離心機(jī)離心濃縮液體以得到含30-40％的總固體，或洗滌兩次直到發(fā)酵殘?jiān)怀?。孢子的濃縮溶液隨后通過(guò)噴霧干燥或冷凍干燥而被干燥。每升發(fā)酵液獲得產(chǎn)量高達(dá)3.0克。
在本發(fā)明之前，這種靈芝菌的孢子僅可以在固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上生產(chǎn)，液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基主要用于生產(chǎn)菌絲體。靈芝菌的孢子與子實(shí)體相比，在TCM中被認(rèn)為有更高的療效和更高的價(jià)值。
實(shí)施例8蟲草菌的孢子形成蟲草菌孢子以與實(shí)例7中記述的靈芝菌同樣方式生產(chǎn)。
實(shí)施例9實(shí)施例1-8可改變的條件上述給出的實(shí)施例中的參數(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)可以明顯進(jìn)行調(diào)整。例如，靈芝菌和蟲草菌的真菌在溫度25到30℃的范圍，pH4.5到7.0的范圍下生長(zhǎng)，而且依據(jù)參數(shù)培養(yǎng)周期范圍從40小時(shí)到90小時(shí)。這些參數(shù)用于發(fā)酵的任何階段，盡管在每個(gè)階段它們可以優(yōu)選不同的值。
但是，一些蟲草菌的菌株，例如蛹蟲草菌在17℃到23℃的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)旺盛，優(yōu)選25℃。因此這種真菌的生產(chǎn)系統(tǒng)最低溫度優(yōu)選17℃。
最大的生物反應(yīng)罐中通常至少是1∶0.5v/v/m的通氣比率，能明顯維持已給出的培養(yǎng)基的體積。同樣地，攪拌速度或搖動(dòng)培養(yǎng)燒瓶的旋轉(zhuǎn)速度可以從至少100轉(zhuǎn)/分鐘到任何容器能維持已給出的培養(yǎng)基體積的速度。
發(fā)酵第一階段的體積在5升的圓錐燒瓶中通常是1升，但可以低到500毫升。發(fā)酵第二階段一般在75升的容器中通常生長(zhǎng)培養(yǎng)基的體積是50升。但是，為了生產(chǎn)，至少30升的體積可能足夠。第三階段，或生產(chǎn)階段，發(fā)酵體積可能至少400升，盡管一般是600升或更多。
表1給出的新培養(yǎng)基的成分顯示了培養(yǎng)基中成分可優(yōu)選的濃度。但是至少葡萄糖30g/l、麥芽糖30g/l、酵母提取物15g/l、KH2PO40.05g/l和MgSO4.7H2O0.05g/l也可用于培養(yǎng)真菌。
對(duì)于冬蟲夏草和紫芝的生長(zhǎng)培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，無(wú)機(jī)源用NaNO3替代KH2PO4和MgSO4。濃度1g/l可能維持一個(gè)合理的生長(zhǎng)率，盡管可優(yōu)選的濃度是2g/l。
下面表7、表8和表9顯示了野生蟲草菌和靈芝菌粉末與建議的具體實(shí)施方式
所生長(zhǎng)的蟲草菌和靈芝菌質(zhì)量上的不同。
市場(chǎng)上的蟲草菌和靈芝菌粉末的化學(xué)和衛(wèi)生測(cè)定表7.分析

表8.利用具體實(shí)施方式
中提供的方法得到的蟲草菌粉末的產(chǎn)品規(guī)格

表9利用具體實(shí)施方式
中提供的方法得到的靈芝菌粉末的產(chǎn)品規(guī)格

本發(fā)明具體實(shí)施方式
生產(chǎn)的真菌可以用于組合物中，它包含幾種蟲草菌和靈芝菌的混合物。下面的表10-12給出了3個(gè)實(shí)例(配方1-3)
表10.配方1(兩種蟲草菌)

表11.配方2(靈芝加上變色栓菌)

表12.配方3(超級(jí)激發(fā)劑)

實(shí)施例10制備蟲草菌糊狀物在實(shí)施例1-5記述的大規(guī)模培養(yǎng)方法完成后，菌絲體收集是利用重力將培養(yǎng)基通過(guò)針氈聚酯過(guò)濾器過(guò)濾或利用控制的真空壓力制得含有10-20％總固體的濕菌絲，而不是收集并干燥。然后濕菌絲用水洗滌兩次以除去培養(yǎng)基殘留物。
獲得的蟲草菌糊狀物的產(chǎn)量，每立方米發(fā)酵液250-500公斤。
含有10-20％總固體的濕菌絲置于勻化過(guò)程，用膠質(zhì)磨粉機(jī)或用勻化器，或者任何合適的研磨設(shè)備。通過(guò)勻化得到0.5-3.0μm大小的濕菌絲顆粒。顆粒的大小可使?jié)窬z在溶液中很好地?cái)U(kuò)散。獲得的蟲草菌制備物被稱為“糊狀蟲草菌”。
表13顯示了獲得的“糊狀冬蟲夏草”特殊性質(zhì)。圖8和9顯示的是冬蟲夏草的菌絲和孢子圖片。
表13以糊狀物形式的冬蟲夏草的產(chǎn)品規(guī)格

還評(píng)述了不同于冬蟲夏草(C，sinensis)的其它的種或系的不同性質(zhì)。
表14顯示了這些性質(zhì)。
表14其它蟲草菌菌株的性質(zhì)

實(shí)施例11靈芝菌糊狀形式的制備使用上述實(shí)例中同樣的方法，不同的是用靈芝菌替代蟲草菌。
表15顯示了靈芝菌糊狀物的產(chǎn)品規(guī)格。
表15以糊狀物形式的靈芝菌的產(chǎn)品規(guī)格

實(shí)施例12蟲草菌“強(qiáng)化”牛奶的牛產(chǎn)蟲草菌強(qiáng)化的UHT牛奶的生產(chǎn)試驗(yàn)是在標(biāo)準(zhǔn)的Tetra PakUHT(超高溫)車間進(jìn)行的。
300升的新鮮牛奶倒入混合罐-Tetra Almix，其中加入固體含量12％的蟲草菌糊狀物1875克，使得每升牛奶含有750毫克的蟲草菌?；旌铣浞趾螅诒萌敫邏簞蚧髦芭Ｄ填A(yù)熱到75℃，在200-250巴的壓力下牛奶被勻化。預(yù)熱的、勻化的牛奶被泵入到UHT設(shè)備的加熱部分，在其中在4秒鐘內(nèi)將該牛奶加熱到140℃，然后冷卻到25℃。冷卻的牛奶被泵入到一個(gè)無(wú)菌的緩沖罐中，從此無(wú)菌的包裝線連續(xù)生產(chǎn)出250毫升一袋的最終的蟲草菌牛奶。
在Tetra Almix的混合過(guò)程中，蟲草菌糊狀物被很好地分散到新鮮牛奶中。在UHT流程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)污染物(“污染物”在奶廠中涉及一個(gè)在管線或超濾中流動(dòng)的問(wèn)題，其中有機(jī)的特殊物質(zhì)在管線中成團(tuán)并引起流程或衛(wèi)生的問(wèn)題)。正如表18所示，pH記錄和“UHT前”和“UHT后”白利糖度的量(“白利糖度”，與總固體的百分比有關(guān)，是基于折射率的)沒(méi)有明顯的不同。沉淀的量低于0.5％v/v。粘度的升高也不明顯(也就是說(shuō)從2到3厘泊)。
在感覺(jué)上，產(chǎn)品味道新鮮、滑爽而且有奶油口感。
產(chǎn)品的保溫試驗(yàn)，在35℃和55℃下進(jìn)行7天，顯示出正常和滿意的結(jié)果。產(chǎn)品在室溫下9個(gè)月的儲(chǔ)存期試驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)微生物數(shù)量的增長(zhǎng)并表現(xiàn)出可接受的與普通UHT牛奶相反的感觀結(jié)果。獲得的產(chǎn)品的分析顯示在表16中。
表16產(chǎn)品分析記錄單

實(shí)施例13生產(chǎn)“強(qiáng)化”牛奶的一般方法的要點(diǎn)根據(jù)本發(fā)明強(qiáng)化牛奶制備的一般方法的要點(diǎn)顯示在
圖11中。步驟如下所述I)步驟(1)新鮮奶指的是任何類型的液態(tài)牛奶，比如全脂牛奶、脫脂牛奶、復(fù)合牛奶等等。
II)步驟(2)糊狀物成分是指根據(jù)本發(fā)明制得的任何類型的活性糊狀物成分。
III)步驟(3)和(4)混合罐是任何類型的用于很好地混合液態(tài)牛奶和本發(fā)明的糊狀物的攪拌設(shè)備。該流程確保使糊狀物很好地分散到液態(tài)牛奶中。
IV)步驟(5)混合牛奶+糊狀物的混合物，并在UHT處理之前加熱到75℃。
V)步驟(6)另外要分解牛奶中的脂肪小珠以減少乳狀物。作為標(biāo)準(zhǔn)的工業(yè)過(guò)程，勻化也被用來(lái)碎裂或很好地分散糊狀物的顆?；蚱?。
IV)步驟(7)、(8)和(9)UHT處理是指在任何UHT廠的流程，其中混合物被泵入通過(guò)一個(gè)封閉的系統(tǒng)并在被冷卻到75℃和隨后被冷卻到25℃前，在135-150℃被處理幾秒鐘，非直接加熱或直接充入或灌入蒸氣。
VII)步驟(10)任何帶有無(wú)菌儲(chǔ)罐的無(wú)菌包裝設(shè)備被用來(lái)將獲得的強(qiáng)化牛奶包裝成具有長(zhǎng)保存期的任何形式的UHT牛奶產(chǎn)品。
VIII)步驟(11)與UHT處理不同，標(biāo)準(zhǔn)的巴斯德滅菌過(guò)程可以被用來(lái)生產(chǎn)具有短保持期的巴斯德滅菌的強(qiáng)化牛奶。
實(shí)施例14用蟲草菌/靈芝菌提取物制備“強(qiáng)化”牛奶實(shí)施例6提到的蟲草菌和/或靈芝菌的提取物被用來(lái)強(qiáng)化奶產(chǎn)品和飲品。采用與實(shí)施例12和13記述的同樣的方法將牛奶添加到蟲草菌或靈芝菌提取物中。
實(shí)施例15利用由蟲草菌/靈芝菌孢子制得的粉末制備“強(qiáng)化”牛奶根據(jù)實(shí)施例7或8得到的靈芝菌或蟲草菌的孢子分別被收集，過(guò)濾和干燥，例如用雙圓錐旋轉(zhuǎn)干燥器或冷凍干燥。然后根據(jù)實(shí)施例12和13，將獲得的粉末混合到牛奶中，用以制備依據(jù)本發(fā)明的牛奶組合物。
實(shí)施例16利用由蟲草菌/靈芝菌孢子制得的糊狀物制備“強(qiáng)化”牛奶根據(jù)實(shí)施例7或8得到的靈芝菌或蟲草菌的孢子分別被收集，過(guò)濾和依據(jù)實(shí)施例10或11操作。然后依據(jù)實(shí)例12和13，將制備的糊狀物混合到牛奶中。
實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的詳述通過(guò)SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡得到的赤芝和冬蟲夏草中蛋白多糖和糖蛋白的圖譜目前，許多研究已經(jīng)記述了來(lái)自靈芝菌和蟲草菌的一組生理或藥物活性成分是結(jié)合了多糖和/多聚糖的蛋白質(zhì)[Y.Xu，Intl.J.FoodSci.Tech.，36，229-242(2001)]。在赤芝中具有分子量(MW)為12-18千道爾頓(kDa)的糖蛋白被發(fā)現(xiàn)有免疫抑止的活性[H.Tsunoo等人，美國(guó)專利5,334,704(1994)]或抗癌的功效[J.Zhang等人，Bio.Biotech.Biochem.，58，1202-1205(1994)]。冬蟲夏草的多聚糖的片段被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性，能夠在體內(nèi)抑止小鼠惡性腫瘤180的生長(zhǎng)[YJ.Chen，Life Sciences，60，2349-2359(1997)]。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)被用來(lái)分離通過(guò)已描述的方法得到的提取物中的蛋白，主要是基于它們的分子量。含有12％的丙烯酰胺的SDS-聚丙烯酰胺凝膠依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序被制備(如Bio-Rad記述的)。電泳是在Mini-Protean3 Cell上進(jìn)行，Bio-Rad的緩沖體系(更低和更高)0.025M Tris，0.192M的氨基乙酸和0.1％SDS，pH8.3。提取物(0.5ml)與0.5ml的含有0.125M的Tris-Cl，4％的SDS和20％v/v的氨基乙酸，0.2M的DTT和0.02％的溴酚藍(lán)的處理緩沖液混合，pH6.8?；旌衔?20μl)被裝到凝膠上，在恒壓300V、15mA下電泳2小時(shí)。然后凝膠在50％甲醇、10％乙酸和40％的水(v/v)組成的混合溶液中搖動(dòng)至少2小時(shí)，隨后在含有50％的甲醇、0.05％考馬斯亮藍(lán)、10％乙酸和40％水(v/v)的染液中，伴隨慢慢的搖動(dòng)染色4小時(shí)。凝膠在7％的乙酸、5％甲醇和88％水(v/v)的溶液中脫染，并保持在7％的乙酸，5％甲醇和2％的氨基乙酸溶液中。凝膠用纖維素膜覆蓋并空氣干燥。
蛋白質(zhì)印跡的操作是將SDS-PAGE凝膠上的條帶轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上，用Mini Trans-BlotElectrophoretic Transfer Cell，Bio-Rad，在含有25mMTris，192mM氨基乙酸緩沖液，在pH8.3，30V中央電壓和90mA的限制電流下，至少18小時(shí)。轉(zhuǎn)化的膜用Bio-Rad的免疫印記試劑盒染色來(lái)探測(cè)糖蛋白。
圖6和7顯示在赤芝和冬蟲夏草的活性成分中發(fā)現(xiàn)的蛋白、糖蛋白和多聚糖的圖譜。
老鼠的急性口服毒性試驗(yàn)1)10只雄性和10只雌性的Sprague Dawly(SD)老鼠，6-8周大，由新加坡國(guó)立大學(xué)(NUS)的試驗(yàn)動(dòng)物中心獲得并在新加坡Kent Ridge動(dòng)物保藏單位使之適應(yīng)環(huán)境5天。根據(jù)它們的性別2或3只籠養(yǎng)在一起。室溫保持在22-26℃，濕度在40-70％m，房間處于12小時(shí)照明和12小時(shí)黑暗的循環(huán)中。動(dòng)物被喂以通常的實(shí)驗(yàn)室生物，不限制給予飲用水。在試驗(yàn)前，材料是口喂，飼料被停留一晚上。體重僅在定量給料前記錄。
2)隨后5只公鼠和5只雌鼠被隨意選擇并被分配，組成試驗(yàn)組。用“2g蟲草菌和靈芝菌的粉末/20ml懸浮液”用填喂法喂給它們一個(gè)劑量，相當(dāng)于2g/Kg老鼠體重。
3)其它的10只老鼠作為對(duì)照組并被喂以水，20ml/Kg老鼠體重。
4)服藥后2小時(shí)觀察所有的動(dòng)物，在下一個(gè)2小時(shí)每小時(shí)觀察。此后，每天至少觀察一次，一直到15天。體重、飼料的量和水消耗程度都被監(jiān)測(cè)。
5)15天后，記錄體重，并處死老鼠。實(shí)施尸體解剖并進(jìn)行大體的病理學(xué)觀察。
用“固定服藥方法”測(cè)定的靈芝菌和蟲草菌粉末的LD50被認(rèn)為大于2g/Kg體重。用本發(fā)明的物質(zhì)口服給老鼠沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有毒性。采用的程序是OECD急性口服毒性-固定服藥方法TG420的一個(gè)修正程序。
采用2g/Kg體重的劑量用于給藥。
對(duì)老鼠進(jìn)行蟲草菌物質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)1)方法i)冬蟲夏草乙醇提取物的制備mycelia蟲草的乙醇提取物，與實(shí)施例6中記述的相同，被用于研究老鼠的免疫調(diào)節(jié)。
方法200克被磨成粉的mycelia蟲草浸到800ml的80％乙醇溶液中?；旌衔锉粨u動(dòng)一個(gè)晚上，并重復(fù)幾次直到菌絲體失去顏色。
以500轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心5分鐘除去殘?jiān)Ｔ?0-50℃的水浴溫度下用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀除去乙醇。
提取物被冷凍干燥一個(gè)晚上以制備用于動(dòng)物研究的蟲草菌菌絲體乙醇提取物的粉末。
ii)在老鼠身上免疫調(diào)節(jié)的評(píng)價(jià)草案草案1體內(nèi)研究為了研究樣品是否在老鼠體內(nèi)刺激了巨噬細(xì)胞的活性，每個(gè)樣品2個(gè)劑量溶解在水中，每個(gè)樣品每天一次口服給5只老鼠，進(jìn)行14天。5只對(duì)照鼠僅喂以水(對(duì)照組)。處理期結(jié)束時(shí)，所有的老鼠被處死，并用PBS從腹腔中取出巨噬細(xì)胞。
來(lái)自對(duì)照和處理組巨噬細(xì)胞被預(yù)備好，并以不同的效應(yīng)物目標(biāo)物的比率(10∶1，5∶1，2∶1和1∶1)，與癌癥細(xì)胞一起培養(yǎng)24小時(shí)。
培養(yǎng)期后，細(xì)胞混合物用MTT處理并用微板記錄器測(cè)定。分析獲得的結(jié)果以確定是否發(fā)現(xiàn)有明顯的不同。
草案II體外研究未處理的老鼠的脾被取出，并準(zhǔn)備脾細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液。脾細(xì)胞被置于96-孔的微平板中，并如下所述被分組i)陰性對(duì)照細(xì)胞用鹽處理ii)陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞用免疫刺激物，LPS和Con-A處理
iii)處理1細(xì)胞用不同劑量的樣品處理iv)處理2細(xì)胞用不同劑量的樣品和次佳劑量的Con A或LPS處理v)處理3細(xì)胞用不同劑量的樣品和最佳劑量的Con A或LPS處理細(xì)胞被培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)期后，用MTT處理細(xì)胞以評(píng)價(jià)被樣品處理的脾細(xì)胞的活性。
從不同組得到的數(shù)值被分析用以確定不同組的統(tǒng)計(jì)學(xué)的重要性。
縮寫PBS磷酸鹽緩沖鹽水MTT3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物Con A伴刀豆球蛋白ALPS脂多糖2)結(jié)果i)草案I老鼠體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)用mycelia蟲草的80％乙醇提取物處理(以10mg/(Kg體重)和100mg/(Kg體重)劑量)的老鼠，當(dāng)體外以1∶1和2∶1的低巨噬細(xì)胞毒瘤比率試驗(yàn)時(shí)，結(jié)果是刺激了巨噬細(xì)胞的活性。當(dāng)以10∶1的最高比率試驗(yàn)時(shí)，用提取物10mg/(Kg體重)處理的老鼠的巨噬細(xì)胞的活性也提高了。
ii)草案II老鼠的體外免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)在分裂素、ConA和LPS不存在時(shí)，體外mycelia蟲草的80％乙醇提取物濃度依賴性地和明顯地提高了淋巴細(xì)胞的增殖。當(dāng)有次佳量和最佳量的ConA存在時(shí)，僅在最高濃度試驗(yàn)(10μg/ml)中，T-淋巴細(xì)胞的活性明顯升高。在此濃度，僅在LPS分裂素達(dá)到最佳量時(shí)，提取物明顯地提高了B-淋巴細(xì)胞的增殖。
權(quán)利要求
1.一種用于大規(guī)模生產(chǎn)真菌的設(shè)備，包含一種生物反應(yīng)器；和一種液體培養(yǎng)基，包括具有至少一種碳源的水和至少500升的體積且pH至少是pH5；和用于攪拌液體培養(yǎng)基的工具；和用于保持液體培養(yǎng)基溫度至少在17℃的工具；和以至少1∶0.5v/v/m的比率向液體培養(yǎng)基通氣的工具；和消泡劑。
2.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中攪拌工具是攪拌器，其攪拌速率至少是100轉(zhuǎn)/分鐘。
3.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含酵母提取物。
4.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含的酵母提取物的濃度至少是15g/l。
5.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含蛋白胨源。
6.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含的蛋白胨源濃度至少為15g/l。
7.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含葡萄糖作為碳源之一。
8.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含濃度至少為30g/l的葡萄糖作為碳源之一。
9.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含麥芽糖作為碳源之一。
10.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含濃度至少為30g/l的麥芽糖作為碳源之一。
11.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含至少一種無(wú)機(jī)源。
12.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含硫酸鎂作為無(wú)機(jī)源。
13.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含濃度至少為0.05g/l的硫酸鎂作為無(wú)機(jī)源。
14.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含一元磷酸鉀作為無(wú)機(jī)源。
15.如權(quán)利要求1所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基進(jìn)一步包含濃度至少為0.05g/l的一元磷酸鉀作為無(wú)機(jī)源。
16.如上述權(quán)利要求任一所述的設(shè)備，其中大規(guī)模生產(chǎn)的真菌是蟲草菌。
17.如上述權(quán)利要求任一所述的設(shè)備，其中大規(guī)模生產(chǎn)的真菌是靈芝菌。
18.如權(quán)利要求16或17所述的設(shè)備，其中液體培養(yǎng)基的溫度至少是17℃。
19.如權(quán)利要求1到11任一所述的設(shè)備，其中真菌是蛹蟲草。
20.如權(quán)利要求1到11任一所述的設(shè)備，其中真菌是紫芝。
21.如權(quán)利要求19或20所述的設(shè)備，其中無(wú)機(jī)物包括硝酸鈉。
22.如權(quán)利要求21所述的設(shè)備，其中硝酸鈉的濃度至少是0.05g/l。
23.通過(guò)權(quán)利要求1所述設(shè)備得到的蟲草菌。
24.通過(guò)權(quán)利要求1所述設(shè)備得到的靈芝菌。
25.一種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌的多階段方法提供真菌來(lái)源；將真菌接種到第一階段的液體培養(yǎng)基中；攪動(dòng)第一階段的液體培養(yǎng)基，讓真菌生長(zhǎng)一段時(shí)間；將第一階段的培養(yǎng)物接種到第二階段的液體培養(yǎng)基中；攪動(dòng)第二階段的液體培養(yǎng)基，讓培養(yǎng)物生長(zhǎng)一段時(shí)間；將第二階段的培養(yǎng)物接種到容納在生物反應(yīng)器中至少500升的液體培養(yǎng)基中；攪動(dòng)第三階段的液體培養(yǎng)基，讓培養(yǎng)物生長(zhǎng)一段時(shí)間；保持每個(gè)階段液體培養(yǎng)基的pH值至少大約是pH5；添加至少一種碳源到每個(gè)階段的液體培養(yǎng)基中。
26.如權(quán)利要求25所述的方法進(jìn)一步包含將葡萄糖、麥芽糖、一元磷酸鉀、硫酸鎂和酵母提取物添加到第二或第三階段液體培養(yǎng)基中的步驟。
27.如權(quán)利要求25所述的方法進(jìn)一步包含將濃度至少為15g/l的酵母提取物添加到第二或第三階段液體培養(yǎng)基中。
28.如上述權(quán)利要求任一所述的方法，其中酵母提取物含有維生素。
29.如權(quán)利要求25所述的方法進(jìn)一步包含將至少一種類型的無(wú)機(jī)物添加到第二或第三階段液體培養(yǎng)基中的步驟。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中無(wú)機(jī)物包含硫酸鎂。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中無(wú)機(jī)物包含一元磷酸鉀。
32.如權(quán)利要求29所述的方法進(jìn)一步包含將濃度至少為0.05g/l的硫酸鎂添加到第二或第三階段液體培養(yǎng)基中。
33.如權(quán)利要求29所述的方法進(jìn)一步包含將濃度至少為0.05g/l的一元磷酸鉀添加到第二或第三階段液體培養(yǎng)基中的步驟。
34.如權(quán)利要求25所述的方法進(jìn)一步包含在第一階段液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌至少48小時(shí)；其中液體培養(yǎng)基具有至少大約500ml的體積。
35.如權(quán)利要求25所述的方法，其中攪拌第一階段液體培養(yǎng)基的步驟中包含以至少100轉(zhuǎn)/分鐘的速率旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)基的容器的步驟。
36.如權(quán)利要求25所述的方法進(jìn)一步包含以至少1∶0.5v/v/m的比率向第二階段的液體培養(yǎng)基充氣；和在體積至少大約50ml的第二階段培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌至少40小時(shí)。
37.如權(quán)利要求25所述的方法，其中第二階段液體培養(yǎng)基的攪動(dòng)步驟包含以至少100轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌第二階段的液體培養(yǎng)基。
38.如權(quán)利要求25所述的方法進(jìn)一步包含的步驟以至少1∶0.5v/v/m的比率向第三階段分液體培養(yǎng)基充氣；和在體積至少大約500升的第三階段培養(yǎng)基中培養(yǎng)真菌至少48小時(shí)。
39.如上述任何權(quán)利要求所述的方法，其中真菌包含蟲草菌。
40.如上述任何權(quán)利要求所述的方法，其中真菌包含靈芝菌。
41.如權(quán)利要求39到40任一所述的方法進(jìn)一步包含使液體培養(yǎng)基中的溫度至少保持在17℃的步驟。
42.如權(quán)利要求25到38所述的方法，其中真菌包含蛹蟲草；和進(jìn)一步包含使液體培養(yǎng)基的溫度至少保持在17℃的步驟。
43.一種培養(yǎng)蛹蟲草的方法，包含使蛹蟲草在含有硝酸鈉的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
44.如權(quán)利要求43所述方法，其中培養(yǎng)基中硝酸鈉濃度至少為0.5％。
45.一種培養(yǎng)蛹蟲草的方法，包含使蛹蟲草在含有核黃素(維生素B2)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中培養(yǎng)基中核黃素的濃度至少為0.01％。
47.通過(guò)如權(quán)利要求25-39或41-46所述的方法得到的蟲草菌。
48.通過(guò)如權(quán)利要求25-38和40-41所述的方法得到的靈芝菌。
49.一種用于培養(yǎng)蟲草菌或靈芝菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，包含葡萄糖；和麥芽糖；和水。
50.如權(quán)利要求49所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)一步包含酵母提取物。
51.如權(quán)利要求50所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中酵母提取物含有維生素。
52.如權(quán)利要求50或51所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中酵母提取物濃度至少為15g/l。
53.如權(quán)利要求49所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中葡萄糖濃度至少為30g/l。
54.如權(quán)利要求49所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中麥芽糖濃度至少為30g/l。
55.如權(quán)利要求49所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)一步包含無(wú)機(jī)物。
56.如權(quán)利要求55所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中無(wú)機(jī)物包括磷酸鈉。
57.如權(quán)利要求55所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中無(wú)機(jī)物包括一元磷酸鈉。
58.如權(quán)利要求55所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中無(wú)機(jī)物包括二元磷酸鈉。
59.如權(quán)利要求56、57或58所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中無(wú)機(jī)物的濃度至少有1g/l。
60.如權(quán)利要求55所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中無(wú)機(jī)物包括硫酸鎂。
61.如權(quán)利要求60所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中硫酸鎂的濃度至少為0.05g/l。
62.如權(quán)利要求55所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中無(wú)機(jī)物包括硝酸鈉。
63.如權(quán)利要求62所要求的一種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中硝酸鈉濃度至少為0.5g/l。
64.一種生產(chǎn)靈芝菌和/或蟲草菌孢子的方法，包含使用至少2巴的壓力來(lái)培養(yǎng)靈芝菌和/或蟲草菌。
65.如權(quán)利要求64所述的方法進(jìn)一步包含在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)靈芝菌和/或蟲草菌。
66.如權(quán)利要求65所述的方法進(jìn)一步包含在含有生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)靈芝菌和/或蟲草菌；和一種液體培養(yǎng)基，包含具有至少一種碳源的水和至少500升的體積且pH值至少是pH5；和用于攪動(dòng)液體培養(yǎng)基的工具；和用于使液體培養(yǎng)基的溫度至少保持在17℃的工具；和以至少1∶0.5v/v/m的比率向液體培養(yǎng)基通氣的工具；和消泡劑。
67.通過(guò)如權(quán)利要求64到66所述的方法得到的靈芝菌和/或蟲草菌的孢子。
68.一種提取蟲草菌成分的方法，包含；在溫度高于90℃的熱水中浸泡蟲草菌菌絲體至少12小時(shí)以獲得混合物；過(guò)濾混合物分成濾液部分和殘?jiān)糠?；用溶劑混合濾液以獲得水溶性榨取物的沉淀；用溶劑混合殘?jiān)⑤p輕攪動(dòng)；除去溶劑以獲得可溶于溶劑的榨取物。
69.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中溶劑是有機(jī)溶劑。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中有機(jī)溶劑是乙醇。
71.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法，其中水與堿性緩沖液混合。
72.根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中水包含了pH10的堿性緩沖液。
73.根據(jù)權(quán)利要求68所述的方法進(jìn)一步包含的步驟實(shí)行多于3個(gè)循環(huán)的用溶劑混合殘?jiān)牟襟E，并在除去溶劑之前輕輕攪動(dòng)以獲得溶于溶劑的提取物。
74.根據(jù)權(quán)利要求25-46任一所述的方法，進(jìn)一步包含收集、過(guò)濾菌絲體和洗滌菌絲體以除去存在于培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基殘?jiān)牟襟E。
75.根據(jù)權(quán)利要求74所述的方法制備的蟲草菌和/或靈芝菌的糊狀物。
76.包含至少下述成分的蟲草菌總蛋白質(zhì)27-28％、總水溶性多糖至少20％、蟲草酸至少5％、蟲草菌絲至少0.1％和腺苷至少0.15％。
77.一種含有如權(quán)利要求76所述蟲草菌特征的蟲草菌糊狀物。
78.包含至少下述成分的靈芝菌，總蛋白質(zhì)28-30％，和總水溶性多糖至少15％。
79.一種制備被純化的蟲草菌和/或靈芝菌糊狀物的方法，包含在權(quán)利要求49-63的生長(zhǎng)培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)蟲草菌和/靈芝菌。
80.如權(quán)利要求79所述的方法，進(jìn)一步包含收集、過(guò)濾菌絲體、和洗滌菌絲體以除去存在于培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基殘?jiān)牟襟E。
81.一種根據(jù)權(quán)利要求79-80任一所述的方法制備的蟲草菌和/或靈芝菌糊狀物。
82.一種單細(xì)胞的蟲草菌和/或靈芝菌。
83.一種單細(xì)胞培養(yǎng)物包含基本上單細(xì)胞菌株的蟲草菌和/或靈芝菌。
84.如權(quán)利要求83所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物，包含基本上100％的靈芝菌和/或蟲草菌的單細(xì)胞種。
85.一種飲料和/或食品，包含至少下述一種物質(zhì)如權(quán)利要求23所述的蟲草菌、如權(quán)利要求24所述的靈芝菌、如權(quán)利要求47所述的蟲草菌、如權(quán)利要求48所述的靈芝菌、如權(quán)利要求67所述的靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、如權(quán)利要求78所述的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物、如權(quán)利要求82所述的單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌以及如權(quán)利要求83-84所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物。
86.一種強(qiáng)化牛奶產(chǎn)品，包含使牛奶與下述至少一種物質(zhì)混合如權(quán)利要求23所述的蟲草菌、如權(quán)利要求24所述的靈芝菌、如權(quán)利要求47所述的蟲草菌、如權(quán)利要求48所述的靈芝菌、如權(quán)利要求67所述的靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、如權(quán)利要求77-78所述的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物、如權(quán)利要求82所述的單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌以及如權(quán)利要求83-84所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物。
87.一種制備強(qiáng)化牛奶產(chǎn)品的方法，包含使牛奶與下述至少一種物質(zhì)混合如權(quán)利要求23所述的蟲草菌、如權(quán)利要求24所述的靈芝菌、如權(quán)利要求47所述的蟲草菌、如權(quán)利要求48所述的靈芝菌、如權(quán)利要求67所述靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、如權(quán)利要求77-78所述的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物、如權(quán)利要求82所述的單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌以及如權(quán)利要求83-84所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物。
88.一種藥用組合物，包含至少下述一種物質(zhì)如權(quán)利要求23所述的蟲草菌、如權(quán)利要求24所述的靈芝菌、如權(quán)利要求47所述的蟲草菌、如權(quán)利要求48所述的靈芝菌、如權(quán)利要求67所述靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、如權(quán)利要求77-78所述的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物、如權(quán)利要求82所述的單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌以及如權(quán)利要求83-84所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物。
89.權(quán)利要求88的藥用組合物，進(jìn)一步與制藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或稀釋液結(jié)合。
90.下述至少一種物質(zhì)的用途如權(quán)利要求23所述的蟲草菌、如權(quán)利要求24所述的靈芝菌、如權(quán)利要求47所述的蟲草菌、如權(quán)利要求48所述的靈芝菌、如權(quán)利要求67所述的靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、如權(quán)利要求77-78所述的靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物，用于制造藥物組合物，這種藥物組合物至少可用于治療腫瘤、巨噬細(xì)胞的活性刺激、系統(tǒng)刺激、腎和呼吸功能的刺激和增強(qiáng)身體循環(huán)功能。
91.一種腫瘤治療、巨噬細(xì)胞活性刺激、和/或免疫反應(yīng)刺激的方法，包含給予受體所需的下述至少一種物質(zhì)如權(quán)利要求23所述的蟲草菌、如權(quán)利要求24所述的靈芝菌、如權(quán)利要求47所述的蟲草菌、如權(quán)利要求48所述的靈芝菌、如權(quán)利要求67所述的靈芝菌和/或蟲草菌的孢子、靈芝菌和/或蟲草菌的糊狀物、以及如權(quán)利要求82所述的單細(xì)胞靈芝菌和/或蟲草菌、以及如權(quán)利要求83-84所述的單細(xì)胞培養(yǎng)物、如權(quán)利要求85所述的食品或飲料、如權(quán)利要求86所述的強(qiáng)化牛奶、如權(quán)利要求88-89所述的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種用于生產(chǎn)靈芝菌和/或蟲草菌的設(shè)備和方法，包含在有效的培養(yǎng)基中培養(yǎng)靈芝菌和/或蟲草菌，特別是通過(guò)所述設(shè)備和方法得到的靈芝菌和/或蟲草菌糊狀物，以及靈芝菌和/或蟲草菌的孢子，包含靈芝菌和/或蟲草菌的強(qiáng)化飲料，例如強(qiáng)化牛奶和食品。
文檔編號(hào)A01H15/00GK1536069SQ200410028339
公開(kāi)日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2004年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月10日
發(fā)明者徐躍, 徐 躍 申請(qǐng)人:金利太平洋營(yíng)養(yǎng)技術(shù)私人有限公司