專利名稱:通過胚胎發(fā)生法使向日葵再生的方法
本發(fā)明是關于一項以細胞或組織開始通過體細胞胚胎發(fā)生法使向日葵植株再生的方法。本發(fā)明也涉及借助于這項方法產(chǎn)生的向日葵植株和種子。
盡管我們已能從分離的細胞或組織出發(fā)使許多栽培品種的植株獲得再生，但以向日葵(Helianthus annuus)進行的種種努力經(jīng)?？偸峭絼跓o益的。有關通過體細胞胚胎發(fā)生法使向日葵再生的數(shù)種方法在文獻資料中曾有描述，但這些方法僅涉及稀有基因型，或雜交種。取下之活的植物組織是放在第一培養(yǎng)基中培植，這種培養(yǎng)基誘導胼胝體的形成。接著，胼胝體被轉(zhuǎn)移到第二培養(yǎng)基中，這種培養(yǎng)基誘導體細胞胚胎和胚芽的形成。然后，胚芽被轉(zhuǎn)移到第三培養(yǎng)基中，這種培養(yǎng)基誘導根部的形成，而在此階段，可將再生的植株栽植入土中。
佩特森(Paterson)和埃弗雷特(Everett)[植物科學(Plant Sci.，)1985，42，125]配制了一種培養(yǎng)基，經(jīng)喬治伊娃(Georgieva)、托多洛娃(Todorva)等人確定配制了最佳培養(yǎng)基[第九屆國際向日葵學術討論會論文集(Proc.9th Int.Sconflower Conference，托雷莫利諾斯，西班牙，1980，122)]，此培養(yǎng)基從胚軸的片段出發(fā)借助于體細胞胚胎法而誘導向日葵的一種栽培品種(SS415B)的再生。取下之活的植物組織置于黑暗中培養(yǎng)2周，接著在光照下培養(yǎng)2～4周，所使用的是一種改性的穆拉布格和斯庫格(MS)培養(yǎng)基，補充以40毫克/升的硫酸腺嘌呤、1毫克/升的6-芐氨基嘌呤(BAP)、1毫克/升的萘乙酸(ANA)和0.1毫克/升的赤雷素(GA3)。在頭兩周期間，有一種易粉碎的胼胝體的形成，在光照下觀察到綠色的斑點出現(xiàn)，它會轉(zhuǎn)變成芽。通過一項解剖研究揭示了這些綠色斑點是類似于接合子胚胎的體細胞胚胎。
錢德勒(Chanuder)和簡[農(nóng)業(yè)文摘(Agronomy Abstr.，1983，58)]敘述了從來自種間雜交的未成熟胚胎出發(fā)的向日葵的再生。未成熟的胚胎(4～5天)是置于由錢德勒(Chandler)和比爾德(Beayd)所描述的為搶救胚胎的生長培養(yǎng)基中[作物科學(Crop Sci.，1983，23 1004)]。經(jīng)2～3周之后，變大的胚胎被轉(zhuǎn)移到以MS培養(yǎng)基為基質(zhì)的帶有植物生長激素和細胞激素可變劑量的各種不同配方中。在這些培養(yǎng)基中，植物的生產(chǎn)遵照不同的途徑，包括直接發(fā)芽或誘導胼胝體后續(xù)器管發(fā)生或胚胎發(fā)生。最好的結(jié)果是用液體在0～1ppm之間的吲哚乙酸(AIA)和激素而獲得的。此系統(tǒng)的優(yōu)點是從一個孤單胚胎出發(fā)進行無性繁植系的多種生產(chǎn)。
庫利(Coodey)和威爾科克斯(Wilcox)(歐洲專利申請0172377)提出一項應用于栽培向日葵植物品種HA89和RHA274的方法，其中包括上述的三個階段，并在三種不同的培養(yǎng)基中進行，頭兩個階段的培養(yǎng)基必須含有一種植物生長素型的激素。然而，這項方法具有幾種缺點，一方面是僅可應用于一個尺寸范圍狹小(從0.1到2毫米)的胚胎，因而靈活性較差，另一方面需要在第一階段和第二階段之間調(diào)換培養(yǎng)基，總之所得胚胎的再生率還是很不夠的。
本發(fā)明涉及一項向日葵栽培品種的再生方法，比較簡單，且可導致胚芽具有改善移栽入土的再生能力。
更為特別地，本發(fā)明涉及一項從未成熟的胚胎出發(fā)進行向日葵栽培品種的再生方法，它包括以下幾個階段-從細胞或組織出發(fā)通過在一種含有激素的誘導培養(yǎng)基中的培養(yǎng)而使胚胎發(fā)生的胼胝體形成的第一階段;
-胚胎發(fā)生的胼胝體培養(yǎng)的第二階段，以便其在一種含有激素的培養(yǎng)基中生長、發(fā)育和發(fā)芽;
-可能還有一個第三階段，包括使植株生長和發(fā)育的培養(yǎng);其特征在于;頭兩個階段是在同樣性質(zhì)的一種培養(yǎng)基中進行，且這種培養(yǎng)基含有一有效量的一種細胞激動素型的激素，而不含有植物生長激素。
下述說明中，百分比以重量，體積表示之，明確規(guī)定的例外。
植物組織(從中可為體細胞胚胎的生產(chǎn)提取活的植物組織)基本上來自在選擇程序中所使用的向日葵的栽培品種Helicnthus connuus。舉例說明是使用了以下8個栽培品種HA89、HA290 HA291、HA300、HA303、T76、RT26和Giant Gray Stripe(巨灰條紋)。品種HA89來自Dode Counts(達德地區(qū))佛羅里達州，品種HA290、HA291、HA300、HA303、T76和RT26是來自國際種子技術公司(Seed tec.Internatianal Inc.，伍德蘭，加利福尼亞州)，以及品種Gicnt Gray Slripe是來自北魯帕金種子公司(Northyus King Seeds.弗雷斯諾，加利福民亞州)。
活的植物組織是來自暖房栽培的植株，并經(jīng)受受控授精。對于胼胝體的產(chǎn)生來說，優(yōu)選的活植物組織是未成熟的胚胎。帶果皮的未成熟胚胎是從向日葵的頭狀花序上分離的，當后者為4～21日齡時;其尺寸一般包括在0.1～5毫米之間。具有大尺寸的未成熟胚胎可按照通過微胚芽根軸的平面被切割成數(shù)個相等部份，這就從一個孤單胚胎出發(fā)獲得倍增數(shù)量的無性繁植系。
根據(jù)本發(fā)明的方法是按以下方式實行的向日葵品種HA89、HA290、HA291、HA300、HA303、T76、RT26和Giant Gray Stripe是在暖房內(nèi)(26℃，40，000勒克司，光周期為每日15小時)栽培的，并經(jīng)受受控授精。未成熟的胚胎在傳粉后4～21天中采取。從頭狀花序中取下的種子是通過在添加有數(shù)滴潤濕劑的3°Cl的市售次氯酸鈉(或鉀)消毒液中浸漬20分種來進行滅菌的，然后用無菌蒸餾水洗滌3次。接著，胚胎在無菌條件下進行分離，或許還要切割，以及置放在所述胚胎誘導的第一培養(yǎng)基上。
第一培養(yǎng)基包括無機鹽類、維生素類、氨基酸類、蔗糖和為胼胝體形成所需的足夠量的一種激素。無機鹽類包括常量元素的鹽類和痕量元素的鹽類。在此第一培養(yǎng)基中所使用的常量元素可在例如以下化合物中進行選擇硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硝酸鉀和硝酸銨。痕量元素為基的鹽類，我們可列舉如硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、碘化鉀、以及鐵-Na-EDTA(乙二胺四乙酸)的螯合物。這種無機鹽類的組合為眾所周知的叫做穆拉希格和斯庫格(MS)的培養(yǎng)基。
對于1升培養(yǎng)基來說，常量元素和痕量元素的優(yōu)選量如下-370毫克的硫酸鎂七水合物，-440毫克的氯化鈣二水合物，-170毫克的磷酸二氫鉀二水合物，-1900毫克的硝酸鉀，-1650毫克的硝酸銨，-6.2毫克的硼酸，-22.3毫克的硫酸錳四水合物，-8.6毫克的硫酸鋅七水合物，-0.25毫克的鉬酸鈉二水合物，-0.025毫克的硫酸銅五水合物，-0.025毫克的氯化鈷六水合物，
-0.83毫克的碘化鉀，-36.7毫克的鐵-Na-EDTA螯合物。
第一培養(yǎng)基還含有維生素類，諸如煙酸、硫胺素(維生素B)、吡哆醇(維生素B)、肌醇以及一種氨基酸，諸如丙氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、色氨酸、半胱氨酸，以及較好地為甘氨酸。對于1升的培養(yǎng)基來說，維生素類和氨基酸類的優(yōu)選量如下-0.5毫克的煙酸，-0.1毫克的硫胺素鹽酸，-0.5毫克的吡哆醇鹽酸，-100毫克的肌醇，-2毫克的甘氨酸。
第一培養(yǎng)基同時可含有維生素類和氨基酸類的增補量;此增補量對于體細胞胚胎的形成來說并不是必不可少的，但它能增加體細胞胚胎形成的頻率。對于1升的培養(yǎng)基來說，在此可能性中，維生素類和氨基酸類的優(yōu)選量如下-0.5毫克的煙酸，-0.1毫克的硫胺素鹽酸，-0.5毫克的吡哆醇鹽酸，-4000毫克的肌醇，-1000毫克的L-丙氨酸，-800毫克的L-谷氨酰胺，-160毫克的L-絲氨酸，-50毫克的L-色氨酸，-10毫克的L-半胱氨酸，-2毫克的甘氨酸。
在第一培養(yǎng)基中所含的蔗糖是按照8～12%(較好地為9%)出現(xiàn)的。
第一培養(yǎng)基的激素(其選擇是本發(fā)明的一個特征)是細胞激動素型的，例如激動素或6-芐氨基嘌呤，且以后者為較好。一般地說，每升培養(yǎng)基含有0.5～1毫克的激素量是合適的。一種瓊脂(如Phytagar或Gelrite)是用于使培養(yǎng)基成為固態(tài)。對于Phytagar來說0.6%的最終濃度或?qū)τ贕elrite來說0.3%的最終濃度可給出良好的結(jié)果。培養(yǎng)基的pH值可在5.0～6.3之間變化，且較好地為5.0。
培養(yǎng)基在高壓滅菌器內(nèi)進行滅菌，除了激素類是在微孔膜上借助過濾法進行滅菌的。
未成熟的胚胎，如以上所述那樣進行分離的，是置放地第一培養(yǎng)基上，且在黑暗中于26℃下培養(yǎng)約2～3周。在此期間，合子胚胎發(fā)育以及體細胞胚胎出現(xiàn)在胚軸水平和在子葉的內(nèi)表面上(在HA291栽培品種的情況下)之后，可分離體細胞胚胎，并將體細胞胚胎放在所謂胚芽生長培養(yǎng)基的第二培養(yǎng)基中。胚胎發(fā)生的胼胝體或分離的胚胎是在第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3周，溫度26℃，光照為1500勒克司，使用光周期為10～16小時/天，較好地為16/小時/天。在此期間，胚胎萌發(fā)以及形成的胚芽或許還有根部發(fā)育。
第二培養(yǎng)基(如同第一種培養(yǎng)基)含有無機鹽類、維生素類，一種氨基酸，一些蔗糖和一種激素。無機鹽類包括常量元素的鹽類和痕量元素的鹽類。常量元素、痕量元素、維生素類以及氨基酸是同在第一種培養(yǎng)基中一樣的，按同等的濃度而無補量。蔗糖是按低于第一種培養(yǎng)基的優(yōu)選量(例如2～4%，較好地為3%)而出現(xiàn)的。所用的激素是一種細胞激動素，較好地是與第一培養(yǎng)基的激素是同樣的(但可以是與之不同的)，優(yōu)選6-芐氨基嘌呤。一般0.1～0.5毫克/升的量是合適的。一種瓊脂(如Phytagar或Gelrite)是用于使培養(yǎng)基成為固態(tài)。對于Phytagar來說0.6%的最終濃度以及對于Gelrite來說0.3%的最終濃度能給出良好的結(jié)果。培養(yǎng)基如前述那樣進行滅菌，所具pH值為5.0～6.3，較好地為pH＝5.0。
經(jīng)過在第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3周之后，分離的體細胞胚胎已萌發(fā)，并轉(zhuǎn)化成2～5厘米的胚芽。已發(fā)育了根部的胚芽可以轉(zhuǎn)移植入土中，(放在含有泥炭、蛭石、細砂的一種滅菌混合物(3∶2∶1)的Jiffy罐內(nèi))。Jiffy-罐是放置在一個裝有滿濕砂的袋內(nèi)，在它的上面復蓋著一個透明的聚乙烯袋以保持其高濕度。然后再把它們整個地放入15℃(600勒克司)的人工氣候室內(nèi)，使用的光周期為12～16小時/天，較好地為15小時/天。經(jīng)10天之后，將植株轉(zhuǎn)移進較大的罐內(nèi)，并在暖房內(nèi)(26℃40，000勒克司)栽培，使用的光周期為12～16小時/天，較好地為15小時/天。
根部尚未發(fā)育的植株上按照一項傳統(tǒng)方法可以嫁接在暖房栽培的年輕植株上[參見，例如，Habermann和Wallace，美國植物學雜志(Amer.J.Bot.，1958，45，479)]，或者轉(zhuǎn)移到一種生根培養(yǎng)基上，或三種培養(yǎng)基上，為期10～20天。
第三培養(yǎng)基包括無機鹽類、維生素類和一些蔗糖。無機鹽類包括常量元素的鹽類和痕量元素的鹽類。在第三種培養(yǎng)基中所使用的常量元素可以在以下化合物中進行選擇硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鈉、硝酸鉀以及硫酸銨。在痕量元素為基的鹽類中，我們可列舉如硼酸、硫酸鎂、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、碘化鉀和鐵-Na-EDTA的螯合物。這種無機鹽類的組合叫做B5為眾所周知的。對于1升培養(yǎng)基來說，常量元素和痕量元素的優(yōu)選量如下-250毫克的硫酸鎂七水合物，-150毫克的氯化鈣二水合物，-169毫克的磷酸二氫鈉一水合物，
-3000毫克的硝酸鉀，-3毫克的硼酸，-13.2毫克的硫酸錳四水合物，-2毫克的硫酸鋅七水合物，-0.25毫克的鉬酸鈉二水合物，-0.025毫克的硫酸銅五水合物，-0.025毫克的氯化鈷六水合物，-0.75毫克的碘化鉀，-40毫克的鐵-Na-EDTA的螯合物第三培養(yǎng)基也含有維生素類。它們是煙酸、硫胺素、吡哆醇和肌醇。對于1升的培養(yǎng)基來說，維生素類的優(yōu)選量如下-1毫克的煙酸，-10毫克的硫酸胺素鹽酸，-1毫克的吡哆醇鹽酸，-100毫克的肌醇。
第三培養(yǎng)基同時含有一些蔗糖以及活性碳/或一種植物生長素型的激素。蔗糖是按照例如1～2%(較好地為1%)以及活性碳是按照0.1%而出現(xiàn)的。如果樂于使用一種激素來代替活性碳，我們將選用3-吲哚基酸，劑量為0.1～0.2毫克/升。一種瓊脂(例如Phyager或Gedyite)是用于使培養(yǎng)基變成固態(tài)。對于Phyager來說0.5%的最終濃度以及對于Gedyite來說0.25%的最終濃度是足夠的。培養(yǎng)基的pH值可在5.0～6.0之間變化，較好地為5.0。培養(yǎng)基是用高壓滅菌進行滅菌的。
植株是在此培養(yǎng)基上進行栽培的，歷時2～3周(26℃和1500勒克司光照下)，使用的光周期為12～16小時/天，且較好地為16小時/天。此時，植株形成了根部，從而可以轉(zhuǎn)移入土中。
通過此方法所得的植株在表型上可以不同于起始材料，這是由于試管內(nèi)應激。植株以手工傳粉，并保存到收獲種子為止。其中對某些種子進行栽培以便對向日葵新植株進行分析以及選擇引人注目的可能得到的突變種，(它是結(jié)合在品種選擇程序中的)。
本發(fā)明將以更完整的但非限制性的方式在以下實例中進行描述。實例Ⅰ-母液的制備。
a)B5母液把一小袋流動實驗室(Flow Laboyatoyies)的無蔗糖B5培養(yǎng)基(含有B5無機鹽類、1毫克的煙酸、1毫克的吡哆醇鹽酸、10毫克的硫胺素鹽酸和100毫克的肌醇，具有最終濃度)溶解在1000毫升(最終容積)的去離子的蒸餾水中，制備得10倍濃縮的B5母液。將該分成100毫升的整除部分，并保存于-20℃b)BAP母液把100毫克的6-芐氨基嘌呤溶解在數(shù)毫升0.15N的鹽酸中，輕微加熱，并用去離子的蒸餾水稀釋至100毫升，而制得1克/升濃度的BAP溶液。此溶液在加入于第一和第二培養(yǎng)基之前，通過在一種0.2微米(Sartorius)的Minisart NML膜上進行過濾而滅菌。
c)AIA母液把20毫克的3-吲哚基乙酸溶解在數(shù)毫升的純乙醇中，并用去離子的蒸餾水稀釋至100毫升，制備成濃度為0.2克/升的AIA溶液。此溶液在加入于第三培養(yǎng)基之前，通過在一種0.2微米(Sartorius)的Minisart NML膜上進行過濾而滅菌。
d)維生素類的氨基酸類補充液根據(jù)錢德勒(Chandler)和比爾德(Beard)[作物科學(Crop.Sci.，1983，23，1004)]把39克的肌醇、10克的L-丙氨酸、8克的L-谷氨酰胺、1.6克的L-絲氨酸、0.5克的L-色氨酸和0.1克的L-半胱氨酸全部溶解在500毫升(最終容積)的去離子的蒸餾水中，制備成20倍濃縮的維生素類和氨基酸類的母液。該母液分成為50毫升的整除部分，并保存于-20℃。
實例Ⅱ-培養(yǎng)基的制備a)第一培養(yǎng)基或胚胎誘導培養(yǎng)基它是通過把一小袋流動實驗室(Flow Laboratories)的無蔗糖穆拉希格和斯庫格(MS)的培養(yǎng)基(含有MS的無機鹽類、0.1毫克的硫胺素鹽酸、0.5毫克的煙酸、0.5毫克的吡哆醇鹽酸、2毫克的甘氨酸和100毫克的肌醇)和90～120克的蔗糖溶解在去離子的蒸餾水中而制備的。在可能添加50毫升的維生素類和氨基酸類補充液之后，pH值用0.1N蘇打調(diào)節(jié)至5.0，使容積達到1升，并在添加6克的phytagar(Gibco)或3克的Gelrie(kelco)瓊脂之后，混合物在120psi(磅/英寸2)下經(jīng)受高壓滅菌20分鐘。當培養(yǎng)基有點溫熱時，將0.5～1毫升的如上描述的經(jīng)滅菌的BAP溶液(2.2～4.4微摩爾)加進培養(yǎng)基中。接著，把混合物傾注入陪替氏培養(yǎng)皿中。
b)第二培養(yǎng)基或胚芽生長培養(yǎng)基第二培養(yǎng)基是按照第一培養(yǎng)基同樣的方法進行制備的，即把一小袋的培養(yǎng)基MS、30克的蔗糖和6克的phytagar瓊脂或3克的Gelrite瓊脂全部溶解在1升水中并在經(jīng)過高壓滅菌器后，增添0.1～0.5毫升的無菌BAP溶液(0.44～2.2微摩爾)。該培養(yǎng)基被傾注入普氏培養(yǎng)皿(Flow Laboratories)中。
c)第三培養(yǎng)基或生根培養(yǎng)基把在100毫升B5母液中的10～20克的蔗糖增添入去離子的蒸餾水中，制備成第三培養(yǎng)基。其pH值是通過0.1N蘇打而調(diào)節(jié)到5.0，然后使容積達到1升，并向混合物添加5克的Phytagar瓊脂和1克的活性碳。在經(jīng)過高壓滅菌器之后，將培養(yǎng)基注入馬氏罐(Mason jars)中。如果希望利用含有AIA的一種第三培養(yǎng)基，則在制備第三培養(yǎng)基時，省掉活性碳。在經(jīng)過高壓滅菌器之后，向溫和的培養(yǎng)基中增添0.5～1毫升的無菌AIA溶液(0.5～1.14微摩爾)。將培養(yǎng)基按上述同樣的方法注入馬氏罐中。
第三培養(yǎng)基的一種變體液僅僅包括B5無機鹽類和1%的蔗糖(pH值為5.0)，根據(jù)錢德勒(Chandler)和比爾德(Beard)所描述的方法[作物科學(Crop.Sci.，1983，23，1004)]，將混合物按每份10毫升分配在含有濾紙橋的玻璃管內(nèi)，然后通過高壓滅菌器。
實例Ⅲ帶果皮的未成熟胚胎是從向日葵(Helianthus anwws，Var.T 76 B)的頭狀花序分離出來，當它們達到0.5～1.5毫米時。種子在3°Cl(氯量測定度)的次氯酸鈉(或鉀)消毒液中進行滅菌20分鐘，并以蒸餾水洗滌之。未成熟的胚胎與其胞質(zhì)鞘(被膜)分離，并放置于陪替氏培養(yǎng)皿內(nèi)第一培養(yǎng)基上。第一培養(yǎng)基是按上述方法用90克/升的蔗糖和0.5毫克/升的BAP(2.2微摩爾)進行制備的。
陪替氏培養(yǎng)皿是在黑暗中濕育3周以便誘導體細胞胚胎的形成。
在此階段，開始萌發(fā)的體細胞胚胎是與含子胚胎分離的，并放置于第二培養(yǎng)基上(在普氏培養(yǎng)皿內(nèi))。如上所述那樣制備的第二培養(yǎng)基含有0.1毫克/升的BAP，即0.44微摩爾。胚胎在光照下培育3周，且分化成胚芽。
接著，將高度為2～5厘米的胚芽轉(zhuǎn)移到第三培養(yǎng)基上以促使根部的形成。如前文所述那樣制備的第三培養(yǎng)基較好地含有10克的蔗糖。在膠凝化培養(yǎng)基的場合下，1克/升的活性碳的添加消除了由前一培養(yǎng)基提供的BAP的殘留影響[馬埃訥(Maene)和德培爾格(Debergh)，植物細胞組織器官培養(yǎng)(Plant Cell TissueOrgan Culture，1985，5 23～33)]，且有利于根部的迅速生長。約經(jīng)2周之后，胚芽可以轉(zhuǎn)移入土。
如果胚芽已開始在第二培養(yǎng)基上發(fā)育根部，根據(jù)錢德勒(Chandler)和比爾德(Beard)所敘述的技術[作物科學(Crop.Sci.，1983，23，1004)]它們可與液體的第三培養(yǎng)基接觸這種處置可使根系得到大量發(fā)育，并避免在遷移入土時傷害根部。
實例Ⅳ向日葵(Helianthus anmws，var，HA 89)的未成熟胚胎達到0.1～0.5毫米時被提取，并帶著內(nèi)胚乳放置于第一培養(yǎng)基上。第一培養(yǎng)基每升含有90克的蔗糖和0.5毫克的BAP(即2.2微摩爾)。經(jīng)在黑暗下3周之后，體細胞胚胎被分離和放置于新鮮的第一培養(yǎng)基上，始終是處于黑暗之下。次級體細胞就在分離的胚胎上形成。在黑暗下經(jīng)3周之后，次級體細胞胚胎被分離，且置于第二培養(yǎng)基上。第二培養(yǎng)基每升含有30克的蔗糖和0.1毫克的BAP(即0.44微摩爾)。
接著可把即將發(fā)育的胚芽，轉(zhuǎn)移到第三培養(yǎng)基上(液體的或膠凝化的)以便生根。然后，將其遷移入土中。
實例Ⅴ向日葵(Helcanthus annuus，var.HA89)的未成熟胚胎在授粉后21天時提取;它們具有5毫米的尺寸。它們與其胞質(zhì)鞘(被膜)分離，以及在放置于第一培養(yǎng)基上之前，按它們之間彼此垂直且平行于胚芽-胚根軸的兩個平面縱向地把未成熟的胚胎切割成四等份。在此情況下，第一培養(yǎng)基每升含有90克的蔗糖和1毫克的BAP。經(jīng)3周處于黑暗下之后，體細胞胚胎被分離并置放在第二培養(yǎng)基上。第二培養(yǎng)基每升含有30克的蔗糖和0.5毫克的BAP。
然后把即將發(fā)育的胚芽轉(zhuǎn)移到第三培養(yǎng)基上(液體的或膠凝化的)以便生根，接著，遷移入土。尚未發(fā)根的胚芽可嫁接在新生的植物株上，這是根據(jù)哈培爾曼(Habormaun)和弗拉斯(Wallace)闡述的[美國植物學雜志(Amer.J.Bot.，1958，45，479)]方法。
實例6-27以下實例給出組合的不完整概念，我們可以利用所描述的各種不同的方式來實行。
＊改性的培養(yǎng)基MS每升含有600毫克的氯化鈣＝水合物、1260毫克的碳酸鉀、1100毫克的碳酸銨和250毫克的肌醇。其他元素保持不變。
＊＊補充的培養(yǎng)基MSIIISA＝固體的培養(yǎng)基+III+AIA(0.1毫克/升或0.2毫克/升IIISC＝固體的培養(yǎng)基III+活性碳IIIL＝液體的培養(yǎng)基III
權利要求
1.從細胞或組織出發(fā)通過體細胞胚胎發(fā)生法使向日葵的栽培品種(Helianthus annuus)再生的方法相繼地包括-在一誘導培養(yǎng)基(它含有一種激素以使胚胎發(fā)生胼胝體和細胞胚胎的形成以及所述胚胎的生長)中向日葵組織的培養(yǎng)階段；-包括一項能使所述胚胎萌發(fā)及發(fā)育成可能具有根部的植株(在所謂胚芽生長培養(yǎng)基上)的培養(yǎng)的一個第二階段。-可能還有一個在所謂生根培養(yǎng)基上使所述植株的根部生長或形成的第三階段；其特征在于頭兩個階段是在一種同一性質(zhì)的培養(yǎng)基上實行的，以及其特征在于此培養(yǎng)基含有一種有效量的細胞激動素型激素。
2.根據(jù)權利要求
1的方法，其特征在于所述組織是未成熟的胚胎。
3.根據(jù)權利要求
1和2之一的方法，其特征在于激素是從包括激動素、6-芐氨基嘌呤、2-異戊基腺嘌呤和玉米素(N6-異戊烯腺嘌呤)的組中選擇的。
4.根據(jù)權利要求
3的方法，其特征在于激素是6-芐氨基嘌呤，其濃度在第一和第二培養(yǎng)基中為0.1～8微摩爾。
5.根據(jù)權利要求
1～4之一的方法，其特征在于6-芐氨基嘌呤的濃度在第一培養(yǎng)基中為2.2～4.4微摩爾，以及在第二培養(yǎng)基中為0.44～4.4微摩爾。
6.根據(jù)權利要求
1～5之一的方法，其特征在于頭兩種培養(yǎng)基含有蔗糖，在第一培養(yǎng)基中其濃度為8～12%和在第二培養(yǎng)基中其濃度為2～4%。
7.根據(jù)權利要求
6的方法，其特征在于蔗糖的濃度在第一培養(yǎng)基中是90%以及在第二培養(yǎng)基中是3%。
8.根據(jù)權利要求
1～7之一的方法，其特征在于使用穆拉希格和斯庫格(MS)型一種培養(yǎng)基作為第一培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權利要求
1～7之一的方法，其特征在于使用含有維生素類和氨基酸類補充液的一種穆拉希格和斯庫格(MS)型培養(yǎng)基作為第一培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權利要求
1～9之一的方法，其特征在于第二培養(yǎng)基含有無機鹽類、維生素類和一種氨基酸(其量相同于第一培養(yǎng)基的量，而無維生素和氨基酸類的補充)。
11.根據(jù)權利要求
1～10之一的方法，其特征在于對育齡為4～21天，尺寸包括在0.1～5毫米之間的未成熟胚胎進行培養(yǎng)，且可將所述胚胎切割成可再生的數(shù)個片段。
12.根據(jù)權利要求
1～11之一的方法，其特征在于使用向日葵栽培品種T76、RT26、HA89、HA290、HA291、HA300、HA303或Giant Gray Stripe。
13.根據(jù)權利要求
1和12的方法，其特征在于第二階段之后，對所提植株是進行根部誘導培養(yǎng)。
14.根據(jù)權利要求
1～12之一的方法，其特征在于在第二階段之后，持有根部的植株被遷移入土，并培育于15℃的人工氣候室內(nèi)，所使用的具光強度為6.000勒克司，光周期為每天15小時。
15.根據(jù)權利要求
1～12之一的方法，其特征在于在第二階段之后，對所得植株進行嫁接。
16.通過根據(jù)權利要求
1～15之一的方法所產(chǎn)生的一種向日葵植株。
17.根據(jù)權項要求16，由向日葵植株所產(chǎn)生的種子。
專利摘要
從未成熟胚胎出發(fā)的栽培品種再生的方法。它包括三個階段
文檔編號C12N5/10GK87107542SQ87107542
公開日1988年6月29日 申請日期1987年10月30日
發(fā)明者喬治·弗雷西內(nèi), 馬蒂娜·弗雷西內(nèi) 申請人:羅納-普朗克農(nóng)業(yè)化學公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan