專(zhuān)利名稱(chēng):棉株及其株系的遺傳工程的制作方法
本發(fā)明涉及植物遺傳工程的一般技術(shù)，特別涉及一種用植物遺傳轉(zhuǎn)化的土壤桿菌法來(lái)轉(zhuǎn)化和再生棉(Gossypium hirsutum L.)株，以產(chǎn)生新穎的遺傳轉(zhuǎn)化的棉株及其株系的對(duì)策。
從事于植物生物工藝領(lǐng)域的許多科學(xué)家們的總目標(biāo)是使用遺傳方法來(lái)成功地設(shè)計(jì)各種品種優(yōu)良的作物。雖然植物遺傳工程已在一些典型物種中成功地進(jìn)行了驗(yàn)證，但諸如煙草、胡蘿卜和矮牽牛之類(lèi)的典型物種往往并不是經(jīng)濟(jì)上最重要的農(nóng)用植物物種。因此，人們針對(duì)農(nóng)業(yè)上較為重要的植物物種的遺傳工程工作了大量努力。本文所用的“遺傳工程”術(shù)語(yǔ)系指將外來(lái)基因，通常為嵌合基因，引入一個(gè)或一個(gè)以上的植物細(xì)胞中，而這些植物細(xì)胞能被再生成為性成熟的，且能發(fā)芽的整株植物。這種植物可自花傳粉，或用同樣物種的其他植物進(jìn)行異花傳粉。由此，在種系中攜帶的外來(lái)基因能被嵌入或培育成農(nóng)業(yè)上實(shí)用的植物品種。
植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為一個(gè)十分活躍的研究領(lǐng)域已有多年了，但在過(guò)去的5至10年中，大量的科學(xué)工作系致力于研究諸如玉米、小麥、稻、大豆和棉花之類(lèi)重要農(nóng)業(yè)作物的可再生的植物組織培養(yǎng)方法。
有關(guān)棉花組織培養(yǎng)的早期出版物主要涉及在體外無(wú)菌條件下產(chǎn)生取自植物的生長(zhǎng)組織[Davis，D.G.et al.In Vitro 9395-398(1974);Rani，A.and S.S.Bhojwani，Plant Sci.Lett.7163-169(1976);and Price，H.J.et al.，Plant Sci.Lett.10;115-119(1977)]。然而，在這些出版物中詳述的方法并不提供使細(xì)胞再生成為整株植物所需的必要的骨架。
本世紀(jì)七十年代后期，報(bào)道了體細(xì)胞胚，亦即從取自野生棉花物種G.Klotzchianum的非配子組織或體細(xì)胞組織中得到的胚的研究進(jìn)展情況[Price，H.J.and R.H.Smith，Planta 145305-307(1979)]。令人遺憾的是，采用這一報(bào)道的方法，存在兩個(gè)難以克服的重大問(wèn)題。首先，即使再經(jīng)幾年研究，這些研究者仍然不能誘發(fā)體細(xì)胞發(fā)芽，也就是說(shuō)不能使之轉(zhuǎn)化，而產(chǎn)生整株植物(Finer，J.J.and R.H.Smith，Plant Cell Rep.341-43，1984)。其次，同樣的技術(shù)不能用栽培的棉花作為植物組織的來(lái)源而成功地得以重復(fù)。
戴維多涅斯(Davidonis)和漢密爾頓(Hamilton)首先發(fā)表了從棉花體細(xì)胞胚成功地再生成整株植物的報(bào)道[Davidonis，G.H.and R.H.Hamilton，Plant Sci.Lett.3289-93(1984)]。這些實(shí)驗(yàn)者使用Coker 310栽培品種的未成熟子葉組織。所用的基本培養(yǎng)基由Linsmaier和Skoog(LS)鹽、維生素、植物激素NAA和激動(dòng)素組成[E.M.and F.Skoog，Physiol.Plant.18100-127(1965)]。若干年來(lái)，上述報(bào)道中所用的組織一直被用于培養(yǎng)，但并未發(fā)現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果的報(bào)道，而且重復(fù)這一過(guò)程所必需的確切方法仍然未廣泛地為人們所知。
同一年，雷根等[Rangan，T.S.et al.，In Vitro 20256(1984)]報(bào)道了一些不同的加利福尼亞棉花栽培品種的植物再生，其原始實(shí)驗(yàn)記錄充分表明，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)期內(nèi)，作者可使之重復(fù)出現(xiàn)。在它們的方法中，諸如子葉、未成熟的胚和胚軸組織之類(lèi)的幾種組織在添加了植物激素NAA和激動(dòng)素的Murashige和Skoog(MS)培養(yǎng)基[Murashige，T.and F.Skoog，Physiol.Plant.15473-497，1962]中進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)3至4個(gè)月的培養(yǎng)后，這些組織產(chǎn)生了胚發(fā)生愈傷組織和體細(xì)胞胚。然后將胚移入加有水解酪蛋白的Beasley和Ting(BT)培養(yǎng)基(Beasley，C.A.and I.P.Ting，Amer.J.Bot.60130-139，1973)之類(lèi)的低鹽培養(yǎng)基中，以使它們之中的一些發(fā)芽，并生長(zhǎng)成為整株植物。使用Acala S J-5栽培品種重新獲得約200株植物。植物中的一些不育性已被觀(guān)察到，僅有2%植物顯現(xiàn)出體細(xì)胞無(wú)性變異。
使用Coker株系312和稱(chēng)為T(mén)25的Texas原種時(shí)已觀(guān)察到體細(xì)胞胚發(fā)生[Robacker，D.C.and T.W.Zimmerma，In the Ann.Mtg.of the American Society of Agronomy，November 25-30，Las Vegas，NV.P.85(1984)]所用的基本培養(yǎng)基由MS鹽、環(huán)己六醇和硫胺素類(lèi)維生素、蔗糖、植物激素NAA，2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和激動(dòng)素配制而成。胚軸被用作原始組織來(lái)源。盡管胚被復(fù)原，并在BT培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，但并未復(fù)原成整株植物。
其他研究者也報(bào)道了體細(xì)胞胚發(fā)生和植物再生現(xiàn)象(Trolinder，N.L.and J.R.Goodin，In the Proc.of the Beltwide Cotton Production Research Conferences，January 6-11，1985，New Orleans，LA.P.46;and Mitten，D.H.In the Proc.of the Beltwide Cotton Production Research Conferences，January 6-11，1985，NewOrleans，LA.P.57-58)。這些方法未詳細(xì)發(fā)表，但在其介紹的基礎(chǔ)上，收集到足夠的資料，以至一些論文開(kāi)始涌現(xiàn)出來(lái)。某研究人員使用Coker 310栽培品種的未成熟胚和胚軸組織在加有植物激素NAA和2iP(或激動(dòng)素)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，由此獲得體細(xì)胞胚發(fā)生。雖然體細(xì)胞胚發(fā)生的跡象十分清楚，但從這些培養(yǎng)物中復(fù)原整株植物的跡象并不明顯。其他實(shí)驗(yàn)者也提供了清楚和簡(jiǎn)明的原始實(shí)驗(yàn)記錄，顯示了完整植物復(fù)原的重視性。盡管他們能得到一些不同株系的體細(xì)胞胚，但最好的栽培品種屬于Coker系譜的株系5110和312，以及一種Taxas原種T25。其他栽培品種則不能完成再生過(guò)程，亦即不能轉(zhuǎn)化成整株植物，或者不能形成成熟的體細(xì)胞胚。他們的實(shí)驗(yàn)基本上都使用MS培養(yǎng)基、維生素B5、植物激素2，4-D和激動(dòng)素。
這些研究者始終將目標(biāo)集中在體細(xì)胞非轉(zhuǎn)化棉組織的植物再生上，但針對(duì)用遺傳來(lái)設(shè)計(jì)植物株系的對(duì)策通常都涉及二個(gè)互補(bǔ)過(guò)程。第一個(gè)過(guò)程涉及一種或一種以上特定類(lèi)型植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化。所謂轉(zhuǎn)化是指將外來(lái)基因(一般是嵌合基因結(jié)構(gòu))引入各植物細(xì)胞的基因組中，而這種轉(zhuǎn)化往往借助于一種能將有關(guān)基因轉(zhuǎn)化到培養(yǎng)物中植物細(xì)胞基因組內(nèi)的載體而完成的。然后第二個(gè)過(guò)程涉及將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成為整株性成熟的植物。轉(zhuǎn)化或再生過(guò)程均不必百分之百成功，但必須有較好的可靠性和再生性，以至有相當(dāng)百分?jǐn)?shù)的細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化或再生成整株植物。
轉(zhuǎn)化和再生這二個(gè)過(guò)程必須互補(bǔ)。上述研究者證明，可以轉(zhuǎn)化某些不能被再生的組織或細(xì)胞類(lèi)型，而且也可能將尚未被成功地轉(zhuǎn)化的一些不同組織和細(xì)胞類(lèi)型的植物組織進(jìn)行再生。這兩個(gè)過(guò)程的互補(bǔ)性必須是這樣的，即欲被轉(zhuǎn)化過(guò)程成功地進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的組織必須是同一種類(lèi)和同一特性，而且必須十分正常，充分地合格和具有足夠生命力，因而它們能被成功地再生成整株植物。
在已有技術(shù)中已證明了對(duì)于其他植物物種成功的轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)。例如“Barton et al.，“Regeneration of Intact Tobacco Plants Containing Full-Length Copies of Genetically Engineered T-DNA，and Transmission of DNA to R 1 Progeny”，Cell 321033(April 1983)”中報(bào)道了煙草植物的轉(zhuǎn)化和再生。在一些其他植物物種(但不是棉花)中已獲得了類(lèi)似結(jié)果。
雙子葉植物物種細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最常用方法涉及植物病原體Agrobacterium tumefaciens的使用。A.tumefaciens包含一個(gè)稱(chēng)之為誘導(dǎo)腫瘤的質(zhì)粒(或Ti質(zhì)粒)，該質(zhì)粒具備一種固有的能力，可將其自身的稱(chēng)之為T(mén)-DNA(轉(zhuǎn)化-DNA)的節(jié)段轉(zhuǎn)化成感染植物細(xì)胞的基因組。野生型A.tumefaciens利用此種能力來(lái)遺傳轉(zhuǎn)化植物的感染細(xì)胞，以致植物細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞，并合成一系列稱(chēng)為opines的化合物中的一種，后者通過(guò)感染A.tumefaciens，可產(chǎn)生代謝變化。一些研究者發(fā)現(xiàn)，通過(guò)從A.tumefaciens所包含的Ti質(zhì)粒中除去大部分T-DNA，并用外來(lái)基因結(jié)構(gòu)替換該T-DNA后，土壤桿菌便能轉(zhuǎn)化具有外來(lái)基因的感染植物細(xì)胞，以至最后所得到的細(xì)胞不是象通常用野生型A.tumefaciens感染的植物細(xì)胞那樣成腫瘤狀。于是，外來(lái)基因結(jié)構(gòu)被包含在從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生得到的整株植物的細(xì)胞中，其后以簡(jiǎn)單的Mendelin方式被遺傳。因此該結(jié)構(gòu)被看成作為育種用的遺傳性狀。
雖然以前已報(bào)道了從棉花體細(xì)胞胚中再生整株植物，但迄今人們并不認(rèn)為已有可能利用轉(zhuǎn)化/再生技術(shù)，通過(guò)遺傳方式產(chǎn)生完整的棉株。
鑒于以上所述，本發(fā)明的目的在于通過(guò)遺傳方式產(chǎn)生完整的棉株及其株系。
本發(fā)明進(jìn)一步目的是利用轉(zhuǎn)化/再生技術(shù)，通過(guò)遺傳方式達(dá)到整個(gè)棉株的產(chǎn)生。
本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是相繼利用土壤桿菌的基因轉(zhuǎn)化法和可重現(xiàn)的再生技術(shù)，以遺傳方式產(chǎn)生整個(gè)棉株。
上述和其他目的可通過(guò)以下所描述的本發(fā)明得以實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)物中棉花細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，以及使這些細(xì)胞再生成為完整的性成熟棉株。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，從未成熟棉株胚軸部分得到的組織可用A.tumefaciens培養(yǎng)物接種，且對(duì)誘發(fā)可再生的體細(xì)胞胚產(chǎn)生的能力無(wú)不利影響。通過(guò)使用選擇標(biāo)記物，可以在組織培養(yǎng)階段鑒別可再生組織的轉(zhuǎn)化克隆生長(zhǎng)，以獲得整株植物的產(chǎn)生。
簡(jiǎn)言之，這一方法包括下列步驟用A.tumefaciens菌株接種(或感染)未成熟棉株的胚軸塊;組織培養(yǎng)物平板接種感染組織;從感染組織中除去細(xì)菌，與此同時(shí)選出抗選擇標(biāo)記物的組織;擴(kuò)增抗性組織;最后再生成整株植物。
因此，本發(fā)明適用于通過(guò)將選出的外來(lái)基因嵌入棉花類(lèi)植物種系中的棉株及其株系的一般遺傳工程。
圖1是用限制酶標(biāo)記的植物載體質(zhì)粒pCMC92的示意圖;
圖2是用限制酶標(biāo)記的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pCMC1204的示意圖。
如上所述，按照本發(fā)明;以遺傳方式產(chǎn)生棉株及其株系的方法一般認(rèn)為可包括二個(gè)相關(guān)過(guò)程。第一個(gè)過(guò)程是通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)中的棉細(xì)胞或組織。第二個(gè)主要過(guò)程是從遺傳轉(zhuǎn)化細(xì)胞中再生完整的性成熟棉株。這兩個(gè)過(guò)程是相互關(guān)聯(lián)的，這就是在再生過(guò)程中被轉(zhuǎn)化的組織必須是同一種類(lèi)，且是合適的，以致能通過(guò)適當(dāng)?shù)脑偕^(guò)程得到再生。該方法期望能將發(fā)芽后4至6天的棉株上切下的胚軸分離塊所得到的組織在培養(yǎng)物中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。從胚軸部分得到的轉(zhuǎn)化組織能被誘發(fā)而形成此處稱(chēng)為體細(xì)胞胚的胚結(jié)構(gòu)，后者能被再生成比較正常的性成熟的完整棉株。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化技術(shù)系利用A.tumefaciens的Ti質(zhì)粒。在使用A.tumefaciens培養(yǎng)物作為轉(zhuǎn)化媒介物時(shí)，宜用土壤桿菌的非致癌菌株作為載體，從而使轉(zhuǎn)化組織的正常非致癌分化成為可能。為方便起見(jiàn)，在制備用以轉(zhuǎn)化成植物細(xì)胞的實(shí)際遺傳載體時(shí)，土壤桿菌最好能包含一個(gè)雙元Ti質(zhì)粒體系。在這種雙元體系中，土壤桿菌攜帶一個(gè)第一Ti質(zhì)粒和一個(gè)第二嵌合質(zhì)粒，前者包含一個(gè)內(nèi)在的毒性區(qū)，后者則內(nèi)含一個(gè)野生型Ti質(zhì)粒的T-DNA區(qū)的邊緣區(qū)，而該野生型Ti質(zhì)粒圍繞著包括一個(gè)有關(guān)外來(lái)基因的嵌合基因結(jié)構(gòu)。業(yè)已證明雙元Ti質(zhì)粒體系能有效地轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞[De Framond，Biotechnology，1262-269(1983);Hoekema et al.，Nature，303179(1983)]。這類(lèi)雙元體系是較佳的，因?yàn)樗琓-DNA邊緣區(qū)的較小質(zhì)粒，可在諸如大腸桿菌之類(lèi)的其他宿主中極其容易地形成和被利用，然后再轉(zhuǎn)化成土壤桿菌。為使引入棉細(xì)胞后隨之生效，包含有關(guān)外來(lái)基因的嵌合結(jié)構(gòu)除含有對(duì)有關(guān)產(chǎn)物進(jìn)行編碼的異型基因外，還必須包含一個(gè)啟動(dòng)區(qū)和一個(gè)多腺苷酸化順序或也能在棉細(xì)胞中被識(shí)別的轉(zhuǎn)錄控制順序，其中所說(shuō)啟動(dòng)區(qū)在棉細(xì)胞中能有效地引起有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。已知在棉細(xì)胞中有效的啟動(dòng)區(qū)包括從土壤桿菌的T-DNA中分離出的藍(lán)曙紅合酶啟動(dòng)區(qū)和花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)區(qū)。最好是包含有關(guān)外來(lái)基因的雙質(zhì)粒也內(nèi)含一個(gè)或一個(gè)以上的選擇標(biāo)記基因，從而可從培養(yǎng)物內(nèi)的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。較佳的標(biāo)記基因包括耐抗菌素的基因，以致可用合適的抗菌素從未被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中分離和選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
選擇用來(lái)嵌入棉花組織中的異型基因可以是所選出的在棉株中的表達(dá)達(dá)到有效結(jié)果的任何外來(lái)基因。例如，在棉株細(xì)胞中Bacillus thuringiensis晶體蛋白質(zhì)的表達(dá)，若一旦被Lepidoptera昆蟲(chóng)攝入，將會(huì)產(chǎn)生那些細(xì)胞毒素，由此使植物具有對(duì)蟲(chóng)害的有效低抗力。病毒外殼蛋白在棉株細(xì)胞中的表達(dá)將使植物能抵抗此種病毒的感染。在棉株細(xì)胞中負(fù)鏈RNA的轉(zhuǎn)錄可用于不希望有的內(nèi)源基因的抑制或疾病抵抗性狀。正如該技術(shù)領(lǐng)域：
熟練人員所理解的，此處的外來(lái)蛋白質(zhì)在棉株中的表達(dá)可以方便地用任何其他有關(guān)的外來(lái)基因重復(fù)。
在按照本發(fā)明著手進(jìn)行轉(zhuǎn)化過(guò)程時(shí)，首先必須形成有關(guān)的外來(lái)基因，并用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺鼈円胗修D(zhuǎn)化能力的，但非致癌的Agrobacterium tumefaciens菌株中。包含這類(lèi)有關(guān)的外來(lái)基因的載體之詳細(xì)結(jié)構(gòu)已為植物遺傳工程領(lǐng)域中的熟練人員所知，而且與以前已在煙草、矮牽牛和其他典型植物物種中證明是有效的載體在本質(zhì)上并無(wú)差別。外來(lái)基因顯然應(yīng)被選來(lái)在棉株細(xì)胞中達(dá)到某種所需的效應(yīng)。這種效應(yīng)可以是促進(jìn)生長(zhǎng)，抵抗疾病、植物形態(tài)學(xué)或植物產(chǎn)品(例如皮棉)質(zhì)量的變化，或者是可由基因控制而達(dá)到的任何其他變化。嵌合基因可進(jìn)行編碼，以表達(dá)一種或一種以上的外源蛋白質(zhì)，或者可引起負(fù)鏈RNA的轉(zhuǎn)錄，以控制或抑制病程，或不希望有的內(nèi)源性植物功能。
在開(kāi)始棉株的轉(zhuǎn)化和再生過(guò)程時(shí)，首先必須對(duì)棉籽表面進(jìn)行滅菌，以防止所產(chǎn)生的培養(yǎng)物因疏忽而受到污染。然后使棉籽在含有殺真菌劑的合適發(fā)芽培養(yǎng)基上發(fā)芽。
發(fā)芽后4至6天，取出未成熟植物的胚軸部分，并將其切成平均大小約為0.5厘米的小段。使胚軸分離塊在液態(tài)或瓊脂植物組織培養(yǎng)基中穩(wěn)定和保持生命力。
俟胚軸切片穩(wěn)定后，立即用有轉(zhuǎn)化能力的非致癌土壤桿菌的懸浮培養(yǎng)物對(duì)其接種。使接種過(guò)程在室溫，亦即24℃下進(jìn)行3至5天。
在接種期末，必須先清洗除去過(guò)量的土壤桿菌。然后將剩下的處理過(guò)的組織移入第二種瓊脂培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基亦含有一種或一種以上對(duì)土壤桿菌有毒，但對(duì)胚軸組織無(wú)毒的抗菌素，其濃度足以殺死殘留在培養(yǎng)物中的任何土壤桿菌。用于這類(lèi)培養(yǎng)基的合適抗菌素包括羧芐菁霉素和頭孢噻肟。用1至10天的時(shí)間使組織從轉(zhuǎn)化過(guò)程復(fù)原，然后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。
此時(shí)組織在組織培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，而該培養(yǎng)基除含有其正常組分外，還含有一種對(duì)未轉(zhuǎn)化的棉細(xì)胞有毒，但對(duì)已轉(zhuǎn)化的棉細(xì)胞無(wú)毒的選擇劑，其中轉(zhuǎn)化的棉細(xì)胞具有對(duì)選擇劑的遺傳抗性，并表達(dá)此種抗性。合適的組織培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其內(nèi)加有植物激素2，4-二氯苯氧基乙酸(2-4，D)，6-糠基氨基嘌呤和膠凝劑。合適的選擇劑包括抗菌素和除草劑?？勺鳛橹饕x擇標(biāo)記的合適抗菌素性狀包括(a)氨基苷磷酸轉(zhuǎn)移酶-3′-Ⅱ[APH-(3′)-Ⅱ]基因，也稱(chēng)作新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ基因(NPTⅡ)，它進(jìn)行編碼，以獲得對(duì)付卡那霉素抗菌素的抗性;(b)APH-(3′)-Ⅳ基因，它進(jìn)行編碼，以獲得對(duì)付潮霉素B的抗性。卡那霉素G418和潮霉素B是氨基苷，它們會(huì)停止未轉(zhuǎn)化棉細(xì)胞的生長(zhǎng)，但如果這些抗菌素在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中被表達(dá)，則可被合適的酶磷酸化。另一種合適的抗菌素選擇劑是氯霉素，它能被乙?；?，并可用CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因所產(chǎn)生的酶使之無(wú)毒性。配有抗菌素劑量的培養(yǎng)基僅使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞得以繼續(xù)生長(zhǎng)和茁?tīng)畛砷L(zhǎng)。因此，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或愈傷組織可在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。將殘存的轉(zhuǎn)化組織移入第二種培養(yǎng)基中，以誘發(fā)體細(xì)胞胚發(fā)生。這樣，存活的轉(zhuǎn)化組織將繼續(xù)形成體細(xì)胞胚，后者可通過(guò)本發(fā)明的再生技術(shù)或采用棉體細(xì)胞胚作為其起始點(diǎn)的其他植物再生實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行再生。
這些選擇過(guò)程應(yīng)持續(xù)一段時(shí)間，亦即2至4個(gè)月，其原因是甚至轉(zhuǎn)化組織在抗菌素培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)亦相當(dāng)緩慢。每隔4至6周配制次代培養(yǎng)物，以補(bǔ)充養(yǎng)分和抗菌素。由于轉(zhuǎn)化細(xì)胞被選擇和擴(kuò)增，逐一地得到的細(xì)胞株系是可以識(shí)別的，并能移出和分別進(jìn)行擴(kuò)增。
按照本發(fā)明，再生技術(shù)系從轉(zhuǎn)化過(guò)程所產(chǎn)生的組織開(kāi)始進(jìn)行。這些組織被認(rèn)為是已轉(zhuǎn)化的愈傷組織，當(dāng)其在合適的胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)能產(chǎn)生體細(xì)胞胚。本文揭示了一種將這些體細(xì)胞胚再生成為整株植物的技術(shù)，但應(yīng)明白，一經(jīng)產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生組織后，也可采用其他技術(shù)達(dá)到上述目的。
因而此處申請(qǐng)人所用的再生技術(shù)系從轉(zhuǎn)化過(guò)程所產(chǎn)生的組織開(kāi)始。從棉株胚軸切片中產(chǎn)生的，并被認(rèn)為已轉(zhuǎn)化的棉組織愈傷組織被直接放在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。此時(shí)應(yīng)將抗菌素選擇劑從培養(yǎng)基中除去，然而培養(yǎng)基中其他成分可以保持不變。這些在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織將形成稱(chēng)為體細(xì)胞胚的小型胚狀體結(jié)構(gòu)?？赡苄枰?至3個(gè)月才能使體細(xì)胞胚萌發(fā)和成熟。在由瓊脂配制的體細(xì)胞胚誘發(fā)培養(yǎng)基中，單個(gè)愈傷組織將會(huì)萌發(fā)大約5至20個(gè)體細(xì)胞胚。由此產(chǎn)生的許多體細(xì)胞胚將可按本文所描述的技術(shù)，再生成整株植物。
當(dāng)體細(xì)胞胚生長(zhǎng)到足夠大時(shí)，亦即達(dá)到4毫米或更長(zhǎng)時(shí)，而且若看來(lái)胚的生長(zhǎng)相當(dāng)好，即通常有一個(gè)子葉和一個(gè)胚根時(shí)，則可將它們移入大的試管中，并栽在純蛭石上。蛭石系用加有植物激素吲哚乙酸、6-糠基氨基嘌呤和青霉酸的Stewart和Hsu(SH)培養(yǎng)基[Planta 137113(1977)]浸漬至飽和。上述體細(xì)胞胚終于生長(zhǎng)成具有2至3片葉子的小植物。
小植物的生長(zhǎng)一經(jīng)形成，亦即2至3片葉子階段，便可將植物移入裝有蛭石土的培植盆中?？筛鶕?jù)需要澆水和施肥。也許要使之強(qiáng)壯后才能移入溫室。當(dāng)小植物有4至6片葉子后，可以換盤(pán)，此后它們將繼續(xù)生長(zhǎng)，直至成熟。
下述例子將用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的方法，但并不意味著對(duì)其進(jìn)行限制。
實(shí)施例1愈傷組織的轉(zhuǎn)化本實(shí)施例系用來(lái)說(shuō)明使用無(wú)毒和有毒的A.tumefaciens菌株對(duì)培養(yǎng)物中的棉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而所說(shuō)菌株帶有對(duì)標(biāo)記酶新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(NPTⅡ)(也稱(chēng)作APH-3′-Ⅱ)和/或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)編碼的質(zhì)粒。愈傷組織在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行7個(gè)月的擴(kuò)增。然后移出組織樣品，并測(cè)定其酶的表達(dá)，余下的組織用于DNA分析。本實(shí)施例詳細(xì)描述如下Coker株系310，312，5110 Deltapine 61和Stoneville 213的栽培棉(Gossypium hirsutum L.)籽用3%次氯酸鈉進(jìn)行20分鐘表面消毒。然后棉籽用加有頭孢噻肟(500毫克/升)的無(wú)菌蒸餾水清洗三次。接著使棉籽在含有苯菌靈殺真菌劑(50毫克/升)的SH培養(yǎng)基中發(fā)芽。發(fā)芽后4至6天，移出胚軸分離塊，將其切成0.5厘米的小塊，并置于含有瓊脂(0.8%)和水的支持培養(yǎng)基上。
然后用稀釋(1∶10)過(guò)夜的A.tumefaciens.培養(yǎng)物接種胚軸塊。每毫升A.tumefaciens懸浮培養(yǎng)物約含有108個(gè)細(xì)菌。
所用特定的A.tumefaciens菌株包含一個(gè)雙Ti質(zhì)粒體系，而該體系含有二個(gè)Ti質(zhì)粒，以及一個(gè)耐抗菌素的基因(NPTⅡ)，其中一個(gè)質(zhì)粒帶有所謂毒性區(qū)，另一個(gè)質(zhì)粒具有來(lái)自有毒Ti質(zhì)粒(pCMC91，pCMC92，或pCMC1204)的T-DNA邊緣區(qū)。一個(gè)質(zhì)粒(pCMC1204)也帶有一個(gè)位于T-DNA邊緣區(qū)之間的外來(lái)基因(CAT)。在室溫下，未成熟的胚組織用A.tumefaciens感染3至5天。
在室溫和照明下培育后，將組織移入Murashige和Skoog鹽中，鹽內(nèi)加有維生素B5[Gamborg et al.，Exp.Cell Res.50151-158(1986)]、抗菌素、植物激素2，4-D(0.1毫克/升)、6-糠基氨基嘌呤(0.1毫克/升)、Gelrite膠凝劑(1.6克/升)(Gelrite是加利福尼亞州圣地亞哥Kelco公司的注冊(cè)商標(biāo))和氯化鎂(750毫克/升)。用來(lái)殺死細(xì)菌的抗菌素是頭孢噻肟(50-100毫克/升)和羧芐青霉素(400-500毫克/升)。在培養(yǎng)基中含有作為選擇劑的硫酸卡那霉素(5-50毫克/升)。每隔4至6周配制次代培養(yǎng)物，以補(bǔ)充消耗的養(yǎng)分和抗菌素。
3至4個(gè)月后，將逐一得到的細(xì)胞系進(jìn)行標(biāo)記，并維持在選擇培養(yǎng)基上，以進(jìn)行組織擴(kuò)增。在30℃下對(duì)組織培育一個(gè)16小時(shí)的光周期(50-100微摩爾/平方米·秒)。
使用預(yù)先用緩沖液[30mM NaCl，15mM NH4Cl、3mM MgCl2、5.5mM Na EDTA，2.3mM Tris，0.2mM二硫蘇糖醇(DTT)，105mM蔗糖，pH為7)培育的愈傷組織或植物組織所制備的細(xì)胞粗提物進(jìn)行NPTⅡ測(cè)定。在液氮中經(jīng)過(guò)3次凍-融循環(huán)后，在含有37mM Na EDTA，126mM Na Cl，83mM NH4Cl，7.7mM Tris和15mM DTT的緩沖液中將組織磨碎。為防止NPTⅡ的蛋白酶降解，在緩沖液中添加2.5mM苯基甲基磺酰氟，0.6毫克/毫升亮肽素，1.05毫克/毫升的大豆胰蛋白酶抑制和5.0毫克/毫升牛血清白蛋白。每100毫克(新鮮重量)愈傷組織或植物組織使用40毫升提取緩沖液。離心分離后收集上層清液。然后按照文獻(xiàn)“Paszknowski，J.et al.，EMBO.J.32717-2722(1984);and Reiss，B.et al.，1984，Gene，30211-218(1984)”中所述的方法，對(duì)NPTⅡ活性進(jìn)行電泳分析。
按“Herrera-Estrella et al.，Nature，303209-213(1983)”中所述的方法提取植物組織。所提取的植物組織按“Gorman，C.M.et al.，Molec.Cell.Biol.21044-1051(1982)”中所述的方法進(jìn)行CAT測(cè)定。
表1列出進(jìn)行試驗(yàn)的各種載體，所得轉(zhuǎn)化株系的數(shù)目，以及它們的NPTⅡ試驗(yàn)結(jié)果。表2列出其中二種載體試樣所收集得到的數(shù)據(jù)。
表1已在棉花中試驗(yàn)的載體結(jié)構(gòu)載體 復(fù)原的 NPTⅡ 測(cè)定結(jié)果 %轉(zhuǎn)化 試驗(yàn)的株 為(+)的株系數(shù) 系數(shù) 株系數(shù)A6 4 4 0 0A6(pCMC91) 21 21 16 76A6(pCMC92) 16 16 16 100LBA4404(pCMC91) 17 17 15 88LBA4404(pCMC92) 4 4 4 100LBA4404(pCMC1204) 40 6 5 83A6結(jié)構(gòu)不攜帶耐卡那霉素的基因，因此，不會(huì)產(chǎn)生NPTⅡ蛋白質(zhì)。A6是有毒的土壤桿菌菌株。LBA4404是無(wú)毒菌株。質(zhì)粒pCMC91和pCMC92只帶有在T-DNA邊緣區(qū)段之間NPTⅡ基因。質(zhì)粒pCMC1204攜帶兩個(gè)前后排列的NPTⅡ和CAT基因。
表2在轉(zhuǎn)化棉愈傷組織中的NPTⅡ活性計(jì)數(shù)/分.20ul ng酶/20ul＊載體/試樣 (粗提物)對(duì)照物Stoneville 231 102 ＜0.1Coker 310 0 ＜0.1Deltapine 61 25 ＜0.1載體LBA4404(92)1 26，320 3.062 77，016 8.973 31，190 3.634 53，413 6.20＊毫微克數(shù)值系用已知量NPTⅡ酶在同樣凝膠上測(cè)定的計(jì)數(shù)進(jìn)行計(jì)算得到。
結(jié)果表明，至少是一種酶(NPTⅡ)的表達(dá)和/或在大多數(shù)情況下是兩種酶(NPTⅡ和CAT)的表達(dá)，此時(shí)這兩種酶在培養(yǎng)物中的棉愈傷組織的同一質(zhì)粒子結(jié)合在一起。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)化和再生在本實(shí)施例中，棉組織用無(wú)毒的A.tumefaciens(LBA4404)菌株轉(zhuǎn)化，該菌株具有為標(biāo)記酶NPTⅡ及CAT編碼的質(zhì)粒(pCMC1204)。在以后幾個(gè)月中使愈傷，組織在選擇培養(yǎng)基上擴(kuò)增。然后移出組織試樣，并測(cè)定其酶的表達(dá)。剩下的愈傷。組織被用于再生植物。以下將對(duì)本實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。
質(zhì)粒pCMC1204系由類(lèi)似于以前在該領(lǐng)域中所描述的雙連載體體系的組分構(gòu)成[de Framond et al.，Bio/technology，1262-269(1983)，Bevan，Nuc.Acids Res，128711-8721(1984)]。CAT基因的表達(dá)盒是通過(guò)將pSVC2 CAT(Gorman，et al.Mol.Cell.Biol.2;1044-1051(1982)中的HindⅢ/Sau 3Al CAT編碼斷片聯(lián)結(jié)在pCMC66的Hind Ⅲ和BamHⅠ位點(diǎn)而構(gòu)成。質(zhì)粒pCMC66是一種表達(dá)質(zhì)粒，它使用土壤桿菌的pTi T37的藍(lán)曙紅合酶nos基因中的啟動(dòng)區(qū)和多腺苷酸化區(qū)。所產(chǎn)生的稱(chēng)為pCMC1201的CAT表達(dá)質(zhì)粒與Sal Ⅰ成線(xiàn)性化，Sal Ⅰ在緊靠多腺苷酸化區(qū)的下方將此質(zhì)粒切割一次，并嵌入載體質(zhì)粒pCMC92中獨(dú)特的Sal Ⅰ位點(diǎn)。而載體質(zhì)粒pCMC92是一種寬-宿主范圍的復(fù)制子，它帶有來(lái)自土壤桿菌的T-DNA邊緣區(qū)和嵌合NPTⅡ基因。嵌合NPTⅡ基因是由pTi T37中的藍(lán)曙紅合酶啟動(dòng)區(qū)和多腺苷酸化順序(亦即與pCMC66中的控制順序相同)，以及Ti5中的NPTⅡ密碼區(qū)構(gòu)成。上述聯(lián)接產(chǎn)物稱(chēng)為pCMC1204。質(zhì)粒pCMC1204在與帶有pRK2013的大腸桿菌輔助菌株的三親本雜交中從大腸桿菌移入A.tumefaciens菌株LBA4404中。在盛有濃度為100微克/升的鏈霉素、磺胺嘧啶和羧芐青霉素的平板上選出反式接合體(transconjugants)。單一菌落被選出進(jìn)行擴(kuò)增，以供植物組織接種。
質(zhì)粒pCMC66和pCMC92的結(jié)構(gòu)和用途已由Barton和Gelfand在已公布的專(zhuān)利申請(qǐng)WO85/04899中作了詳細(xì)描述。質(zhì)粒pCMC92被保存在A(yíng)TCC，登錄號(hào)為53093，它不僅含有NPTⅡ嵌合基因和T-DNA邊緣區(qū)，而且還含有藍(lán)曙紅合酶啟動(dòng)區(qū)和多腺苷酸化順序，后者能從質(zhì)粒子除去，并與任何所需的異源編碼順序一起使用。
胚軸塊用稀釋(1;10)過(guò)夜的A.tumefaciens培養(yǎng)物接種。在室溫(23-27℃)和照明下培養(yǎng)3天后，將組織移入含有維生素B5、抗菌素、植物激素2，4-D(0.1毫克/升)、6糠基氨基嘌呤(0.1毫克/升)、Gelrite膠凝劑(1.6克/升)和氯化鎂(750毫克/升)的MS鹽中。用以殺死細(xì)菌的抗菌素是頭孢噻肟(50-100毫克/升)和羧芐青霉素(400-500毫克/升)。培養(yǎng)基中還含有用作選擇劑的硫酸卡那霉素(5-50毫克/升)。次代培養(yǎng)物每隔4至6周制備一次，以補(bǔ)充消耗的養(yǎng)分和抗菌素。3至4個(gè)月后，將逐一得到的細(xì)胞株系進(jìn)行標(biāo)記，并維持在選擇培養(yǎng)基上作組織擴(kuò)增。上述組織在30℃下培養(yǎng)一個(gè)16小時(shí)的光周期(50-100微摩爾/平方米/秒)。
擴(kuò)增后，停用抗菌素，轉(zhuǎn)化的組織維持在相同的培養(yǎng)基上。再經(jīng)2至3個(gè)月后，萌發(fā)的胚發(fā)生愈傷組織產(chǎn)生體細(xì)胞胚。當(dāng)胚長(zhǎng)到足夠大時(shí)，亦即4毫米或更長(zhǎng)，并且看上去生長(zhǎng)良好，具有子葉和胚根時(shí)就可將其移入裝有“純”蛭石的大試驗(yàn)管中。蛭石用加有植物激素吲哚乙酸、6糠基氨基嘌呤和赤霉素(這些成份的總含量為0.1毫克/升)的SH培養(yǎng)基浸漬至飽和。胚在30℃下培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)的光周期。一俟發(fā)芽，亦即2至3片葉子階段，即將小植株移入裝有蛭石的盆中，并根據(jù)需要澆水和施肥。將小植株放入燒杯中約一周，使葉子變強(qiáng)壯。俟盆裝植物的生長(zhǎng)正常后(4至6片葉子階段)，將其移入溫室。將已經(jīng)適應(yīng)的植物換入裝有商品土壤混合物Metro Mix360(Metro Mix是W.R.Grace公司的注冊(cè)號(hào))的盆中，并使其繼續(xù)生長(zhǎng)直至成熟。
按例1所述的方法進(jìn)行NPTⅡ測(cè)定。測(cè)定結(jié)果表明了若干再生棉株葉片組織的NPTⅡ活性。然而，某些NPTⅡ活性試驗(yàn)為陽(yáng)性的愈傷組織生長(zhǎng)出來(lái)的植物，其相應(yīng)的試驗(yàn)卻為陰性。
為證實(shí)轉(zhuǎn)化植物中質(zhì)粒的存在，用相應(yīng)于NPTⅡ密碼區(qū)的限制酶Ava Ⅰ和Hind Ⅲ進(jìn)行Southern點(diǎn)斑分析。經(jīng)提取和消化的植物DNA與放射性標(biāo)記的負(fù)鏈NPTⅡ順序雜交。雜交帶表明植物組織中有預(yù)計(jì)斷片存在，且數(shù)量至少為一個(gè)復(fù)制號(hào)。
質(zhì)粒pCMC1204被保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Cullection，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，USA)ATCC登錄號(hào)尚未得到。
上述保藏是按照ATCC和Cetus公司(本發(fā)明受讓人的合伙者)之間的合同進(jìn)行的。與ATCC簽訂的合同規(guī)定，在描述和確認(rèn)上述保藏的美國(guó)專(zhuān)利或刊物公布后，或者任何美國(guó)或外國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)向公眾揭示后(無(wú)論那一個(gè)在先)，公眾可隨時(shí)得到這些細(xì)胞株系的子代;該合同還規(guī)定這些細(xì)胞系的子代可提供給由美國(guó)專(zhuān)利和商標(biāo)局局長(zhǎng)根據(jù)35USC Section123和按其所制訂的條例(包括37CFR Section 1.14，特別關(guān)于886 O.G.638)而批準(zhǔn)的用戶(hù)。本申請(qǐng)的受讓人同意，萬(wàn)一保藏中的細(xì)胞株系在適當(dāng)條件下培養(yǎng)時(shí)發(fā)生死亡、丟失或毀壞，則在接到通知后將迅速用同樣細(xì)胞株系的活培養(yǎng)物進(jìn)行更換。
本發(fā)明并不限于所保藏的微生物的范圍，這是因?yàn)楸槐２氐木唧w微生物只能作為本發(fā)明一個(gè)方面的實(shí)例，而任何具有等效功能的微生物均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實(shí)上，通過(guò)以上描述，本發(fā)明的各種變體，除了本文所揭示和描述的以外，對(duì)于該技術(shù)領(lǐng)域：
的熟練人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，也均屬于所附權(quán)利要求
書(shū)的范圍內(nèi)。
雖然本發(fā)明已結(jié)合最佳實(shí)施例作了描述，當(dāng)然，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以進(jìn)行各種變換和改變，對(duì)此，該技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)的熟練人員將是容易理解的。
權(quán)利要求
1.一種將基因引入棉株和其株系的方法，它包括將未成熟棉株的胚軸組織暴露在有轉(zhuǎn)化能力的非致癌Agrobacterium tumefaciens培養(yǎng)物中，該菌株含有一個(gè)具有T-DNA區(qū)的Ti質(zhì)粒，在所說(shuō)T-DNA區(qū)中包含一個(gè)外來(lái)嵌合基因和一個(gè)抗選擇劑的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，它進(jìn)一步包括在選擇劑存在下培養(yǎng)暴露組織，抗性基因?yàn)橹幋a，以獲得抗性，從而選擇用T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞;在暴露于培養(yǎng)物內(nèi)的組織中誘發(fā)體細(xì)胞胚的生成;將體細(xì)胞胚再生成完整的棉株。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是在所說(shuō)暴露步驟前對(duì)棉籽進(jìn)行表面消毒，然后使所說(shuō)棉籽發(fā)芽，形成所說(shuō)的未成熟棉株。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是所說(shuō)胚軸組織包括從所說(shuō)的未成熟棉株上切除的胚軸分離塊切片。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是在所說(shuō)Agrobacterium tumefaciens培養(yǎng)物含有一個(gè)雙元Ti質(zhì)粒體系，其中有毒性狀被攜帶在一個(gè)從帶有T-DNA區(qū)的質(zhì)粒中分離出來(lái)的質(zhì)粒上。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其特征是在所說(shuō)的T-DNA區(qū)僅包括來(lái)自野生型Ti質(zhì)粒中T-DNA的右邊緣區(qū)和左邊緣區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其特征是所說(shuō)的選擇劑是抗菌素，而抗性基因進(jìn)行編碼，以獲得對(duì)付抗菌素的抗性。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的方法，其特征是所說(shuō)的耐抗菌素基因是NPTⅡ基因，而所說(shuō)抗菌素選自由卡那霉素和G418所組成的組中的制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的方法，其特征是所說(shuō)的耐抗菌素基因是CAT基因，而所說(shuō)抗菌素是氯霉素。
10.根據(jù)權(quán)利要求
7所述的方法，其特征是使用兩種抗菌素和兩種耐抗菌素的基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的方法，其特征在于所說(shuō)兩種抗菌素選自由潮霉素、氯霉素以及卡那霉素或G418兩者中的一種所組成的組中的制劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，它進(jìn)一步包括在組織暴露至所說(shuō)的Agrobacterium tumefaciens中的步驟之后，在至少含有一種對(duì)所說(shuō)的Agrobacterium tumefaciens有毒性，而對(duì)棉細(xì)胞無(wú)毒性的抗菌素的培養(yǎng)基上對(duì)組織進(jìn)行培養(yǎng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于所說(shuō)誘發(fā)胚生成的步驟包括在至少含有一種植物生長(zhǎng)激素或細(xì)胞激動(dòng)素的培養(yǎng)基中對(duì)植物組織進(jìn)行培養(yǎng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法而產(chǎn)生的棉株。
15.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法而產(chǎn)生的棉花體細(xì)胞胚。
16.根據(jù)權(quán)利要求
14所述的植物而產(chǎn)生的棉籽。
17.能發(fā)芽成棉株的棉籽，在它們的基因組中含有一個(gè)具有外來(lái)基因和啟動(dòng)區(qū)的嵌合基因結(jié)構(gòu)，以及能在植物細(xì)胞中起作用的控制順序，嵌合基因結(jié)構(gòu)在棉株細(xì)胞中能有效地表達(dá)由外來(lái)基因編碼的細(xì)胞產(chǎn)物。
18.從權(quán)利要求
17所述的棉籽發(fā)芽而生成的棉株。
19.根據(jù)權(quán)利要求
17所述的棉籽，其特征在于所說(shuō)細(xì)胞產(chǎn)物選自由外源蛋白質(zhì)和選出的產(chǎn)生體細(xì)胞變化成棉株的RNA所組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求
17所述的棉籽，其特征在于所說(shuō)的外來(lái)基因進(jìn)行編碼，以產(chǎn)生能有效地調(diào)節(jié)從棉籽生成的棉株中體細(xì)胞變化的負(fù)RNA鏈。
21.根據(jù)權(quán)利要求
19所述的棉籽，其特征在于所說(shuō)的啟動(dòng)區(qū)順序選自由Agrobacterium tumefaciens的藍(lán)曙紅合酶啟動(dòng)區(qū)和花椰菜鑲嵌病毒35s啟動(dòng)區(qū)所組成的組。
22.一種將基因引入棉株及其株系的方法，它依次包括下列步驟(a)對(duì)棉籽進(jìn)行表面滅菌;(b)使所說(shuō)的棉籽發(fā)芽，由此形成未成熟的棉株，所說(shuō)未成熟的棉株包括胚軸組織;(c)將所說(shuō)胚軸組織暴露在有轉(zhuǎn)化能力的，非致癌Agrobacterium tumefaciens培養(yǎng)物中，后者包含一個(gè)具有T-DNA區(qū)的Ti質(zhì)粒，而所說(shuō)的T-DNA區(qū)則含有一個(gè)外來(lái)嵌合基因和一個(gè)抗選擇劑的基因;(d)在至少含有一種對(duì)所說(shuō)Agrobacterium tumefaciens有毒，但對(duì)棉細(xì)胞無(wú)毒的抗菌素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所說(shuō)的胚軸組織;(e)在選擇劑存在下培養(yǎng)所說(shuō)的步驟(d)的組織，抗性基因?yàn)榇司幋a，以獲得抗性，從而選出用T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞;(f)誘發(fā)暴露在培養(yǎng)物中的組織生成體細(xì)胞胚;(g)使體細(xì)胞胚再生成完整的棉株。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明揭示了一種可達(dá)到棉株及其株系遺傳轉(zhuǎn)化的方法。由土壤桿菌作為引起遺傳轉(zhuǎn)化的媒介物，未成熟的棉組織在體外進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。所產(chǎn)生的棉組織須經(jīng)一種或一種以上選擇劑來(lái)篩選轉(zhuǎn)化體。然后轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物被誘發(fā)，開(kāi)始體細(xì)胞胚的產(chǎn)生。本發(fā)明同時(shí)也揭示了一種可能使這類(lèi)體細(xì)胞胚再生成為完整棉株的方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK87107233SQ87107233
公開(kāi)日1988年8月24日 申請(qǐng)日期1987年12月3日
發(fā)明者保羅F·厄佩卡 申請(qǐng)人:阿格拉塞特斯導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan