專(zhuān)利名稱：新的蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物害蟲(chóng)控制，特別是昆蟲(chóng)控制領(lǐng)域。提供了來(lái)源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)菌株的新的核酸序列，其編碼營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段表達(dá)的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。具體地，提供了編碼命名為ISP3-1099E，ISP3-327D和ISP3-2245J的蛋白質(zhì)的DNA序列，其可用于保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)損害。進(jìn)一步提供了包含至少一個(gè)新的核酸分子的植物和微生物，及利用這些核酸序列降低植物受到的昆蟲(chóng)損害的方法和手段。
背景技術(shù)：
昆蟲(chóng)害蟲(chóng)使全世界農(nóng)作物生產(chǎn)遭受著巨大經(jīng)濟(jì)損失，并且農(nóng)民每年都面臨由于蟲(chóng)害造成的產(chǎn)量損失威脅。農(nóng)作物中的昆蟲(chóng)抗性基因工程已經(jīng)成為降低農(nóng)作物管理和化學(xué)控制實(shí)踐的相關(guān)花費(fèi)的具有吸引力的方法?；谠谥参镏斜磉_(dá)從革蘭氏陽(yáng)性土壤細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌(Bt)分離的蛋白質(zhì)，自1996年以來(lái)，第一代昆蟲(chóng)抗性農(nóng)作物已經(jīng)投放市場(chǎng)。該殺昆蟲(chóng)Bt Cry蛋白質(zhì)在Bt菌株的孢子形成階段產(chǎn)生，并且該蛋白質(zhì)在細(xì)菌中以大的胞質(zhì)晶體積累。當(dāng)被昆蟲(chóng)攝取時(shí)，典型的鱗翅目(Lepidopteran)毒性Bt Cry蛋白質(zhì)在昆蟲(chóng)中腸中溶解和加工成為約60到65kDa的活性形式。此活性蛋白質(zhì)通過(guò)結(jié)合中腸上皮細(xì)胞發(fā)揮它的毒性作用，在細(xì)胞膜中引起穿孔，這引起細(xì)胞滲透裂解。
Bt菌株可以產(chǎn)生許多不同的毒素。自從1981年第一個(gè)編碼殺昆蟲(chóng)晶體蛋白質(zhì)的Bt基因分離以來(lái)(Schnepf和Whiteley 1981)，已經(jīng)克隆了100多種Bt Cry毒素編碼基因，并且通過(guò)在農(nóng)業(yè)重要作物物種中表達(dá)Bt來(lái)源的蛋白質(zhì)已經(jīng)有效地控制了昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。然而，因?yàn)榇蠖鄶?shù)Bt蛋白質(zhì)主要僅僅對(duì)相對(duì)小數(shù)量的現(xiàn)存昆蟲(chóng)害蟲(chóng)有活性，所以單獨(dú)Bt蛋白質(zhì)的應(yīng)用常常是有限的。據(jù)認(rèn)為，多種因素諸如昆蟲(chóng)腸道中毒素的激活(Haider等，1996)和其結(jié)合特異性受體的能力(Hofmann等，1988)決定Bt Cry蛋白質(zhì)的特異性。
現(xiàn)普遍認(rèn)識(shí)到存在敏感昆蟲(chóng)物種可能發(fā)展出對(duì)Bt Cry毒性的抗性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，已經(jīng)進(jìn)行了積極的努力以鑒定新的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。曾經(jīng)采用的一個(gè)策略是在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，而不是在孢子形成階段篩選產(chǎn)生殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的芽孢桿菌屬(Bacillus)菌株。利用這個(gè)方法，已經(jīng)鑒定了大量“營(yíng)養(yǎng)期殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)”或“VIP”。
Estruch等(1996)、WO94/21795、WO96/10083、WO98/44137、US5,877,012、US 6,107,279、US 6,137,033和US 6,291,156描述了從Bt菌株AB88、AB424和AB51上清液中分離vip3A(a)，vip3A(b)和vip3A(c)。根據(jù)作者所述，這些基因編碼具有針對(duì)廣譜鱗翅目(Lepidopteran)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的殺昆蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)。
WO98/18932和WO99/57282描述了從Bt菌株分離的大量核苷酸序列。這些序列稱為mis(mis-1到mis-8)，war和sup。根據(jù)作者所述，編碼的蛋白質(zhì)具有抗鱗翅目(Lepidopteran)或鞘翅目(Coleopteran)害蟲(chóng)的活性。
WO00/09697描述了可從側(cè)孢芽孢桿菌(Bacillus Laterosporus)菌株獲得的熱不穩(wěn)定性可溶MIS型和WAR型毒素，以及較小的(1到10kDa)毒素，根據(jù)作者所述，這些毒素具有抗玉米根葉甲幼蟲(chóng)的活性。
WO98/00546和US6,274,721描述了Bt菌株和Bt毒素的分離，根據(jù)作者所述，其具有抗鱗翅目(Lepidopteran)害蟲(chóng)的活性。
WO99/33991描述了Bt菌株和Bt毒素的分離，根據(jù)作者所述，其具有抗鱗翅目(Lepidopteran)害蟲(chóng)的活性。
最近，Selvapandiyan等(2001)描述了編碼命名為VIP-S的蛋白質(zhì)的基因的分離。根據(jù)作者所述，VIP-S蛋白質(zhì)顯示了抗多種鱗翅目(Lepidopteran)昆蟲(chóng)物種的毒性。
Doss等(2002)描述了來(lái)源于菌株Bt kurstaki的VIP3V的克隆。
WO02/078437描述了來(lái)源于Bt的VIP3毒素，諸如VIP3A，VIP3B和VIP3A-B雜交毒素。
盡管到目前為止，已經(jīng)分離和表征了相對(duì)大量的不同殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)，但是還需要鑒定、分離和表征新的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。該原因是多方面的。首先，由于殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)對(duì)特定靶害蟲(chóng)群體(宿主昆蟲(chóng)譜)的特異性，因此需要克隆編碼具有不同活性譜的蛋白質(zhì)的基因，以便對(duì)于不同的農(nóng)作物和不同的地理區(qū)域，可得到與昆蟲(chóng)害蟲(chóng)作斗爭(zhēng)的合適蛋白質(zhì)。例如，Bt Cry蛋白質(zhì)的特異性大多是受限制的。仍期望鑒定具有針對(duì)不同靶昆蟲(chóng)的特異性的毒素。其次，在一個(gè)地理區(qū)域長(zhǎng)期使用后，已知昆蟲(chóng)有能力發(fā)展出對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑、微生物噴霧劑(例如，基于Bt孢子-晶體混合物)的抗性，并且認(rèn)為昆蟲(chóng)有能力發(fā)展出對(duì)表達(dá)殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的植物的抗性。昆蟲(chóng)種群中抗性的發(fā)展可能潛在地使現(xiàn)有的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)失效，這就提供了對(duì)于新的基因和蛋白質(zhì)的需要。第三，因?yàn)榻】岛铜h(huán)境原因，可能期望鑒定具有高度且特異的殺昆蟲(chóng)效力和對(duì)靶昆蟲(chóng)物種的急性生物活性的蛋白質(zhì)。
此后，包括權(quán)利要求書(shū)中描述的不同實(shí)施方式，描述了從蘇云金芽孢桿菌菌株分離的新的核酸序列和氨基酸序列，通過(guò)在合適啟動(dòng)子控制下于植物中表達(dá)此核酸序列，或者通過(guò)給植物外部施用毒素，其可用于保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)損害。本發(fā)明毒素不同于先前描述的殺蟲(chóng)毒素。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了殺昆蟲(chóng)ISP3蛋白質(zhì)和編碼它們的核酸。提供了殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)ISP3-1099E(SEQ ID No.2)，ISP3-327D(SEQ ID No.4)和ISP3-2245J(SEQ ID No.6)和分別編碼它們的核酸isp3-1099E(SEQ ID No.1)，isp3-327D(SEQ ID No.3)和isp3-2245J(SEQ ID No.5)。本發(fā)明蛋白質(zhì)具有抗鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的殺昆蟲(chóng)活性，特別是抗選自美洲棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpazea)，棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa Armigera)，Helicoverpa punctigera，煙芽夜蛾(Heliothis vireseens)，歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地粘蟲(chóng)(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，棉花紅鈴蟲(chóng)(Pectinophora gossypiella)，三化螟(Scirpophaga incertulas)，稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大螟(Sesamia inferens)，Chilo partellus，藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，苜蓿綠夜蛾(Plathypena scabra)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，Spodoptera ornithogalli，Epinotia aporema和Rachiplusia nu.的昆蟲(chóng)。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了ISP3蛋白質(zhì)和編碼它們的核酸的殺昆蟲(chóng)變異體和片段。提供的變異體是例如在嚴(yán)格條件下與SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5雜交的核酸序列。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含與SEQ ID No.2至少91％序列同一性，與SEQ ID No.4至少91％序列同一性或與SEQ ID No.6至少88％序列同一性的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供了包含與SEQ ID No.1至少93％序列同一性，與SEQ ID No.3至少94％序列同一性或與SEQ ID No.5至少97％序列同一性的分離的核酸序列。
在再一實(shí)施方式中，提供了編碼本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的核酸序列，其中該核酸序列是已經(jīng)優(yōu)化用于單子葉或雙子葉植物或植物細(xì)胞中表達(dá)的合成序列。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供嵌合基因，其包含可操作地連接核酸序列的啟動(dòng)子序列，該核酸序列編碼ISP3蛋白質(zhì)，特別是ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其殺昆蟲(chóng)活性變異體或其片段。也提供了包含核苷酸序列的載體，該核苷酸序列編碼ISP3蛋白質(zhì)，特別是ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其殺昆蟲(chóng)活性變異體或其片段。
本發(fā)明還提供了包含嵌合基因的宿主細(xì)胞，特別是包含如下核苷酸序列的微生物或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞、植物組織、植物器官、植物種子或整株植物，該核苷酸序列編碼ISP3蛋白質(zhì)，特別是ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其殺昆蟲(chóng)活性片段或其變異體。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的植物是玉米或棉花植物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化的植物是水稻或大豆植物。在另一實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)化植物是任何植物，特別是選自以下的任何植物高梁、小麥、大麥、黑麥、向日葵、甘蔗、煙草、蕓苔屬種(BrassicaSpecies)(諸如油籽油菜、芥菜、甘藍(lán)、青花椰菜等)、蔬菜物種(番茄、花椰菜、蘿卜、菠菜、胡椒、洋蔥、菜豆、豌豆、胡蘿卜等)、甜菜、樹(shù)木物種(蘋(píng)果、梨、李子、針葉樹(shù)、落葉樹(shù)等)、馬鈴薯、紫花苜蓿、芒果、蕃木瓜、香蕉。
在另一實(shí)施方式中，提供了保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)損害的方法，包括用殺昆蟲(chóng)ISP3蛋白質(zhì)接觸所述植物。通過(guò)用編碼ISP3蛋白質(zhì)的核苷酸序列轉(zhuǎn)化植物或通過(guò)給植物外部施用ISP3蛋白質(zhì)，植物可以與ISP3蛋白質(zhì)接觸。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含isp3核酸，特別是isp3-1099E，isp3-327D或isp3-2245J的Bt菌株。
在另一實(shí)施方式中，提供了包含殺昆蟲(chóng)有效量ISP3蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)組合物。當(dāng)將組合物外部施用于植物時(shí)，與沒(méi)有施用這種組合物的對(duì)照植物比較，殺昆蟲(chóng)組合物增加植物對(duì)昆蟲(chóng)損害的抗性。
在另一實(shí)施方式中，提供了進(jìn)化編碼ISP3蛋白質(zhì)的核酸序列的方法，該方法包括步驟(a)提供編碼SEQ ID No.2和/或4和/或6氨基酸序列，或SEQ IDNo.2和/或4和/或6氨基酸序列的變異體或片段的核酸序列群，其中所述變異體或片段與SEQ ID No.2或4具有至少91％序列同一性，與SEQ IDNo.6具有至少88％序列同一性，(b)改組所述變異體或片段的群體以形成重組核酸分子；(c)選擇或篩選編碼具有殺昆蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)的重組核酸分子；(d)用在步驟(c)中選定的重組核酸分子重復(fù)步驟(a)到(c)，直到在步驟(c)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所編碼的蛋白質(zhì)具有期望的殺昆蟲(chóng)特性的重組核酸分子。
實(shí)施方式的詳細(xì)描述本發(fā)明領(lǐng)域是提供降低害蟲(chóng)，特別是昆蟲(chóng)害蟲(chóng)，更特別是鱗翅目(Lepidopteran)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)引起的植物損害的方法和手段。已經(jīng)鑒定和分離了新的核酸序列和蛋白質(zhì)，其不同于先前描述的核酸序列和蛋白質(zhì)，并且通過(guò)在植物或植物細(xì)胞中整合和表達(dá)這些新的核苷酸序列中的至少一種核苷酸序列，或者通過(guò)用包含這些核酸分子編碼的毒素的組合物外部處理植物或植物部分，所述核酸序列和蛋白質(zhì)可以用于控制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供從蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)菌株分離的新的殺蟲(chóng)毒素。具體地，提供了命名為ISP3-1099E蛋白質(zhì)，ISP3-327D蛋白質(zhì)和ISP3-2245J蛋白質(zhì)的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，“核酸序列”指編碼本發(fā)明任一種ISP3蛋白質(zhì)的單或雙鏈形式的DNA或RNA分子，優(yōu)選地，DNA或RNA，特別地是DNA。這里所用“分離的核酸序列”指不再存在于其分離自的天然環(huán)境中的核酸序列，例如在其它細(xì)菌宿主中或在植物核基因組中的核酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”或“多肽”可交換地用于指由氨基酸鏈組成的分子，而不涉及任何具體的作用模式、大小、三維結(jié)構(gòu)或來(lái)源。因此，這里仍舊稱本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的片段或部分為“蛋白質(zhì)”。這里所用的“分離的蛋白質(zhì)”指不再在其天然環(huán)境中的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的天然環(huán)境指當(dāng)編碼它的核苷酸序列在其天然環(huán)境中，即，核苷酸序列分離自的環(huán)境中表達(dá)和翻譯時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的環(huán)境。例如，分離的蛋白質(zhì)可以在體外、另一細(xì)菌宿主中或植物細(xì)胞中存在，或者可以從另一細(xì)菌宿主或從植物細(xì)胞分泌。
根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)分離和鑒定了編碼新的ISP3蛋白質(zhì)的核酸序列，特別是DNA序列。分別命名這些新的基因?yàn)閕sp3-1099E，isp3-327D和isp3-2245J和命名它們編碼的蛋白質(zhì)為ISP3-1099E，ISP3-327D和ISP3-2245J。
根據(jù)本發(fā)明，“ISP3-1099E蛋白質(zhì)”指包含SEQ ID No.2氨基酸序列中保留殺昆蟲(chóng)活性的最小片段(此后稱為“最小毒性片段”)的任何蛋白質(zhì)。這包括包含最小毒性片段的雜合-或嵌合蛋白質(zhì)。該定義也包括SEQ IDNo.2中氨基酸序列的變異體，諸如與SEQ ID No.2基本相似、在氨基酸序列水平具有至少91％，特別地至少92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中利用Wisconsin GCG包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，版本10.2)，使用成對(duì)聯(lián)配(alignment)測(cè)定該序列同一性。GAP程序使用下面參數(shù)用于氨基酸序列比較“Blosum62”記分矩陣，8的“空位產(chǎn)生罰分”(或“空位權(quán)重”)和2的“空位延伸罰分”(或“長(zhǎng)度權(quán)重”)。優(yōu)選地，該定義包括這樣的蛋白質(zhì)，即該蛋白質(zhì)具有一些，優(yōu)選地5-10個(gè)，尤其是少于5個(gè)的氨基酸添加、置換或缺失，而不明顯改變，優(yōu)選地不改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性，或者至少不以不利方式改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性。
本發(fā)明“ISP3-327D蛋白質(zhì)”指包含SEQ ID No.4氨基酸序列中保留殺昆蟲(chóng)活性的最小片段(此后稱為“最小毒性片段”)的任何蛋白質(zhì)。這包括包含最小毒性片段的雜合-或嵌合蛋白質(zhì)。該定義也包括SEQ ID No.4中氨基酸序列的變異體，諸如在氨基酸序列水平具有至少91％，特別地至少92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的基本相似氨基酸序列，其中利用Wisconsin GCG包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，版本10.2)，使用成對(duì)聯(lián)配測(cè)定該序列同一性。GAP程序使用下面參數(shù)用于氨基酸序列比較“Blosum62”記分矩陣，8的“空位產(chǎn)生罰分”(或“空位權(quán)重”)和2的“空位延伸罰分”(或“長(zhǎng)度權(quán)重”)。優(yōu)選地，該定義包括這樣的蛋白質(zhì)，即該蛋白質(zhì)具有一些，優(yōu)選地5-10個(gè)，特別地少于5個(gè)的氨基酸添加、置換或缺失，而不明顯改變，優(yōu)選地不改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性，或者至少不以不利方式改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性。
本發(fā)明“ISP3-2245J蛋白質(zhì)”指包含SEQ ID No.6氨基酸序列中保留殺昆蟲(chóng)活性(此后稱為“最小毒性片段”)的最小片段的任何蛋白質(zhì)。這包括包含最小毒性片段的雜合-或嵌合蛋白質(zhì)。該定義也包括SEQ ID No.6中氨基酸序列的變異體，諸如與SEQ ID No.2基本相似、在氨基酸序列水平具有至少88％，特別地至少89％，90％，91％，92％，93％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中利用WisconsinGCG包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，版本10.2)，使用成對(duì)聯(lián)配測(cè)定該序列同一性。GAP程序使用下面參數(shù)用于氨基酸序列比較“Blosum62”記分矩陣，8的“空位產(chǎn)生罰分”(或“空位權(quán)重”)和2的“空位延伸罰分”(或“長(zhǎng)度權(quán)重”)。優(yōu)選地，該定義包括這樣的蛋白質(zhì)，即該蛋白質(zhì)具有一些，優(yōu)選地5-10個(gè)，特別地少于5個(gè)的氨基酸添加、置換或缺失，而不明顯改變，優(yōu)選地不改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性，或者至少不以不利方式改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性。
這里所用“包含/包括”解釋為盡管規(guī)定了所述特征，整數(shù)，步驟或成分的存在，但是不排除存在或添加一個(gè)或多個(gè)特征，整數(shù)，步驟或成分或它們組合。因此，這里所用術(shù)語(yǔ)“包含序列或區(qū)域X的DNA/蛋白質(zhì)”指包括或含有至少序列或區(qū)域“X”的DNA或蛋白質(zhì)，因此在5’(或N-末端)和/或3’(或C-末端)末端可以包括其它核苷酸或氨基酸序列，例如，EP 0 193 259中公開(kāi)的選擇性標(biāo)記蛋白質(zhì)(的核苷酸序列)，轉(zhuǎn)運(yùn)肽(的核苷酸序列)，和/或5’或3’前導(dǎo)序列。
這里所用的本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的“最小毒性片段”是可以通過(guò)酶促消化全長(zhǎng)ISP3蛋白質(zhì)獲得的保留殺昆蟲(chóng)活性的ISP3蛋白質(zhì)的最小片段或部分，或者是可以通過(guò)在編碼ISP3蛋白質(zhì)的DNA中制造核苷酸缺失獲得的保留殺昆蟲(chóng)活性的ISP3蛋白質(zhì)的最小片段或部分?？梢岳斫?，也可以化學(xué)合成編碼較短毒性ISP3片段的DNA，并且最小毒性片段的定義中包括可從合成的DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯獲得的最小毒性片段。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，ISP3蛋白質(zhì)的最小毒性片段有通過(guò)SDS-PAGE分析(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)測(cè)定的約65kDa的分子量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，ISP3蛋白質(zhì)的最小毒性片段有約23kDa的分子量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，ISP3蛋白質(zhì)的最小毒性片段有約33kDa的分子量。在另一實(shí)施方式中，最小毒性片段包含ISP3蛋白質(zhì)的中間氨基酸，特別是SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6的氨基酸第200位到氨基酸第455位的氨基酸。
如Yu等(1997)所述，通過(guò)利用純化酶或利用昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)的消化液(gut-juice)，并且溫育消化液提取物和包含ISP蛋白質(zhì)之一的溶液可以進(jìn)行ISP3蛋白質(zhì)的酶促消化?？梢栽赟DS-PAGE上分離和觀察蛋白水解產(chǎn)物。為了測(cè)定每個(gè)蛋白水解片段和其殺昆蟲(chóng)活性之間的關(guān)系，可以用處理過(guò)的、層析分級(jí)的蛋白質(zhì)片段進(jìn)行生物測(cè)定。用于測(cè)定ISP3蛋白質(zhì)的最小毒性片段的優(yōu)選消化液是來(lái)源于鱗翅目昆蟲(chóng)，優(yōu)選地來(lái)源于美洲棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa zea)，棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)，NativeBudworm(Helicoverpa punctigera)，煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地粘蟲(chóng)(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，棉花紅鈴蟲(chóng)(Pectinophora gossypiella)，三化螟(Scirpophaga incertulas)，稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大螟(Sesamia inferens)，玉米斑點(diǎn)螟(Chilo partellus)，藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，Pod Borer(Epinotia aporema)和Rachiplusia nu.的消化液。
利用本領(lǐng)域常規(guī)可用技術(shù)，通過(guò)上述片段的氨基酸序列測(cè)定，可以方便地測(cè)定最小毒性片段的N-和C-末端氨基酸序列端。
這里所用術(shù)語(yǔ)“isp3-1099E”，“isp3-327D”和“″isp3-2245J”指分別編碼如上所述“ISP3-1099E蛋白質(zhì)”或“ISP3-327D蛋白質(zhì)”或“ISP3-2245J蛋白質(zhì)”的任何DNA序列。其包括編碼SEQ ID No.2或SEQID No.4或SEQ ID No.6蛋白質(zhì)，或者如上所述它們的殺昆蟲(chóng)片段或變異體的天然、人工或合成的DNA序列。這里也包括編碼殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的如下DNA序列，其與序列表中提供的DNA序列有足夠的相似性使得它們能(即，有能力)與這些DNA序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交。
這里所用的“嚴(yán)格雜交條件”特別指下面的條件在濾膜上固定相關(guān)DNA，并且在42℃，在50％甲酰胺、5×SSPE、2×Denhardt試劑和0.1％SDS中預(yù)雜交濾膜1到2小時(shí)，或者在68℃，在6×SSC、2×Denhardt試劑和0.1％SDS中預(yù)雜交濾膜1到2小時(shí)。然后將變性(地高辛配基-或放射)標(biāo)記探針直接加入到預(yù)雜交液體中，在上述適當(dāng)溫度溫育16到24小時(shí)。溫育后，在室溫，在2×SSC，0.1％SDS中洗濾膜30分鐘，接著在68℃，0.5×SSC和0.1％SDS中進(jìn)行各30分鐘的2次洗滌。通過(guò)在-70℃，用增感屏使濾膜曝光X射線膠片(Kodak XAR-2或等同物)24到48小時(shí)確立放射自顯影圖。[20×SSC＝3M NaCl和0.3M檸檬酸鈉；100×Denhart試劑＝2％(w/v)牛血清白蛋白，2％(w/v)FicoilTM和2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮；SDS＝十二烷基硫酸鈉；20×SSPE＝3.6M NaCl，0.2M磷酸鈉和0.02MEDTA pH7.7]。當(dāng)然，在該方法中可以使用等同的條件和參數(shù)，但是仍舊保留期望的嚴(yán)格雜交條件。
顯然，本領(lǐng)域已知許多可用于分離本發(fā)明DNA序列的變異體的方法。例如，可以通過(guò)上文所述雜交，和/或通過(guò)本領(lǐng)域所知的PCR技術(shù)，從Bt菌株分離變異體?？梢灾苽鋓sp3 DNA序列區(qū)域的特異或簡(jiǎn)并引物，并且用于從已知或新的Bt菌株擴(kuò)增變異體。
本發(fā)明isp3-1099E DNA的優(yōu)選變異體是編碼上述殺昆蟲(chóng)ISP3-1099E蛋白質(zhì)變異體的DNA序列，或者與SEQ ID No.1具有至少93％，特別地至少94％，更優(yōu)選地至少95％，96％或97％，最優(yōu)選地至少98％或至少99％序列同一性的編碼殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明isp3-327D DNA的優(yōu)選變異體是編碼上述ISP3-327D蛋白質(zhì)變異體的DNA序列，或者與SEQ ID No.3具有至少94％，優(yōu)選地至少95％，特別地至少96％，97％，98％或至少99％序列同一性的編碼殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明isp3-2245J DNA的優(yōu)選變異體是編碼上述ISP3-2245J蛋白質(zhì)變異體的DNA序列，或者與SEQ ID No.5具有至少97％，優(yōu)選地至少98％，或至少99％序列同一性的編碼殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的DNA序列。利用Wisconsin GCG包(Madison，Wisconsin，USA)版本10.2的GAP程序計(jì)算上述序列同一性。GAP程序與下列用于核酸的參數(shù)一起使用“nwsgapdna”記分矩陣，50的“空位產(chǎn)生罰分”(或“空位權(quán)重”)和3的“空位延伸罰分”(或“長(zhǎng)度權(quán)重”)。嚴(yán)格雜交條件如上所定義。
這里所用的蛋白質(zhì)的“殺昆蟲(chóng)活性”意指當(dāng)喂食昆蟲(chóng)這種蛋白質(zhì)時(shí)——優(yōu)選地通過(guò)在重組宿主諸如植物中表達(dá)此蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，蛋白質(zhì)殺死昆蟲(chóng)的能力。應(yīng)理解，如果蛋白質(zhì)在昆蟲(chóng)發(fā)育階段的至少一個(gè)階段，優(yōu)選地幼蟲(chóng)階段具有殺死昆蟲(chóng)的能力，那么該蛋白質(zhì)具有殺昆蟲(chóng)活性。
這里所用的蛋白質(zhì)的“昆蟲(chóng)控制量”指足以將以植物為食的昆蟲(chóng)(例如，昆蟲(chóng)幼蟲(chóng))造成的植物損害限制到商業(yè)可接受水平的蛋白質(zhì)量，此蛋白質(zhì)量可以例如通過(guò)殺死昆蟲(chóng)或通過(guò)抑制昆蟲(chóng)發(fā)育、能育性或生長(zhǎng)，使昆蟲(chóng)對(duì)植物的損害變小并且使植物產(chǎn)量不明顯地受到不利影響。
根據(jù)本發(fā)明，使對(duì)本發(fā)明新的ISP3蛋白質(zhì)敏感的昆蟲(chóng)與昆蟲(chóng)控制量，優(yōu)選地殺昆蟲(chóng)量的該蛋白質(zhì)接觸。本發(fā)明蛋白質(zhì)的優(yōu)選靶昆蟲(chóng)是玉米、棉花、水稻或大豆植物的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)，特別是北美和南美國(guó)家、亞洲和澳洲的這些害蟲(chóng)。這里所用術(shù)語(yǔ)“植物”包括整株植物及植物部分，諸如葉、莖、種子、花或根。本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的特別優(yōu)選的靶昆蟲(chóng)是鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)，諸如實(shí)夜蛾屬(Heliothis spp.)，棉鈴蟲(chóng)屬(Helicoverpa spp.)，灰翅夜蛾屬(Spodoptera spp.)，稈野螟屬(Ostrinia spp.)，紅鈴蟲(chóng)屬(Pectinophora spp)，地虎屬(Agrotis spp)，白禾螟屬(Scirpophaga spp.)，縱卷葉野螟屬(Cnaphalocrocis spp.)，蛀莖夜蛾屬(Sesamia spp.)，禾草螟屬(Chilo spp.)，Anticarsia spp.，Pseudoplusia spp.，葉小卷蛾屬(Epinotia spp)和Rachiplusia spp，優(yōu)選地?zé)熝恳苟?Heliothis virescens)，美洲棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa zea)，棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa Armigera)，Helicoverpa punctera，歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地粘蟲(chóng)(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，棉花紅鈴蟲(chóng)(Pectinophora gossypiella)，三化螟(Scirpophaga incertulas)，稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大螟(Sesamia inferens)，Chilo partellus，藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，Epinotia aporema和Rachiplusia nu.。優(yōu)選地，本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)具有抗至少一種鱗翅目昆蟲(chóng)物種，更優(yōu)選地抗幾種鱗翅目昆蟲(chóng)物種的殺昆蟲(chóng)活性。
這里所用術(shù)語(yǔ)“ISP3蛋白質(zhì)”，“本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)”，“ISP蛋白質(zhì)”，或“本發(fā)明ISP蛋白質(zhì)”指本發(fā)明分離、鑒定和在本文中定義為ISP3-1099E，ISP3-327D，ISP3-2245J蛋白質(zhì)的新蛋白質(zhì)中的任何一種蛋白質(zhì)。
這里所用ISP3蛋白質(zhì)可以是全長(zhǎng)大小的蛋白質(zhì)，或者保留殺昆蟲(chóng)活性的截短形式的蛋白質(zhì)，或者其可以是雜合或融合蛋白質(zhì)中不同蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的聯(lián)合?！癐SP3毒素”指ISP3蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)片段或部分，特別是其最小毒性片段。這里所用“isp基因”，“isp3基因”，“isp DNA”或“isp3 DNA”是編碼本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的DNA序列，特別是指上述isp3-1099E，isp3-327D和isp3-2245J DNA序列中的任何一種DNA序列。
可以合成制備編碼本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的核酸序列，特別是DNA序列，并可以將其插入表達(dá)載體中以產(chǎn)生大量的ISP3蛋白質(zhì)。按照常規(guī)方法(Hfte等，1988；Harlow和Lane，1988)，ISP3蛋白質(zhì)可以用于制備特異性單克隆或多克隆抗體。
在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，提供特異性結(jié)合ISP3蛋白質(zhì)的抗體。特別地，提供了結(jié)合ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J，或其片段或變異體的單克隆或多克隆抗體。其中包括單克隆或多克隆抗體的片段，該片段保留結(jié)合引起其產(chǎn)生的ISP3蛋白質(zhì)或片段的能力。利用本領(lǐng)域已知的方法，諸如在Harlow和Lane″Using AntibodiesA LaboratoryManual″(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1998)中，在Liddell和Cryer，″A Practical Guide to Monoclonal Antibodies″(WILEYand Sons，1991)，中所述的方法，通過(guò)在動(dòng)物(諸如家兔或小鼠)中利用ISP3蛋白質(zhì)作為抗原可以制備ISP3蛋白質(zhì)的抗體?？贵w可以用于分離、鑒定、表征或純化與其結(jié)合的ISP3蛋白質(zhì)。例如，可以利用如ELISA或免疫印跡，通過(guò)使抗體和蛋白質(zhì)形成免疫復(fù)合體，之后通過(guò)檢測(cè)免疫復(fù)合體的存在，抗體可以用于檢測(cè)樣品中的ISP3蛋白質(zhì)。
此外，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜跇悠分蠭SP3蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或抗原表位檢測(cè)的免疫學(xué)試劑盒。樣品可以是細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞懸浮液等。這種試劑盒包含結(jié)合ISP3蛋白質(zhì)(或其片段)的抗體和一種或多種免疫檢測(cè)試劑。
也可以通過(guò)例如ELISA(酶聯(lián)免疫測(cè)定法)或Western印跡，將抗體用于分離具有相似活性的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。具有期望結(jié)合特異性的單克隆抗體系也可以用于克隆編碼此特定單克隆抗體的DNA。
在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供了用于檢測(cè)isp3-1099E，isp3-237D或isp3-2245J DNA序列的PCR引物和/或探針和試劑盒。按本領(lǐng)域所知方法(參見(jiàn)，Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和McPherson等.(2000)PCR-BasicsFrom Background to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany)，根據(jù)SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5，可以合成從樣品擴(kuò)增isp3 DNA的PCR引物對(duì)。同樣地，SEQ ID No.1，SEQ IDNo.3或SEQ ID No.5的DNA片段可以用作雜交探針。isp3檢測(cè)試劑盒可以包含isp3特異性引物或isp3特異性探針，和利用引物或探針檢測(cè)樣品中isp3 DNA的相關(guān)方案。例如，這種檢測(cè)試劑盒可以用于測(cè)定是否植物已經(jīng)被本發(fā)明isp3基因(或其部分)轉(zhuǎn)化。
因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，可以將一些氨基酸密碼子置換為其它氨基酸密碼子而不改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列。而且，一些氨基酸可以被其它等同氨基酸置換，而不明顯地改變，優(yōu)選地不改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性，至少不以不利地方式改變蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性。例如，只要不明顯地改變，優(yōu)選地不改變，至少不以不利地方式改變ISP3蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性，在堿性(例如，Arg，His，Lys)，酸性(例如，Asp，Glu)，非極性(例如，Ala，Val，Trp，Leu，Ile，Pro，Met，Phe，Trp)或極性(例如，Gly，Ser，Thr，Tyr，Cys，Asn，Gln)范疇內(nèi)的保守性氨基酸置換落入本發(fā)明范圍。此外，只要不明顯地改變，優(yōu)選地不改變，至少不以不利地方式改變ISP3蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性，非保守性氨基酸置換也落入本發(fā)明范圍。本發(fā)明DNA序列的變異體或等同物包括在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或SEQ IDNo.5的isp3 DNA序列雜交并且編碼具有和本發(fā)明蛋白質(zhì)相同的殺昆蟲(chóng)特性的蛋白質(zhì)的DNA序列，或者與本發(fā)明天然isp3基因比較，具有不同密碼子使用但是編碼具有相同殺昆蟲(chóng)活性和基本相同，優(yōu)選相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA序列。利用可獲得的密碼子使用表，通過(guò)使密碼子使用適于植物基因中最優(yōu)選的密碼子使用，特別是適于目的植物屬或種之天然基因(Bennetzen & Hall，1982；Itakura等，1977)的密碼子使用，可以優(yōu)化isp3 DNA序列的密碼子(例如，使其更適于在棉花、大豆、玉米或水稻中表達(dá))。用于各種植物物種的密碼子使用表由例如，Ikemura(1993)和Nakamura等.(2000)公開(kāi)。
而且，可以移除長(zhǎng)段的AT或GC核苷酸序列，并且可以引入適宜的限制性位點(diǎn)。
而且，可以修飾ISP3蛋白質(zhì)的N-末端以使其具有最佳的翻譯起始前后序列，由此在蛋白質(zhì)的N-末端添加或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在大多數(shù)情況下，為了最佳翻譯起始，優(yōu)選將要在植物細(xì)胞中表達(dá)的本發(fā)明蛋白質(zhì)起始于Met-Asp或Met-Ala二肽，這需要在isp3 DNA中起始密碼子下游插入編碼Asp或Ala氨基酸的密碼子作為新的第二密碼子?？商娲?，可以用“G”置換SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5的第四個(gè)核苷酸，這樣(Met后)第二個(gè)氨基酸是Asp。同樣地，可以用Asp密碼子(GAT或GAC)或Ala密碼子(GCT，GCC，GCA或GCG)，或用起始于“G”的任何其它密碼子置換第二密碼子(AAC或AAT，編碼Asn)。
也可以修飾DNA序列以除去不適宜的剪接位點(diǎn)。因?yàn)榧?xì)菌基因可能含有在其它宿主中，特別是真核生物宿主諸如植物中被識(shí)別為5’或3’剪接位點(diǎn)的基序，所以在這些其它宿主中的轉(zhuǎn)錄可能會(huì)過(guò)早地被終止，產(chǎn)生截短的mRNA。通過(guò)本領(lǐng)域已知的DNA序列的計(jì)算機(jī)分析和/或PCR分析可以鑒定不適宜的剪接位點(diǎn)。
當(dāng)然，可以根據(jù)具體目的，構(gòu)建其密碼子使用不同，但是編碼具有基本相同殺昆蟲(chóng)活性的相同蛋白質(zhì)或相似蛋白質(zhì)的DNA序列。已經(jīng)描述了在原核生物和真核生物表達(dá)系統(tǒng)中，將密碼子使用改變?yōu)樗拗骷?xì)胞的密碼子使用是外源宿主中基因表達(dá)所期望的(Bennetzen & Hall，1982；Itakura等，1977)。在文獻(xiàn)中(Wada等，1990；Murray等，1989)和在主要的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中(例如，德國(guó)Heidelberg的EMBL)和如Nakamura等(2000)所述，可獲得密碼子使用表。因此，可以構(gòu)建合成的DNA序列，由此產(chǎn)生相同或基本相同的蛋白質(zhì)。顯然，一旦知道本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的氨基酸序列，就可以制備幾種DNA序列。這種其它DNA序列包括合成或半合成的DNA序列，其已被改變而失活基因中的某些位點(diǎn)，例如通過(guò)如PCT公開(kāi)WO91/16432和WO93/09218中所述方式選擇性失活天然序列中存在的一些隱蔽的調(diào)節(jié)或加工元件，或者其全部密碼子使用被適應(yīng)性修改以適于更相關(guān)宿主生物體的密碼子使用，優(yōu)選地適于期望在其中進(jìn)行表達(dá)的宿主生物體的密碼子使用。在專(zhuān)利和科技文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn)將密碼子使用改變?yōu)樗拗骷?xì)胞優(yōu)選的密碼子使用的幾種技術(shù)。只要大多數(shù)或所有隱蔽的調(diào)節(jié)序列或加工元件已經(jīng)被其它序列所置換，那么修飾密碼子使用的精確方法對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)不重要。
可以常規(guī)地，即，通過(guò)PCR介導(dǎo)的誘變進(jìn)行諸如上述的DNA序列的小修飾(Ho等，1989，White等，1989)。利用現(xiàn)有技術(shù)，通過(guò)期望編碼區(qū)的從頭DNA合成可以常規(guī)地完成DNA序列的更深入的修飾。
術(shù)語(yǔ)“基本相同”，當(dāng)指ISP3蛋白質(zhì)的氨基酸序列時(shí)意指包括與所比較蛋白質(zhì)的氨基酸序列相差不超過(guò)5％，優(yōu)選地不超過(guò)2％的氨基酸序列；當(dāng)指ISP3蛋白質(zhì)的毒性時(shí)，意指包括這樣的蛋白質(zhì)，其平均LC50值(其是引起試驗(yàn)種群50％死亡的蛋白質(zhì)濃度)與從所比較蛋白質(zhì)獲得的平均LC50值相差不超過(guò)2倍，其中該蛋白質(zhì)和所比較蛋白質(zhì)的平均LC50值均根據(jù)相同生物測(cè)定條件下進(jìn)行的3個(gè)獨(dú)立生物測(cè)定試驗(yàn)計(jì)算。利用程序POLO PC(來(lái)自于LeOra軟件，1987，Berkely，California)，用Probit分析計(jì)算LC50值?？梢岳斫鉃榱舜_定是否存在LC50值的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，針對(duì)比較的兩種蛋白質(zhì)各自的LC50值，計(jì)算95％(或90％)置信限(用Probit分析計(jì)算的相關(guān)參數(shù))。一般地，如果置信限重疊，那么兩種蛋白質(zhì)的毒性被視為基本相同，如果置信限不重疊，那么兩種蛋白質(zhì)的毒性被視為基本不同。
這里所用術(shù)語(yǔ)ISP3毒素(或ISP3蛋白質(zhì))的“域”意指毒素(或ISP3蛋白質(zhì))中具有特定結(jié)構(gòu)或功能的任何部分或域，該部分或域可以被轉(zhuǎn)移到另一蛋白質(zhì)上以提供具有至少一種本發(fā)明ISP3毒素(或ISP3蛋白質(zhì))的功能特征(例如，結(jié)合和/或毒性特征)的新雜合蛋白質(zhì)(Ge等，1991)。此部分可以形成具有本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的結(jié)合和/或毒性特征的雜合蛋白質(zhì)的必要特征。這種雜合蛋白質(zhì)可以具有擴(kuò)大的宿主范圍，改進(jìn)的毒性和/或可以用在防止昆蟲(chóng)抗性發(fā)展的策略中(EP 408 403；Visser等，1993)。該定義包括編碼這些域的DNA序列。這里所用的雜合蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)意指由不同蛋白質(zhì)域組成并形成具有每個(gè)結(jié)構(gòu)域的特征的功能性嵌合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。在雜合或嵌合蛋白質(zhì)中可以包含的另一個(gè)域是例如穩(wěn)定域。穩(wěn)定域已經(jīng)被描述例如，存在于VIP3(a)蛋白質(zhì)的C-末端，并且被認(rèn)為可以在敏感昆蟲(chóng)的腸道環(huán)境中賦予毒性蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。
除了產(chǎn)生雜合蛋白質(zhì)外，通過(guò)缺失所有或部分的結(jié)構(gòu)域或向結(jié)構(gòu)域中引入突變，并且分析由此在昆蟲(chóng)毒性、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、對(duì)酶蛋白水解及溫度改變的敏感性和結(jié)合DNA/蛋白質(zhì)/特異性細(xì)胞方面獲得的影響，可以分析特定結(jié)構(gòu)域的功能。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式提供了使編碼ISP3蛋白質(zhì)，特別是ISP3-1099E或ISP3-327D或ISP32245J的核酸序列“進(jìn)化”為新的核酸序列的方法，其中該新的核酸序列編碼具有殺昆蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，進(jìn)化的核酸序列與未進(jìn)化的核酸序列比較具有改進(jìn)的殺昆蟲(chóng)活性。這里所用術(shù)語(yǔ)“進(jìn)化”指如在US 5,811,238、WO97/20078和US 6,180,406中所述，通過(guò)序列重組增強(qiáng)序列進(jìn)化的方法，這些文獻(xiàn)并入這里為參考文獻(xiàn)。這里所用核酸“改組”指核酸群或庫(kù)中的核酸序列間的體外或體內(nèi)重組，并且可以如本領(lǐng)域所知和如US 5,811,238、WO97/20078、US 6,180,406、US 6,117,679中所述，進(jìn)行這種核酸“改組”，這里并入這些文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn)。
進(jìn)化編碼ISP3蛋白質(zhì)的核酸序列的方法包括下面步驟(a)提供編碼SEQ ID No.2和/或4和/或6氨基酸序列，或SEQ ID No.2和/或4和/或6氨基酸序列的變異體或片段的核酸序列群，其中所述變異體或片段與SEQ ID No.2或4具有至少91％序列同一性，與SEQ ID No.6具有至少88％序列同一性，(b)改組所述變異體或片段群以形成重組核酸分子；(c)選擇或篩選編碼具有殺昆蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)的重組核酸分子；
(d)用在步驟(c)中選定的重組核酸分子重復(fù)步驟(a)到(c)，直到在步驟(c)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)編碼的蛋白質(zhì)具有期望的殺昆蟲(chóng)特性的重組核酸分子。
未進(jìn)化的核酸是在步驟(a)中提供的作為起始材料的核酸，而這里所用的相應(yīng)進(jìn)化的核酸指當(dāng)利用步驟(a)中未進(jìn)化的核酸進(jìn)行該方法時(shí)，在步驟(d)中獲得的重組核酸。用在步驟(a)中優(yōu)選的核酸是編碼氨基酸序列ISP3-1099E(SEQ ID No.2)和/或ISP3-327D(SEQ ID No.4)和/或ISP3-2245J(SEQ ID No.6)，或其變異體或片段的核酸序列。步驟(a)中核酸分子和/或核酸分子的變異體和/或片段的群體可以包含編碼單個(gè)ISP3蛋白質(zhì)的DNA和/或編碼本發(fā)明單個(gè)ISP3蛋白質(zhì)的變異體和/或片段的核酸，或者包含編碼本發(fā)明不同ISP3蛋白質(zhì)和/或其片段和/或變異體的核酸的混合物。編碼氨基酸序列SEQ ID No.2的變異體的核酸序列是編碼與SEQ ID No.2在氨基酸水平上具有至少91％，優(yōu)選地至少92％，最優(yōu)選地至少93％，94％，95％，98％，99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。編碼氨基酸序列SEQ ID No.4的變異體的核酸序列是編碼與SEQ ID No.4在氨基酸水平上具有至少91％，優(yōu)選地至少92％或93％，最優(yōu)選地至少94％，95％，98％，99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。編碼氨基酸序列SEQ ID No.6的變異體的核酸序列是編碼與SEQ ID No.6在氨基酸水平上具有至少88％，優(yōu)選地至少89％或90％，最優(yōu)選地至少91％，92％，93％，95％，98％，99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
優(yōu)選地，步驟(d)中獲得的進(jìn)化的核酸序列編碼具有改進(jìn)殺昆蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)，即，蛋白質(zhì)具有，例如比步驟(a)中用作為起始材料的未進(jìn)化序列編碼的蛋白質(zhì)更高的毒性，或者與未進(jìn)化序列比較具有抗不同靶昆蟲(chóng)譜的活性，或者它結(jié)合靶昆蟲(chóng)中不同的靶結(jié)合位點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)進(jìn)行昆蟲(chóng)生物測(cè)定，比較進(jìn)化和未進(jìn)化核酸序列編碼的蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)活性，選擇和篩選期望的較高毒性和/或不同毒性譜(步驟(c))。根據(jù)期望的殺昆蟲(chóng)特性，可以進(jìn)行可替代的或另外的其它功能測(cè)定。例如，如果增強(qiáng)的結(jié)合是期望的特性，那么在進(jìn)行昆蟲(chóng)生物測(cè)定前可以進(jìn)行結(jié)合測(cè)定。
可以在適宜表達(dá)載體中連接從總DNA制備的本發(fā)明isp3 DNA序列，并且轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌株，諸如大腸桿菌(E.coli)或Bt菌株，然后可以通過(guò)常規(guī)菌落免疫探測(cè)方法(French等，1986)，用抗ISP3蛋白質(zhì)產(chǎn)生的單克隆或多克隆抗體，篩選表達(dá)毒素的克隆。
然后，可以篩選產(chǎn)生ISP3蛋白質(zhì)的Bt或大腸桿菌克隆(可以利用標(biāo)準(zhǔn)方法，對(duì)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)western印跡方法)，或者可以檢測(cè)細(xì)菌以與對(duì)照細(xì)菌比較其殺昆蟲(chóng)活性。利用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法，諸如RT-PCR，也可以分析克隆是否存在編碼ISP3蛋白質(zhì)的mRNA。
可以用常規(guī)方法(Maxam和Gilbert，1980；Sanger，1977)測(cè)序編碼本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的基因以獲得DNA序列。序列比較表明該基因不同于以前描述的編碼具有抗鱗翅目活性的毒素的基因。
基因序列分析后，可以按照常規(guī)方法制備這些DNA序列中編碼新鑒定的ISP3蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)有效部分的殺昆蟲(chóng)有效部分DNA。從分離的DNA序列的DNA序列可以確定ISP3蛋白質(zhì)的氨基酸序列。這里也稱為“截短基因”或“截短DNA”的編碼ISP3蛋白質(zhì)的DNA序列的“殺昆蟲(chóng)有效部分(或片段)”意指編碼如下多肽的DNA序列，該多肽比ISP3全長(zhǎng)蛋白質(zhì)形式具有較少的氨基酸，但是具有殺昆蟲(chóng)活性。
為了在大腸桿菌、在其它Bt菌株和在植物中表達(dá)編碼本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的DNA序列的全部或殺昆蟲(chóng)有效部分，可以引入適宜限制位點(diǎn)使其位于DNA序列側(cè)翼。這可以利用熟知的方法(Stanssens等，1989；White等，1989)，通過(guò)定點(diǎn)誘變完成。為了在植物中獲得改進(jìn)的表達(dá)，可以根據(jù)PCT公布WO91/16432和WO93/09218和公布EP 0 385 962、EP 0 359 472和US 5,689,052，修飾本發(fā)明isp3基因或殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分的密碼子使用以形成等價(jià)的、修飾的或人工的基因或基因部分，或者可以將isp3基因或基因部分插入質(zhì)體、線粒體或葉綠體基因組并且利用適宜啟動(dòng)子在那里進(jìn)行表達(dá)(例如，Mc Bride等，1995；US 5,693,507)。
為了在單子葉植物諸如玉米或水稻中獲得增加的表達(dá)，也可以向嵌合基因添加內(nèi)含子，優(yōu)選地單子葉植物內(nèi)含子。例如，已經(jīng)證明將玉米Adh1基因的內(nèi)含子插入到5’調(diào)節(jié)區(qū)中可以增加玉米中的表達(dá)(Callis等，1987)。同樣地，如在US 5,859,347中所述的HSP70內(nèi)含子可以用于增加表達(dá)。通過(guò)定點(diǎn)內(nèi)含子插入和/或通過(guò)改變密碼子使用，例如使密碼子使用適應(yīng)于植物，優(yōu)選地特定相關(guān)植物屬的最優(yōu)選密碼子使用(Murray等，1989)，而不明顯改變，優(yōu)選地不改變所編碼的氨基酸序列，可以進(jìn)一步以翻譯中性方式改變isp3基因或其殺昆蟲(chóng)部分的DNA序列，以修飾基因部分中存在的可能的抑制DNA序列。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式，優(yōu)選將蛋白質(zhì)靶向細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器諸如質(zhì)體、優(yōu)選地葉綠體，線粒體，或者從細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)從而潛在地優(yōu)化蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和/或表達(dá)。對(duì)于該目的，在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明嵌合基因包含編碼信號(hào)肽或?qū)螂牡木幋a區(qū)，其連接本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)編碼區(qū)。本發(fā)明蛋白質(zhì)中待包含的特別優(yōu)選的肽是用于葉綠體或其它質(zhì)體導(dǎo)向的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，特別是來(lái)自基因產(chǎn)物靶向質(zhì)體的植物基因的雙轉(zhuǎn)運(yùn)肽區(qū)，，Capellades等(US 5,635,618)的優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，來(lái)源于菠菜的鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Oelmuller等，1993)，Wong等(1992)中所述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽和在公開(kāi)的PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO00/26371中的導(dǎo)向肽。也優(yōu)選引導(dǎo)與其連接的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外的肽，諸如馬鈴薯蛋白酶抑制劑II的分泌信號(hào)(Keil等，1986)，稻α-淀粉酶基因3的分泌信號(hào)(Sutliff等，1991)和煙草PR1蛋白質(zhì)的分泌信號(hào)(Cornelissen等，1986)。
本發(fā)明特別有用的信號(hào)肽包括葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(例如，Van Den Broeck等，1985)或者US 5,510,471和US 5,635,618的優(yōu)化的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽——其引起蛋白質(zhì)向葉綠體的轉(zhuǎn)運(yùn)，分泌性信號(hào)肽或?qū)⒌鞍踪|(zhì)靶向其它質(zhì)體、線粒體、ER或另外的細(xì)胞器的肽。在天然導(dǎo)向蛋白質(zhì)或分泌蛋白質(zhì)中存在用于靶向細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器或分泌到植物細(xì)胞外或分泌到細(xì)胞壁的信號(hào)序列，優(yōu)選地，如Klsgen等，(1989)，Klsgen和Weil(1991)，Neuhaus &Rogers(1998)，Bih等(1999)，Morris等(1999)，Hesse等(1989)，Tavladoraki等(1998)，Terashima等(1999)，Park等(1997)，Shcherban等(1995)中所述的信號(hào)序列(這里并入所有這些文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn))，特別是來(lái)源于玉米、棉花、大豆或稻的導(dǎo)向或分泌性蛋白質(zhì)的信號(hào)肽序列。
為了使得ISP3蛋白質(zhì)分泌到轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞外面，可以將適宜分泌信號(hào)肽融合到ISP3蛋白質(zhì)的氨基末端(N-末端)。也可以缺失或用適當(dāng)?shù)男盘?hào)肽，諸如上述真核生物分泌性信號(hào)肽置換任何推定的天然芽孢桿菌屬(Bacillus)分泌性信號(hào)肽。具體地，本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的氨基酸1到54位包含推定的芽孢桿菌屬信號(hào)肽。可以從ISP3蛋白質(zhì)移除或者可以用適當(dāng)?shù)男盘?hào)肽，特別是上述真核生物信號(hào)肽置換第1到10，優(yōu)選地1到50，更優(yōu)選地l到54位氨基酸。利用計(jì)算機(jī)分析，利用程序諸如信號(hào)肽檢索程序(SignalP 1.1或2.0版)，利用用于原核生物革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的矩陣和小于0.5的閾值，特別是0.25或更小的閾值，可以檢測(cè)推定的信號(hào)肽(Von Heijne，GunnaF，1986和Nielsen等，1996)。
而且，利用本領(lǐng)域已知的方法(例如，Van Rie等，1990)，可以評(píng)估本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的結(jié)合特性，以確定本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)是否結(jié)合其它Bt蛋白質(zhì)不識(shí)別(或競(jìng)爭(zhēng)性識(shí)別)的昆蟲(chóng)腸道，諸如中腸中的位點(diǎn)。在相關(guān)敏感昆蟲(chóng)中不存在結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)的具有不同結(jié)合位點(diǎn)的殺昆蟲(chóng)Bt蛋白質(zhì)是非常有價(jià)值的，尤其當(dāng)其在植物中表達(dá)時(shí)，可以用其置換昆蟲(chóng)可能已經(jīng)發(fā)展了抗性的已知Bt蛋白質(zhì)，或者將其與具有不同作用方式的殺昆蟲(chóng)Bt蛋白質(zhì)聯(lián)合使用以防止或延遲昆蟲(chóng)抗Bt蛋白質(zhì)抗性的發(fā)展。因?yàn)樾路蛛x的Bt毒素的這些特性，它們尤其可用于轉(zhuǎn)化植物，例如單子葉植物諸如玉米和水稻和雙子葉植物諸如棉花和大豆，以保護(hù)這些植物免受昆蟲(chóng)損害。預(yù)期本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的結(jié)合特性與Cry毒素的結(jié)合特性比較將不同。通過(guò)上述或US 6,291,156和US 6,137,033中的常規(guī)結(jié)合測(cè)定法可以測(cè)定這種不同的結(jié)合特性。
特別是為了對(duì)特定昆蟲(chóng)害蟲(chóng)進(jìn)行昆蟲(chóng)抗性控制，優(yōu)選將本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)與另一種昆蟲(chóng)控制蛋白質(zhì)，特別是Bt Cry蛋白質(zhì)或VIP或VIP樣蛋白質(zhì)，優(yōu)選地不識(shí)別這種ISP3蛋白質(zhì)所識(shí)別的至少一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的蛋白質(zhì)聯(lián)合。與本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)聯(lián)合的優(yōu)選的昆蟲(chóng)控制蛋白質(zhì)，特別是對(duì)于在植物，優(yōu)選地玉米、棉花、稻或大豆植物中同時(shí)表達(dá)而言，包括Cry蛋白質(zhì)，諸如Cry1F蛋白質(zhì)或來(lái)源于Cry1F蛋白質(zhì)的雜合體(例如，US 6,326,169；US 6,281,016；US 6,218,188中所述雜合Cry1A-Cry1F蛋白質(zhì)，或其毒性片段)，Cry1A型蛋白質(zhì)或其毒性片段，優(yōu)選地Cry1Ac蛋白質(zhì)或來(lái)源于Cry1Ac蛋白質(zhì)的雜合體(例如，US 5,880,275中所述雜合Cry1Ab-Cry1Ac蛋白質(zhì))，或者如EP451878中所述Cry1Ab或Bt2蛋白質(zhì)或其殺昆蟲(chóng)片段，如WO02/057664中所述Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白質(zhì)，如WO01/47952中所述Cry蛋白質(zhì)，如Estruch等(1996)和US 6,291，156中所述VIP3Aa蛋白質(zhì)或其毒性片段，來(lái)源于Xenorhabdus(如WO98/50427中所述)、沙雷氏菌屬(Serratia)(特別是來(lái)源于嗜蟲(chóng)沙雷氏菌(S.entomophila))或光桿狀菌屬(Photorhabdus)種菌株的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)，諸如在WO98/08932(例如，Waterfield等，2001；Ffrench-Constant和Bowen，2000)中所述來(lái)源于光桿狀菌屬(Photorhabdus)的Tc蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)用本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化已經(jīng)表達(dá)昆蟲(chóng)控制蛋白質(zhì)的植物，或者通過(guò)使昆蟲(chóng)控制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的植物和一種或多種本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的植物雜交，可以容易地獲得這種共表達(dá)。對(duì)于玉米、稻、棉花或大豆植物，優(yōu)選地，ISP3-327D蛋白質(zhì)或ISP3-1099E蛋白質(zhì)或ISP3-2245J蛋白質(zhì)用作第一昆蟲(chóng)控制蛋白質(zhì)，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ae或VIP3Aa蛋白質(zhì)或其衍生物用作第二昆蟲(chóng)控制蛋白質(zhì)。在EP 0 408 403中描述了在相同植物中獲得不同Bt(或者相似地，對(duì)于其它昆蟲(chóng)控制蛋白質(zhì)而言)殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)表達(dá)以最小化或防止針對(duì)轉(zhuǎn)基因抗昆蟲(chóng)植物的抗性發(fā)展的方法?？梢岳斫?，不同蛋白質(zhì)可以在相同植物中表達(dá)，或者每種蛋白質(zhì)可以分別在一種植物中表達(dá)，然后通過(guò)植物相互的雜交，在相同植物中聯(lián)合這些蛋白質(zhì)。例如，在雜種種子生產(chǎn)中，每種親本植物可以表達(dá)單種蛋白質(zhì)。一旦親本植物雜交產(chǎn)生雜種，雜種植物中兩種蛋白質(zhì)將聯(lián)合。
熟知Bt Cry蛋白質(zhì)作為原毒素表達(dá)，在昆蟲(chóng)腸道中該原毒素通過(guò)蛋白酶解轉(zhuǎn)化為毒性核心。當(dāng)本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)與Bt Cry蛋白質(zhì)聯(lián)合時(shí)，可以理解，可以利用編碼全長(zhǎng)原毒素或毒性核心或任何中間形式的Bt Cry基因。
優(yōu)選地，為了篩選目的也是為了增強(qiáng)雜草控制目的，還可以用編碼能賦予針對(duì)廣譜除草劑的抗性的蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物，所述除草劑是例如基于草丙膦(glufosinate)和草甘膦的除草劑。
用常規(guī)方法，可以將編碼ISP3蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)有效部分的殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分或其等同物，優(yōu)選地isp3嵌合基因穩(wěn)定地插入到單個(gè)植物細(xì)胞的核基因組中，并且可以按照常規(guī)方法使用這種轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞產(chǎn)生具有昆蟲(chóng)抗性的轉(zhuǎn)化植物。在這方面，根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中含有殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分的T-DNA載體可以用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并且以后利用例如在EP 0 116 718，EP 0 270 822，PCT公開(kāi)WO84/02913和公開(kāi)的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP0242 246和在Gould等(1991)中所述的方法，可以從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。本領(lǐng)域熟知用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化的T-DNA載體的構(gòu)建。如EP 0 120 561和EP 0 120515中所述，T-DNA載體可以是雙元載體，或者如EP 0 116 718所述，T-DNA載體可以是能通過(guò)同源重組整合進(jìn)入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的共整合載體。優(yōu)選的T-DNA載體都在T-DNA邊界序列之間，或者至少在右邊界序列的左側(cè)含有可操作地連接殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分的啟動(dòng)子。在Gielen，等(1984)中描述了邊界序列。當(dāng)然，利用方法諸如直接基因轉(zhuǎn)移(例如，在EP 0223 247中所述)，花粉介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如，在EP 0270 356和WO85/01856中所述)，例如US 4,684,611中所述的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，植物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如，在EP 0 067 553和US 4,407，956中所述)，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(例如，在US 4,536,475中所述)，和其它方法，諸如最近描述的用于轉(zhuǎn)化一些玉米株系(例如，US 6,140,553；Fromm等，1990；Gordon-Kamm等，1990)和稻(Shimamoto等，1989；Datta等，1990)的方法和一般性用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法(PCT公開(kāi)WO92/09696)，可以利用其它類(lèi)型載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。對(duì)于棉花轉(zhuǎn)化，特別優(yōu)選的是PCT專(zhuān)利公布WO00/71733中所述的方法。對(duì)于稻轉(zhuǎn)化，可以參考WO92/09696，WO94/00977和WO95/06722中所述的方法。
這里所用術(shù)語(yǔ)“玉米”指玉米(Zea mays)。這里所用棉花指棉屬(Gossypium spp.)，特別是陸地棉(G.hirsutum)和海島棉(G.barbadense)。術(shù)語(yǔ)“稻”指稻屬(Oryza spp.)，特別地是稻(O.sativa)?！按蠖埂敝复蠖箤?Glycine spp.)，特別是大豆(G.max)。
除了核基因組的轉(zhuǎn)化，本發(fā)明也包括質(zhì)體基因組，優(yōu)選地葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化。Kota等(1999)描述了在煙草葉綠體中超表達(dá)Cry2Aa蛋白質(zhì)的方法。
可以在常規(guī)植物培育方案中使用由此獲得的轉(zhuǎn)化植物用以產(chǎn)生具有相同特征的更多轉(zhuǎn)化植物，或者用以將殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分引入相同或親緣植物物種的其它品種中。從轉(zhuǎn)化植物獲得的種子含有作為穩(wěn)定插入物的殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分?？梢园凑粘Ｒ?guī)方法培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植物的細(xì)胞以產(chǎn)生ISP3毒素或蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)有效部分，然后可以將其回收以用在抗鱗翅目的常規(guī)殺昆蟲(chóng)組合物(US 5,254,799)中。
將殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分插入植物細(xì)胞基因組中，使該插入基因在啟動(dòng)子下游(即，3’)并且受該啟動(dòng)子控制，其中該啟動(dòng)子可以指導(dǎo)植物細(xì)胞中此基因部分的表達(dá)。這優(yōu)選地通過(guò)在植物細(xì)胞基因組中，特別在核或質(zhì)體(例如，葉綠體)基因組中插入isp3嵌合基因來(lái)完成。
優(yōu)選的啟動(dòng)子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)分離株CM 1841的強(qiáng)組成型35S啟動(dòng)子(“35S啟動(dòng)子”)(Gardner等，1981)，CabbB-S(Franck等，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)；Odell等(1985)描述的35S啟動(dòng)子，來(lái)源于泛素家族的啟動(dòng)子(例如，Christensen等1992，EP0 342 926，也參見(jiàn)Cornejo等1993的玉米泛素啟動(dòng)子)，gos2啟動(dòng)子(dePater等，1992)，emu啟動(dòng)子(Last等，1990)，擬南介肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子諸如An等(1996)所述的啟動(dòng)子，稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子諸如Zhang等(1991)所述的啟動(dòng)子和US 5,641,876中所述的啟動(dòng)子；木薯脈花葉病毒啟動(dòng)子(WO97/48819，Verdaguer等，(1998))，來(lái)源于地下三葉草矮化病毒的pPLEX系列啟動(dòng)子(WO96/06932，特別是S7啟動(dòng)子)，醇脫氫酶啟動(dòng)子，例如pAdh1S(GenBank記錄號(hào)X04049，X00581)，和TR1′啟動(dòng)子和TR2′啟動(dòng)子(分別是“TR1′啟動(dòng)子”和“TR2′啟動(dòng)子”)——它們分別驅(qū)動(dòng)T-DNA的1′和2′基因的表達(dá)(Velten等，1984)?？商娲兀梢岳貌皇墙M成型，而是對(duì)植物一個(gè)或多個(gè)組織或器官(例如，葉片和/或根)特異的啟動(dòng)子，由此插入的isp3基因部分僅在特定組織或器官的細(xì)胞中表達(dá)。例如，通過(guò)將殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分置于光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，可以在植物(例如，玉米、棉花、水稻、大豆)葉片中選擇性表達(dá)殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分，所述光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是諸如US 5,254,799中所公開(kāi)的植物本身或其它植物，諸如豌豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因的啟動(dòng)子。例如，可以選擇啟動(dòng)子使得僅在靶昆蟲(chóng)害蟲(chóng)為食的那些組織或細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明isp3基因，以便，與不表達(dá)isp3基因的植物比較，通過(guò)敏感靶昆蟲(chóng)的取食引起對(duì)宿主植物減少的昆蟲(chóng)損害。因此，通過(guò)表達(dá)根特異性啟動(dòng)子控制下的isp3基因，可以有效地控制主要損害根的鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。在WO00/29566中描述了優(yōu)先在根中有活性的啟動(dòng)子。用于根優(yōu)先表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子是US 5,633,363中所述的ZRP啟動(dòng)子(和其修飾物)。另一替代方案是利用誘導(dǎo)型表達(dá)的啟動(dòng)子，例如由(如通過(guò)昆蟲(chóng)取食引起的)傷口誘導(dǎo)的傷口誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如，Cordera等(1994)所述MPI啟動(dòng)子，或者由化學(xué)試劑諸如Aoyama和Chua(1997)所述的地塞米松誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，或者由溫度誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，諸如US 5,447,858中所述熱休克啟動(dòng)子，或者由其它外部刺激誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
將殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分插入到植物基因組中，使插入的基因部分位于適宜的3′末端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號(hào)(即，轉(zhuǎn)錄物形成和聚腺苷酸化信號(hào))的上游(即，5′)。優(yōu)選通過(guò)在植物細(xì)胞基因組中插入isp3嵌合基因完成上述過(guò)程。優(yōu)選的聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄物形成信號(hào)包括CaMV 35S基因、胭脂堿合酶基因(Depicker等，1982)、章魚(yú)堿合酶基因(Gielen等，1984)和T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)的這種信號(hào)，它們?cè)谵D(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中作為3′-非翻譯DNA序列。
利用已知的方法諸如電穿孔或三親本交配可以將T-DNA載體引入農(nóng)桿菌。
任選地，該殺昆蟲(chóng)有效isp3基因部分可以作為雜合基因插入到植物基因組中(US 5,254,799；Vaeck等，1987)，并且與可選擇或可評(píng)價(jià)的標(biāo)記基因，如編碼卡那霉素抗性的neo基因(EP 0 242 236)處于相同的啟動(dòng)子控制下，由此，植物表達(dá)易檢測(cè)的融合蛋白質(zhì)。
也可以利用植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化在植物細(xì)胞培養(yǎng)中大量生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)，例如生產(chǎn)ISP3蛋白質(zhì)，然后，該蛋白可以在適當(dāng)配制后施用到玉米作物上。本文中提到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞時(shí)，它指分離的或組織培養(yǎng)中的植物細(xì)胞(或也指植物原生質(zhì)體)，或包含在植物中或分化器官或組織中的植物細(xì)胞(或原生質(zhì)體)，而且特別地本文包括這兩種可能。因此，在說(shuō)明書(shū)或權(quán)利要求書(shū)中提到植物細(xì)胞不僅僅意指培養(yǎng)中的分離的細(xì)胞，也指可能位于任何位置或可能存在于任何類(lèi)型的植物組織或器官中的任何植物細(xì)胞。
也可以用編碼抗鱗翅目的蛋白質(zhì)的整個(gè)或部分isp3基因轉(zhuǎn)化有抗鱗翅目或鞘翅目殺昆蟲(chóng)活性的其它微生物，如細(xì)菌，諸如蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)。由此，可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的Bt菌株，用于對(duì)抗廣譜的鱗翅目和/或鞘翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)或用于對(duì)抗其它的鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)?？梢杂贸Ｒ?guī)方法，優(yōu)選用如Mahillon等，(1989)和PCT專(zhuān)利公布WO90/06999中所述常規(guī)的電穿孔技術(shù)，用引入到適宜克隆載體中的整個(gè)或部分本發(fā)明isp3基因進(jìn)行細(xì)菌，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化。
可以用常規(guī)方法(Dulmage，1981；Bernhard和Utz，1993)發(fā)酵含有本發(fā)明isp3基因的轉(zhuǎn)化芽孢桿菌屬菌株以提供高產(chǎn)量的細(xì)胞。在熟知的適當(dāng)生長(zhǎng)條件下，這些菌株以高產(chǎn)量分泌ISP3蛋白質(zhì)。
可以表達(dá)isp3基因的備選適宜宿主微生物是真菌、藻類(lèi)或病毒，特別是定居植物(例如，內(nèi)共生)的物種或作為昆蟲(chóng)病原體的物種。
可以用isp3基因轉(zhuǎn)化的微生物或優(yōu)選它們相應(yīng)的ISP3蛋白質(zhì)或ISP3毒素或殺昆蟲(chóng)有效的毒素部分作為活性組分，一起與適宜的載體、稀釋劑、乳化劑和/或分散劑(例如，如Bernhard和Utz，1993所述)，通過(guò)常規(guī)方法制成本發(fā)明的殺昆蟲(chóng)的，特別是抗鱗翅目的組合物。該殺昆蟲(chóng)組合物可以制成可濕性粉劑，丸，顆?；蚍蹌蛴盟蚍撬軇┲瞥梢后w制劑，如泡沫，凝膠，懸浮液，濃縮物等。WO96/10083中描述了包含殺昆蟲(chóng)Bt孢子的組合物的例子。
根據(jù)本發(fā)明，控制昆蟲(chóng)，特別是鱗翅目的方法包括向要保護(hù)的場(chǎng)所(區(qū)域)施用(例如，噴霧)殺昆蟲(chóng)量的ISP3蛋白質(zhì)或含有ISP3蛋白質(zhì)或含有用本發(fā)明isp3基因轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的組合物。要保護(hù)的場(chǎng)所可以包括，例如昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的棲息地或生長(zhǎng)的植物(例如，施用到葉)或?qū)⒁L(zhǎng)植物的區(qū)域(例如，施用到土壤或水)。優(yōu)選的組合物含有(優(yōu)選通過(guò)細(xì)菌宿主產(chǎn)生的)殺昆蟲(chóng)量的至少一種本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)，組合物優(yōu)選的施用方式是葉片施用，土壤施用或種子包衣。
這里所用術(shù)語(yǔ)“接觸”意指“與......發(fā)生物理接觸”。用殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)接觸植物意指內(nèi)部地(例如，通過(guò)在植物中表達(dá))或外部地(例如，通過(guò)向植物外部施用包含殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的組合物)使殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)與植物細(xì)胞接觸?？梢岳斫猓M管該術(shù)語(yǔ)未指出接觸的時(shí)間長(zhǎng)度，但是包括任何接觸時(shí)間(例如，短暫接觸，長(zhǎng)期接觸)。當(dāng)涉及包括用本發(fā)明殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)接觸植物(或其細(xì)胞或組織)以保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)損害的方法時(shí)，優(yōu)選足夠長(zhǎng)和足夠廣泛的接觸(即，足夠大量的細(xì)胞接觸足夠高數(shù)量的蛋白質(zhì))以防止或減少昆蟲(chóng)損害。
本發(fā)明還涉及控制鱗翅目棉花昆蟲(chóng)害蟲(chóng)，特別是棉鈴蟲(chóng)、卷葉蛾、earworms的方法，優(yōu)選地鱗翅目棉花昆蟲(chóng)害蟲(chóng)選自美洲棉鈴蟲(chóng)，棉鈴蟲(chóng)，Helicoverpa punctigera(Native Bollworm)，煙芽夜蛾，草地粘蟲(chóng)和棉花紅鈴蟲(chóng)，該方法包括向要保護(hù)的區(qū)域或植物施用這里所述的ISP3蛋白質(zhì)，優(yōu)選地這里所述的ISP3-1099E蛋白質(zhì)和/或ISP3-327D蛋白質(zhì)和/或ISP3-2245J蛋白質(zhì)(即，例如通過(guò)種植用本發(fā)明isp3基因轉(zhuǎn)化的棉花植物，或者通過(guò)噴霧含有本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的組合物，用本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)接觸棉花植物)。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)，特別是ISP3-1099E蛋白質(zhì)和/或ISP3-327D蛋白質(zhì)和/或ISP3-2245J蛋白質(zhì)對(duì)抗鱗翅目棉花昆蟲(chóng)害蟲(chóng)以最小化所述昆蟲(chóng)對(duì)棉花植物的損害的用途。
本發(fā)明還涉及控制鱗翅目玉米昆蟲(chóng)害蟲(chóng)，特別是earworm、粘蟲(chóng)、玉米螟的方法，優(yōu)選地，玉米昆蟲(chóng)害蟲(chóng)選自美洲棉鈴蟲(chóng)，小地老虎，歐洲玉米螟，草地粘蟲(chóng)，該方法包括向要保護(hù)的區(qū)域或植物施用這里所述的ISP3蛋白質(zhì)，優(yōu)選地這里所述的ISP3-1099E蛋白質(zhì)和/或ISP3-327D蛋白質(zhì)和/或ISP3-2245J蛋白質(zhì)(即，例如通過(guò)種植用本發(fā)明isp3基因轉(zhuǎn)化的玉米植物，或者通過(guò)噴霧含有本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的組合物，用本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)接觸玉米植物)。本發(fā)明也涉及本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)，特別是ISP3-1099E蛋白質(zhì)和/或ISP3-327D蛋白質(zhì)和/或ISP3-2245J蛋白質(zhì)對(duì)抗鱗翅目玉米昆蟲(chóng)害蟲(chóng)以最小化所述昆蟲(chóng)對(duì)玉米植物的損害的用途。
本發(fā)明還涉及控制鱗翅目水稻昆蟲(chóng)害蟲(chóng)，特別是二化螟、稻苞蟲(chóng)、稻切根蟲(chóng)、稻葉夜蛾、稻縱卷葉螟，美洲稻弄蝶的方法，優(yōu)選地，水稻昆蟲(chóng)害蟲(chóng)選自三化螟，稻縱卷葉螟，大螟和Corn spotted stem Borer(Chilopartellus)，該方法包括向要保護(hù)的區(qū)域或植物施用這里所述的ISP3蛋白質(zhì)，優(yōu)選地這里所述的ISP3-1099E蛋白質(zhì)和/或ISP3-327D蛋白質(zhì)和/或ISP3-2245J蛋白質(zhì)(即，例如通過(guò)種植用本發(fā)明isp3基因轉(zhuǎn)化的稻植物，或者通過(guò)噴霧含有本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的組合物，用本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)接觸稻植物)。本發(fā)明也涉及本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)，特別是ISP3-1099E蛋白質(zhì)和/或ISP3-327D蛋白質(zhì)和/或ISP3-2245J蛋白質(zhì)抗鱗翅目水稻昆蟲(chóng)害蟲(chóng)以最小化所述昆蟲(chóng)對(duì)稻植物的損害的用途。
本發(fā)明還涉及控制鱗翅目大豆昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的方法，優(yōu)選地，大豆昆蟲(chóng)害蟲(chóng)選自藜豆夜蛾，大豆夜蛾，甜菜夜蛾，yellow stripedarmvworm(Spodoptera ornithogalli)，美洲棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa zea)，PodBorer(Epinotia aporema)和Rachiplusia nu.，該方法包括向要保護(hù)的區(qū)域或植物施用這里所述的ISP3蛋白質(zhì)，優(yōu)選地這里所述的ISP3-1099E蛋白質(zhì)和/或ISP3-327D蛋白質(zhì)和/或ISP3-2245J蛋白質(zhì)(即，例如通過(guò)種植用本發(fā)明isp3基因轉(zhuǎn)化的大豆植物，或者通過(guò)噴霧含有本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)的組合物，用本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)接觸大豆植物)。本發(fā)明也涉及本發(fā)明ISP3蛋白質(zhì)，特別是ISP3-1099E蛋白質(zhì)和/或ISP3-327D蛋白質(zhì)和/或ISP3-2245J蛋白質(zhì)對(duì)抗鱗翅目大豆昆蟲(chóng)害蟲(chóng)以最小化所述昆蟲(chóng)對(duì)大豆植物的損害的用途。
為了獲得ISP3毒素或蛋白質(zhì)，可以通過(guò)常規(guī)方法在適宜培養(yǎng)基上生長(zhǎng)表達(dá)ISP3蛋白質(zhì)的重組宿主細(xì)胞?？梢詮纳L(zhǎng)培養(yǎng)物分離和純化分泌的毒素。可替代地，如果蛋白質(zhì)不被分泌，可以利用常規(guī)方法如酶降解或去污劑等裂解細(xì)胞。然后，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如層析法，提取，電泳等分離和純化毒素。
術(shù)語(yǔ)“基因”意指包含可在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄為RNA分子(例如，mRNA)的區(qū)域(“轉(zhuǎn)錄的區(qū)域”)的任何DNA或RNA片段，其中所述區(qū)域可操作地連接適宜的調(diào)節(jié)區(qū)域，例如植物可表達(dá)的啟動(dòng)子。因此，基因可以包含幾個(gè)可操作地連接的片段，諸如啟動(dòng)子、5’前導(dǎo)序列、編碼區(qū)和包含聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’非翻譯序列。特定生物體(諸如植物物種或細(xì)菌菌株)的內(nèi)源基因是在自然界中天然存在于該生物體中的基因。當(dāng)提到本發(fā)明isp3 DNA時(shí)，嵌合基因指具有的5’和/或3’調(diào)節(jié)序列不同于驅(qū)動(dòng)isp3基因在其天然宿主細(xì)胞中表達(dá)的天然細(xì)菌5’和/或3’調(diào)節(jié)序列的isp3 DNA序列。
術(shù)語(yǔ)“基因表達(dá)”指可操作地連接適當(dāng)調(diào)節(jié)區(qū)域，特別是啟動(dòng)子的DNA或RNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄為生物活性RNA的過(guò)程，所謂生物活性RNA即該RNA能與另一核酸相互作用，或者其能翻譯為生物活性多肽或蛋白質(zhì)。當(dāng)基因表達(dá)的終產(chǎn)物是生物活性RNA，諸如反義RNA、核酶或復(fù)制中間體時(shí)，稱基因編碼RNA。當(dāng)基因表達(dá)終產(chǎn)物是生物活性蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，稱基因編碼蛋白質(zhì)。
對(duì)于本發(fā)明目的，以百分?jǐn)?shù)表示的兩個(gè)相關(guān)核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”，指在此兩個(gè)最佳聯(lián)配的序列中具有相同殘基的位置的數(shù)目除以所比較的位置數(shù)(×100)。空位，即，聯(lián)配中在一個(gè)序列中存在殘基而在另一個(gè)序列中不存在殘基的位置，其被視為具有不同殘基的位置。對(duì)于本發(fā)明目的，為了計(jì)算兩個(gè)序列之間的序列同一性，利用GAP程序，該程序利用了Needleman和Wunsch算法(1970)，并且由WisconsinPackage，版本10.2，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Drive，Madison，Wisconsin 53711，USA，提供。所用GAP參數(shù)是空位產(chǎn)生罰分＝50(核苷酸)/8(氨基酸)，空位延伸罰分＝3(核苷酸)/2(氨基酸)，和記分矩陣″nwsgapdna″(核苷酸)或″blosum62″(氨基酸)。
GAP利用了Needleman和Wunsch全局聯(lián)配算法以就兩個(gè)序列的全長(zhǎng)進(jìn)行聯(lián)配，從而最大化匹配數(shù)和最小化空位數(shù)。缺省參數(shù)是空位產(chǎn)生罰分＝50(核苷酸)/8(蛋白質(zhì))和空位延伸罰分＝3(核苷酸)/2(蛋白質(zhì))。對(duì)于核苷酸，所用的缺省記分矩陣是″nwsgapdna″；對(duì)于蛋白質(zhì)，缺省記分矩陣是″blosum62″(Henikoff&Henikoff，1992)。
在權(quán)利要求的文字中反映了本發(fā)明這些和/或其它實(shí)施方式，其形成本下面的實(shí)施例示例了本發(fā)明，但是不旨在對(duì)本發(fā)明和其保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例、權(quán)利要求和說(shuō)明書(shū)中提到的序列表如下SEQ ID No.1DNA序列isp3-1099ESEQ ID No.2氨基酸序列ISP3-1099ESEQ ID No.3DNA序列isp3-327DSEQ ID No.4氨基酸序列ISP3-327DSEQ ID No.5DNA序列isp3-2245JSEQ ID No.6氨基酸序列ISP3-2245J除了在實(shí)施例中另外說(shuō)明外，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行所有重組DNA技術(shù)，所述標(biāo)準(zhǔn)方法是Sambrook和Russell(2001)Molecular CloningALaboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY中，Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，CurrentProtocols，USA的1和2卷中，和Brown(1998)Molecular Biology Labfax，第二版，Academic Press(UK)的卷I和II中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法。在R.D.D.Croy著Plant Molecular Biology Labfax(1 993)(BIOS ScientificPublications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK聯(lián)合出版)中描述了用于植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法。可以在Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，中和McPherson等.(2000)PCR-BasicsFromBackground to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany中發(fā)現(xiàn)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法。
實(shí)施例實(shí)施例1細(xì)菌菌株的鑒定從比利時(shí)的谷塵(grain dust)分離到這里命名為BTS01099E的細(xì)菌菌株。從西班牙的馬糞分離到這里命名為BTS00327D的另一種細(xì)菌菌株。從菲律賓的谷塵分離到這里命名為BTS02245J的另一種細(xì)菌菌株。
在28℃，在LB瓊脂板(添加1.5％瓊脂的LB培養(yǎng)基；LB培養(yǎng)基10g/l胰蛋白胨，10g/l NaCl，5g/l酵母提取物，pH7.3)上過(guò)夜生長(zhǎng)每個(gè)菌株。對(duì)于小規(guī)模培養(yǎng)，接種20ml TB培養(yǎng)基(Terrific肉湯12g/l胰蛋白胨，24g/l酵母提取物，3.8g/l KH2PO4，12.5g/l K2HPO4，5ml/l甘油，pH7.1)，在28℃，在每分鐘約70轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上生長(zhǎng)65小時(shí)。65小時(shí)后，向培養(yǎng)物添加蛋白酶抑制劑混合物。該混合物具有下面的組分(所給的體積為添加到一份20ml培養(yǎng)物所需的體積)200μl PMSF(100mM)，200μl苯甲脒.HCl(100mM)和ε-氨基-正-己酸(500 mM)的混合物，400μl EGTA(0.5M)，40μl抗蛋白酶(0.5mg/ml)/亮抑酶肽(0.5mg/ml)和20μl β-巰基乙醇(14M)。
然后，在3000rpm，離心已經(jīng)添加了蛋白酶抑制劑混合物的培養(yǎng)基20分鐘。在一些情況下，利用Centriprep YM-10 Centrifugal Filter Devices(Millipore Cat.No.4305)濃縮上清液約4倍。
為了進(jìn)行長(zhǎng)期貯藏，將一環(huán)形成孢子的細(xì)胞加入到0.5ml的25％甘油中，渦旋后，在-70℃貯藏。通過(guò)在LB瓊脂板上生長(zhǎng)菌株直到孢子形成，獲得形成孢子的細(xì)胞(在光學(xué)顯微鏡下可觀察看到)。
將單細(xì)胞菌落在LB瓊脂板上培養(yǎng)后，BTS01099E、BTS00327D和BTS02245J菌株培養(yǎng)物的顯微鏡分析表明存在桿狀的、運(yùn)動(dòng)的、單個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和包含卵圓形孢子的孢子囊。在BTS00327D，BTS01099E和BTS02245J培養(yǎng)物中檢測(cè)到伴胞晶體。
根據(jù)桿樣形狀、有氧生長(zhǎng)和伴胞晶體的存在，認(rèn)為這3株是蘇云金芽孢桿菌種菌株。
可以在常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上，優(yōu)選地T3培養(yǎng)基(胰蛋白胨3g/l，胰蛋白 2g/l，酵母提取物1.5g/l，5mg MnCl2，0.05M Na2HPO4.2H2O，0.05MNaH2PO4.H2O，pH6.8和1.5％瓊脂)上，優(yōu)選在28℃，培養(yǎng)每個(gè)菌株。為了長(zhǎng)期貯藏，優(yōu)選地，混合等體積的孢子晶體懸浮液和等體積的50％甘油，并且將它貯藏在-70℃或凍干孢子晶體懸浮液。優(yōu)選在28℃，72小時(shí)，在T3培養(yǎng)基上生長(zhǎng)以實(shí)現(xiàn)孢子形成。
實(shí)施例2芽孢桿菌菌株的昆蟲(chóng)生物測(cè)定(利用含有殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)物懸浮液)對(duì)美洲棉鈴蟲(chóng)，煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)，草地粘蟲(chóng)(spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)的新生幼蟲(chóng)進(jìn)行生物測(cè)定。
在抗各種鱗翅目昆蟲(chóng)的昆蟲(chóng)測(cè)定中(“表面污染測(cè)定”)，使用不同芽孢桿菌菌株的細(xì)菌培養(yǎng)物的無(wú)細(xì)胞上清液。
在28℃，在TB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌株BTS01099E，BTS00327D或BTS02245J。培養(yǎng)開(kāi)始后65小時(shí)收獲無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，進(jìn)行稀釋并施用到固化人工餌料(瓊脂20g，水1000ml，玉米粉96g，酵母30g，麥胚64g，Wesson鹽7.5g，酪蛋白15g，山梨酸2g，金霉素0.3g，Nipagin 1g，麥胚油4ml，蔗糖15g，膽固醇1g，抗壞血酸3.5g，Vanderzand mod.vit.mix12g(根據(jù)Vanderzand 1962))表面，所述餌料分配在Costar 48孔平板孔中并允許其固化。將25μl上清液溶液加到每個(gè)孔的表面(1cm2)。每個(gè)孔放置一個(gè)新生(L1一齡期)昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，每個(gè)樣品使用18-20個(gè)幼蟲(chóng)。保持該培養(yǎng)皿在25℃±1℃，7天后記錄死亡率(死亡幼蟲(chóng)對(duì)活的幼蟲(chóng)的百分?jǐn)?shù))。利用TB和標(biāo)準(zhǔn)餌料作為陰性對(duì)照。
結(jié)果(下面表1中所示)表明菌株BTS01099E，BTS00327D和BTS02245J的無(wú)細(xì)胞上清液顯示了對(duì)煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，美洲棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa zea)和歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)幼蟲(chóng)的毒性。此外，菌株BTS02245J的上清液還顯示了對(duì)草地粘蟲(chóng)(Spodopterafrugiperda)幼蟲(chóng)的毒性，BTS00327D的上清液顯示了對(duì)小地老虎(Agrotisipsilon)幼蟲(chóng)的毒性。
表1

Hv煙芽夜蛾(Heliothis virescens)，Hz美洲棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpazea)；On歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，Sf草地粘蟲(chóng)(Spodopterafrugiperda)；Ai小地老虎(Agrotis ipsilon)；nt沒(méi)有測(cè)定。
陰性對(duì)照(標(biāo)準(zhǔn)餌料)BTS02245JHv 9％，Hz 0％，On 0％，Sf 0％BTS00327DHv 10％，Hz 6％，On 4％，Ai 0％BTS01099EHv 10％，Hz 0％，On 0％其它的觀測(cè)項(xiàng)目gi幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制(7天后，活的幼蟲(chóng)仍舊在L1/L2齡期)ir幼蟲(chóng)的無(wú)規(guī)律生長(zhǎng)(7天后，活的幼蟲(chóng)一部分在L1/L2齡期，一部分在L3/L4齡期)菌株BTS02245J的無(wú)細(xì)胞上清液引起了煙芽夜蛾幼蟲(chóng)11％和33％的死亡率，美洲棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)94％和50％的死亡率，歐洲玉米螟幼蟲(chóng)50％的死亡率和草地粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)78％的死亡率，表明該菌株的上清液有殺昆蟲(chóng)活性，特別是抗美洲棉鈴蟲(chóng)和草地粘蟲(chóng)的殺昆蟲(chóng)活性。毒性可能是由于該菌株分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)引起的。
菌株BTS00327D的無(wú)細(xì)胞上清液引起了煙芽夜蛾幼蟲(chóng)70％的死亡率，美洲棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)35％到78％的死亡率，歐洲玉米螟幼蟲(chóng)100％的死亡率和小地老虎幼蟲(chóng)100％的死亡率。因此，該菌株的上清液顯示了對(duì)至少4種不同的鱗翅目昆蟲(chóng)物種的強(qiáng)毒性。毒性可能是由于該菌株分泌到培養(yǎng)基中的殺昆蟲(chóng)活性蛋白質(zhì)引起的。
菌株BTS01099E的無(wú)細(xì)胞上清液引起了煙芽夜蛾(H.virescens)幼蟲(chóng)25％的死亡率，美洲棉鈴蟲(chóng)(H.zea)幼蟲(chóng)10％的死亡率，歐洲玉米螟(O.nubilalis)幼蟲(chóng)46％的死亡率，表明該菌株的上清液有抗不同鱗翅目(Lepidopteran)昆蟲(chóng)物種的毒性活性。毒性可能是由于該菌株分泌到培養(yǎng)基中的殺昆蟲(chóng)活性蛋白質(zhì)引起的。
實(shí)施例3isp3基因的克隆從菌株BTS01099E克隆編碼ISP3-1099E的核苷酸序列制備菌株BTS01099E的總DNA，用Sau3A部分消化。在蔗糖梯度上大小分級(jí)消化的DNA。BamH1消化和用TsAP(熱敏感性堿性磷酸酶)處理克隆載體pUC191(pUC19的衍生物；Yannisch-Perron等，1985)后，將范圍從7kb到10kb的片段連接到克隆載體。然后，將連接混合物電穿孔到大腸桿菌(E.coli)XL1-Blue細(xì)胞中。在含有X-gal和IPTG的LB-triacillin平板上鋪轉(zhuǎn)化體，選擇白色菌落用于濾膜雜交試驗(yàn)。然后，用如下制備的DIG標(biāo)記的探針篩選含有載體的重組大腸桿菌克隆。首先，利用來(lái)源于菌株BTS01099E的細(xì)胞作為模板進(jìn)行PCR。凝膠純化所得的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且克隆到pGEM-T中。利用DIG-標(biāo)記的dNTPs和與第一次PCR反應(yīng)中相同的引物，使用所得的質(zhì)粒做為PCR反應(yīng)中的模板。在雜交反應(yīng)中使用適當(dāng)量的該擴(kuò)增產(chǎn)物。
鑒定含有包含全長(zhǎng)isp3基因的質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落后，利用染料終止子標(biāo)記方法和Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA測(cè)序儀測(cè)定該基因的序列。測(cè)定編碼和非編碼鏈。
SEQ ID No.1中所示的是在陽(yáng)性菌落的克隆DNA片段中發(fā)現(xiàn)的開(kāi)放讀框序列(isp3-1099E)。發(fā)現(xiàn)該DNA序列編碼SEQ ID No.2中所示的新的蛋白質(zhì)(ISP3-1099E)。
為了證明該DNA序列是觀察到的殺昆蟲(chóng)活性的原因，在細(xì)菌菌株中表達(dá)該序列，在昆蟲(chóng)生物測(cè)定中測(cè)定重組菌株的上清液或細(xì)胞裂解液的殺昆蟲(chóng)活性。
從菌株BTS00327D克隆編碼ISP3-327D的核苷酸序列制備菌株BTS00327D的總DNA，用Sau3A部分消化。在蔗糖梯度上大小分級(jí)消化的DNA。BamH1消化和用TsAP(熱敏感性堿性磷酸酶)處理克隆載體pUC191(pUC19的衍生物；Yannisch-Perron等，1985)后，將范圍從7kb到10kb的片段連接到克隆載體。然后，將連接混合物電穿孔到大腸桿菌(E.coli)XL1-Blue細(xì)胞中。在含有X-gal和IPTG的LB-triacillin平板上涂轉(zhuǎn)化體，選定白色菌落用于濾膜雜交試驗(yàn)。然后，用如下制備的DIG標(biāo)記的探針篩選含有載體的重組大腸桿菌克隆。首先，利用來(lái)源于菌株BTS00327D的細(xì)胞作為模板進(jìn)行PCR。凝膠純化所得的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且克隆到pGEM-T中。利用DIG-標(biāo)記的dNTP和與第一次PCR反應(yīng)中相同的引物，使用所得的質(zhì)粒做為PCR反應(yīng)中的模板。在雜交反應(yīng)中使用適當(dāng)量的該擴(kuò)增產(chǎn)物。
鑒定含有包含全長(zhǎng)isp3基因的質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落后，利用染料終止子標(biāo)記方法和Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA測(cè)序儀測(cè)定該基因的序列。測(cè)定編碼和非編碼鏈。
SEQ ID No.3中所示的是在陽(yáng)性菌落的克隆DNA片段中發(fā)現(xiàn)的開(kāi)放讀框序列(isp3-327D)。發(fā)現(xiàn)該DNA序列編碼SEQ ID No.4中所示的新的蛋白質(zhì)(ISP3-327D)。
為了證明該DNA序列是觀察到的殺昆蟲(chóng)活性的原因，在細(xì)菌菌株中表達(dá)該序列，在昆蟲(chóng)生物測(cè)定中測(cè)定重組菌株的上清液或細(xì)胞裂解液的殺昆蟲(chóng)活性。
從菌株BTS02245J克隆編碼ISP3-2245J的核苷酸序列制備菌株BTS02245J的總DNA，用Sau3A部分消化。在蔗糖梯度上大小分級(jí)消化的DNA。BamH1消化和用TsAP(熱敏感性堿性磷酸酶)處理克隆載體pUC191(pUC19的衍生物；Yannisch-Perron等，1985)后，將范圍從7kb到10kb的片段連接到克隆載體。然后，將連接混合物電穿孔到大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞中。在含有X-gal和IPTG的LB-triacillin平板上涂轉(zhuǎn)化體，選定白色菌落用于濾膜雜交試驗(yàn)。然后，用如下制備的DIG標(biāo)記的探針篩選含有載體的重組大腸桿菌克隆。首先，利用來(lái)源于菌株BTS02245J的細(xì)胞作為模板進(jìn)行PCR。凝膠純化所得的擴(kuò)增產(chǎn)物，并且克隆到pGEM-T中。利用DIG-標(biāo)記的dNTP和與第一次PCR反應(yīng)中相同的引物，使用所得的質(zhì)粒做為PCR反應(yīng)中的模板。在雜交反應(yīng)中使用適當(dāng)量的該擴(kuò)增產(chǎn)物。
鑒定含有包含全長(zhǎng)isp3基因的質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落后，利用染料終止子標(biāo)記方法和Perkin Elmer ABI Prism-377 DNA測(cè)序儀測(cè)定該基因的序列。測(cè)定編碼和非編碼鏈。
SEQ ID No.5中所示的是在陽(yáng)性菌落的克隆DNA片段中發(fā)現(xiàn)的開(kāi)放讀框序列(isp3-2245J)。發(fā)現(xiàn)該DNA序列編碼SEQ ID No.6中所示的新的蛋白質(zhì)(ISP3-2245J)。
為了證明該DNA序列是觀察到的殺昆蟲(chóng)活性的原因，在細(xì)菌菌株中表達(dá)該序列，在昆蟲(chóng)生物測(cè)定中測(cè)定重組菌株的上清液或細(xì)胞裂解液的殺昆蟲(chóng)活性。
實(shí)施例4ISP3蛋白質(zhì)在大腸桿菌中的重組表達(dá)將SEQ ID No.1(isp3-1099E)，SEQ ID No.3(isp3-327D)和SEQ ID No.5(isp3-2245J)亞克隆到表達(dá)載體中位于cry1Ab啟動(dòng)子的控制下，并且在大腸桿菌菌株WK6中表達(dá)。在亞克隆期間，在ATG起始密碼子處引入NcoI限制位點(diǎn)，因此將SEQ ID No 2，SEQ ID No 4和SEQ ID No.6的第二個(gè)氨基酸從天冬酰胺(Asn)改變?yōu)樘於彼?Asp)。
轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的細(xì)胞裂解液的SDS-PAGE分析證明三個(gè)基因都產(chǎn)生了預(yù)期分子量(±88kDa)的蛋白質(zhì)。利用未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌wK6的細(xì)胞裂解液做為陰性對(duì)照。
如實(shí)施例5所述，在昆蟲(chóng)測(cè)定(表面污染測(cè)定)中使用表達(dá)isp3-327D和isp3-1099E的重組大腸桿菌培養(yǎng)物的細(xì)胞裂解液。在下面的表2中概述了該結(jié)果。加號(hào)表示超過(guò)陰性對(duì)照的顯著性昆蟲(chóng)死亡率。
表2

Hz美洲棉鈴蟲(chóng)，Hv煙芽夜蛾，Sf草地粘蟲(chóng)，Dvv玉米根蟲(chóng)(Diabroticavirgifera virgifer)，Ag藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)。
生物測(cè)定Hz在48多孔Costar平板中，在實(shí)夜蛾屬食物上表面污染，25μl/孔(1cm2)，每濃度18×1L1，Hv在24多孔Costar平板中，在實(shí)夜蛾屬食物上表面污染，50μl/孔(2cm2)，每濃度20×1L1，Sf在48多孔Costar平板中，在littoralis食物上表面污染，25μl/孔(1cm2)，每濃度18×1L1，Ag在24多孔Costar平板中，在littoralis食物上表面污染，50μl/孔(2cm2)，每濃度12×2L1，在25±1℃溫育；7天后計(jì)數(shù)。
對(duì)于ISP3-327D和ISP3-1099E蛋白質(zhì)，在利用美洲棉鈴蟲(chóng)，煙芽夜蛾，草地粘蟲(chóng)和藜豆夜蛾的表面污染測(cè)定中發(fā)現(xiàn)了顯著的死亡率。此外，表達(dá)ISP3-327D或ISP3-1099E的重組大腸桿菌的沒(méi)有稀釋的細(xì)胞裂解液顯示了抗歐洲玉米螟的顯著性死亡率(與對(duì)照WK6的0％的死亡率比較，對(duì)于ISP3-327D是50％(gi)死亡率，對(duì)于ISP3-1099E是26％(gi)的死亡率)。
實(shí)施例5ISP3蛋白質(zhì)在Bt中的重組表達(dá)將SEQ ID No.1(isp3-1099E)和SEQ ID No.5亞克隆到穿梭載體中，并且在晶體缺陷型的Bt菌株(IPS 78/11或Berliner 1715cry-)中表達(dá)。在生物測(cè)定中，利用此未轉(zhuǎn)化的Bt菌株的上清液做為陰性對(duì)照。
利用上述(實(shí)施例2)和下述(以測(cè)定LC50值)表面污染測(cè)定法，測(cè)定重組Bt菌株的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液抗鱗翅目昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，特別地抗煙芽夜蛾，美洲棉鈴蟲(chóng)，歐洲玉米螟，草地粘蟲(chóng)，小地老虎，棉花紅鈴蟲(chóng)和藜豆夜蛾(A.gemmatalis)的毒性。
如下獲得重組Bt菌株的上清液。在28℃，在含有紅霉素(20μg/ml)的LB瓊脂板上過(guò)夜生長(zhǎng)Bt菌株。對(duì)于小規(guī)模培養(yǎng)，接種含有紅霉素(20μg/ml)的20ml TB培養(yǎng)基，在28℃，在每分鐘約70轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上生長(zhǎng)65小時(shí)。65小時(shí)后，向培養(yǎng)物添加蛋白酶抑制劑混合物。該混合物具有下面的組分(所給的體積為添加到一份20ml培養(yǎng)物所需的體積)200μlPMSF(100mM)，200μl苯甲脒.HCl(100mM)/ε-氨基-正己酸(500mM)的混合物，400μl EGTA(0.5M)，40μl抗蛋白酶(0.5mg/ml)/亮抑酶肽(0.5mg/ml)和20μl β-巰基乙醇(14M)。
然后，在3000rpm，離心已經(jīng)添加了蛋白酶抑制劑混合物的培養(yǎng)基20分鐘。在一些情況下，利用Centriprep YM-10 Centrifugal Filter Devices(Millipore Cat.No.4305)濃縮上清液約4倍。
對(duì)于美洲棉鈴蟲(chóng)和煙芽夜蛾，在表面污染測(cè)定中利用下面的人工餌料水1L，瓊脂20g，大豆粉81g，麥胚36g， Wesson鹽混合物10g，蔗糖14.7g，Nipagin 1g，山梨酸1.1g，Vanderzant vit.mix.9.5g，玉米油5ml，制霉菌素0.06g，金霉素0.17g。
在用于其它鱗翅目昆蟲(chóng)的表面污染測(cè)定中，利用下面的人工餌料水1L，瓊脂20g，玉米粉112g，麥胚28g，酵母30g，山梨酸1.2g，Nipagin 1g，金霉素0.06g，制霉菌素0.03g，抗壞血酸4.8g。
在Costar 24多孔板的孔中分配人工餌料，使其固化。將50μl稀釋的上清液施用到每個(gè)孔的表面上(2cm2)。將1或2只幼蟲(chóng)(L1一齡)放置到每個(gè)孔上(這取決于物種，例如對(duì)于歐洲玉米螟是2只幼蟲(chóng)/孔)，每個(gè)上清液稀釋物使用約20到24只幼蟲(chóng)。檢測(cè)范圍在約4050到0.21ng/cm2的6到8個(gè)上清液稀釋物(稀釋倍數(shù)約是3)。保持該培養(yǎng)皿在25℃±1℃，7天后記錄死亡率(死亡幼蟲(chóng)對(duì)活的幼蟲(chóng)的百分?jǐn)?shù))。利用TB和標(biāo)準(zhǔn)餌料做為陰性對(duì)照。利用程序POLO PC(來(lái)自LeOra Software，1987，Berkely，California)，用probit分析計(jì)算LC50值和/或LC90值。LC50值是當(dāng)殺死50％試驗(yàn)的昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)時(shí)的總上清液蛋白質(zhì)濃度。
生物測(cè)定表明克隆序列isp3-1099E和isp3-2245J編碼的蛋白質(zhì)各自都引起了抗所選自鱗翅目昆蟲(chóng)的顯著性殺昆蟲(chóng)活性。
將SEQ ID No.3(isp3-327D)亞克隆到穿梭載體中，并且在晶體缺陷型Bt菌株IPS78/11中表達(dá)。在生物測(cè)定中，利用此未轉(zhuǎn)化的Bt菌株的上清液做為陰性對(duì)照。
SDS-PAGE分析表明培養(yǎng)物上清液含有分子量接近ISP3-327D蛋白質(zhì)的計(jì)算分子量(±88kDa)的蛋白質(zhì)。
利用實(shí)施例2中所述的表明污染測(cè)定法，表達(dá)SEQ ID No.3(isp3-327D)的Bt菌株IPS78/11的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)物上清液顯示了抗歐洲玉米螟(On)，棉花紅鈴蟲(chóng)(Pg)和美洲棉鈴蟲(chóng)(Hz)的顯著性殺昆蟲(chóng)活性，如表3中所示表3

gi幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)抑制/Dvv玉米根蟲(chóng)(Diabrotica virgifera virgifera)
生物測(cè)定在TB中26小時(shí)培養(yǎng)及隨后加入蛋白酶抑制劑混合物后，利用濃縮的上清液進(jìn)行上述表面污染測(cè)定。實(shí)夜蛾屬人工餌料(如上述)用于美洲棉鈴蟲(chóng)，而littorals人工餌料用于歐洲玉米螟和棉花紅鈴蟲(chóng)。對(duì)于美洲棉鈴蟲(chóng)和歐洲玉米螟，使用48孔Costar板，25μl/孔(1cm2)，18個(gè)孔，每孔1只L1幼蟲(chóng)。對(duì)于棉花紅鈴蟲(chóng)，使用24孔Costar板，50ul/孔(2cm2)，12個(gè)孔，每孔2只L1幼蟲(chóng)。Dvv人工餌料(如上述)用于Dvv，24孔板中，50μl/孔(2cm2)，6個(gè)孔，每孔4只L1幼蟲(chóng)。
生物測(cè)定表明克隆序列isp3-327D編碼的蛋白質(zhì)具有抗所選鱗翅目昆蟲(chóng)的顯著性殺昆蟲(chóng)活性。
實(shí)施例6ISP3-327D的進(jìn)一步鑒定表達(dá)SEQ ID No.3(isp3-327D)的晶體缺陷型Bt菌株IPS78/11的上清液用于檢測(cè)ISP3-327D蛋白質(zhì)的胰蛋白酶消化能力和所得到片段的毒性。如SDS-PAGE分析所測(cè)定，轉(zhuǎn)化的IPS78/11的培養(yǎng)物上清液的胰蛋白酶處理產(chǎn)生了約65kDa和約23kDa的兩條主要條帶。
在抗美洲棉鈴蟲(chóng)的表面污染測(cè)定中，利用胰蛋白酶處理的上清液(4小時(shí)處理；用終濃度0.1mM的PMSF終止反應(yīng))和沒(méi)有被胰蛋白酶處理的上清液。在48多孔板的實(shí)夜蛾屬食物上進(jìn)行表面污染測(cè)定(25μl/孔；1cm2)。檢測(cè)6種上清液稀釋度。每個(gè)稀釋度18個(gè)孔，每個(gè)孔使用1個(gè)L1幼蟲(chóng)。在7天后，在25±1℃溫育后，計(jì)算死亡率。
沒(méi)有處理的和胰蛋白酶處理的ISP3-327D蛋白質(zhì)的LC50值顯示了90％置信區(qū)間的重疊，表明胰蛋白酶處理的蛋白質(zhì)保留了抗美洲棉鈴蟲(chóng)的毒性活性。
實(shí)施例7重組ISP3蛋白質(zhì)的稻昆蟲(chóng)生物測(cè)定在上述大腸桿菌中表達(dá)isp3-1099E(SEQ ID No.1)、ISP3-327D(SEQID NO.3)和isp3-2245J(SEQ ID No.5)序列。
在昆蟲(chóng)生物測(cè)定中，檢測(cè)重組大腸桿菌的細(xì)胞裂解液抗4種鱗翅目水稻害蟲(chóng)的活性。每種蛋白質(zhì)檢測(cè)5到6個(gè)劑量。
(a)三化螟的生物測(cè)定從稻田收集三化螟成蟲(chóng)。收集成蟲(chóng)產(chǎn)出的卵，在30℃保持在培養(yǎng)皿中以孵化。在生物測(cè)定中使用新孵出的幼蟲(chóng)。
利用6cm的水稻莖鞘。從敏感品種TN1新切割的水稻莖上切下6cm長(zhǎng)的葉鞘段。沿著一個(gè)鞘外殼(sheath cover)分別將片段的最內(nèi)部分浸入不同劑量蛋白質(zhì)中30秒。在樣品試管(7cm長(zhǎng)；2.5cm直徑)中的2cm瓊脂凝膠上垂直固定處理的莖鞘。向每個(gè)處理的莖加入10-15只三化螟新生幼蟲(chóng)，密封試管，溫育5天。5天后，計(jì)算存活和死亡的幼蟲(chóng)數(shù)量。
(b)稻縱卷葉螟的生物測(cè)定從北部印度的稻田收集昆蟲(chóng)，在溫室中水稻植物上飼養(yǎng)昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)。將出現(xiàn)的成蟲(chóng)限于產(chǎn)卵室中，將產(chǎn)卵的植物保持在有水淺盤(pán)中進(jìn)行幼蟲(chóng)孵化。一天齡的幼蟲(chóng)用于生物測(cè)定中。
利用從分蘗期水稻植物新切割的葉片，在圓柱形小室中進(jìn)行生物測(cè)定。從水稻分蘗枝中間輪生體切下8cm長(zhǎng)的葉片。將葉片放置于小室中，并且施用不同的蛋白質(zhì)劑量。30分鐘后，向每個(gè)葉片上加5到10只幼蟲(chóng)。每個(gè)蛋白質(zhì)劑量至少利用3片葉片。溫育后5天，計(jì)算死亡和存活幼蟲(chóng)的數(shù)量。
(c)大螟生物活性測(cè)定從北部印度的稻田收集昆蟲(chóng)，在水稻植物上飼養(yǎng)。利用干豆粉、釀酒酵母、山梨酸、抗壞血酸、羥苯甲酸甲酯、瓊脂和水制成的人工餌料，在小玻璃瓶(直徑7.5cm×2.5cm)中進(jìn)行生物測(cè)定。將餌料分配到小玻璃瓶中不超過(guò)2cm的深度。每種蛋白質(zhì)劑量至少制備3個(gè)小玻璃瓶。將40μl試驗(yàn)劑量均勻地涂抹到每個(gè)小玻璃瓶的餌料表面，進(jìn)行1小時(shí)的干燥。每個(gè)小玻璃瓶添加10到15只一齡期大螟幼蟲(chóng)。7天后，計(jì)算死亡和存活幼蟲(chóng)的數(shù)量。
(d)Corn Spotted Stem Borer(Chilo partellus)的生物活性測(cè)定
在由紅豆粉、釀酒酵母、山梨酸、高梁葉粉、抗壞血酸、甲基對(duì)羥基苯甲酸、維生素、麥胚油、Wesson鹽混合物，瓊脂，甲醛和水制成的人工餌料上飼養(yǎng)昆蟲(chóng)。在生物測(cè)定中使用來(lái)自這些培養(yǎng)物的新生幼蟲(chóng)。如用于大螟所述方式進(jìn)行生物測(cè)定。
(e)水稻昆蟲(chóng)生物測(cè)定的結(jié)果在下面表4中概述了昆蟲(chóng)生物測(cè)定的結(jié)果，表明ISP3-327D和ISP3-1099E對(duì)4種鱗翅目水稻害蟲(chóng)，即，三化螟，稻縱卷葉螟，大螟和Corn Spotted Strn Borer(Chilo partellus)具有高度毒性。而且，ISP3-2245J蛋白質(zhì)顯示了對(duì)3種鱗翅目水稻害蟲(chóng)，即三化螟，稻縱卷葉螟和大螟的顯著性毒性，而沒(méi)有檢測(cè)到ISP3-2245J蛋白質(zhì)抗Chilo partellus的毒性。
表4

YSB三化螟，LF稻縱卷葉螟，PSB大螟，SSBSpotted Stem Borer；加號(hào)(+)表示與陰性對(duì)照比較顯著性的死亡率。
實(shí)施例8轉(zhuǎn)化植物中ISP3蛋白質(zhì)的產(chǎn)生構(gòu)建包含植物可表達(dá)啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，該啟動(dòng)子可操作地連接編碼ISP3-1099E，ISP3-327D或ISP3-2245J(或其毒性片段或變異體)的DNA序列和3’聚腺苷酸化信號(hào)。將前導(dǎo)序列，諸如來(lái)源于碧冬茄屬(Petunia)(Harpster等，1988)葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)基因的前導(dǎo)序列插入isp3 DNA的5’。優(yōu)選地，例如，如WO94/24264中所述，改變isp3-1099E，isp3-327D和isp3-2245J的密碼子使之適于宿主植物(例如，玉米、棉花或水稻)的密碼子使用。
用于驅(qū)動(dòng)isp3基因的啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子CaMV 35S(Hull和Howell，1987)，玉米泛素啟動(dòng)子，水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和木薯脈花葉病毒啟動(dòng)子。使用的3’35S、3’nos(Depicker等，1982)、3’ocs或3’基因7做為3’轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化信號(hào)。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將表達(dá)盒子插入T-DNA載體的左右邊界序列之間。
玉米(Zea mays)，棉花(陸地棉或海島棉和稻(Oryza sativa)的轉(zhuǎn)化。
如US 6,140,553中所述，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化玉米細(xì)胞，這里將這篇文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn)。如WO00/71733所述，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞，這里并入這篇文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn)。如WO92/09696所述穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞。
如上述文獻(xiàn)所述，再生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和小植株。對(duì)于另外含有選擇性標(biāo)記基因，諸如除草劑抗性基因，例如賦予對(duì)草甘膦抗性的2mEPSPS(EP0508 909和EP 0 507 698，并入其為參考文獻(xiàn))或賦予對(duì)草丙膦銨抗性的bar或PAT基因(EP0242236和EP0242246，并入作為參考)的構(gòu)建體，在含有選擇性試劑的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，這樣大多數(shù)選定的再生體都是轉(zhuǎn)化的。
通過(guò)ELISA、Southern印跡、Northern印跡和/或PCR分析從再生體中選定表達(dá)isp3基因的轉(zhuǎn)化體。然后針對(duì)抗鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的殺昆蟲(chóng)活性，(利用生物測(cè)定)選擇轉(zhuǎn)化事件，特別是單拷貝事件。與非轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物比較，含有嵌合基因isp3-1099E，isp3-327D或isp3-2245J的后代植物顯示提高的抗鱗翅目昆蟲(chóng)的抗性。特別地，具有高水平昆蟲(chóng)耐受性的植物表達(dá)高水平的ISP3蛋白質(zhì)和isp3 mRNA。
進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)化體的農(nóng)藝學(xué)性狀(正常的表型、產(chǎn)量、植物體系結(jié)構(gòu)(plant architecture)等)。種子增加后，在存在敏感昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的不同地區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的玉米、棉花或水稻植物的田間試驗(yàn)，證明在不同環(huán)境的田間條件下，表達(dá)ISP3蛋白質(zhì)的植物具有增加的昆蟲(chóng)耐受性。特別地，與沒(méi)有轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物比較，在昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的(人工或天然)的侵襲后，轉(zhuǎn)化植物的產(chǎn)量損失減少。
為了產(chǎn)生具有廣泛殺昆蟲(chóng)活性的植物，ISP3表達(dá)事件可以互相雜交并與表達(dá)具有不同，優(yōu)選地互補(bǔ)殺昆蟲(chóng)譜的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的其它轉(zhuǎn)基因植物雜交。利用針對(duì)一系列不同昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的生物測(cè)定法，測(cè)定雜交后代的殺昆蟲(chóng)活性。以此方式產(chǎn)生抗期望的一系列昆蟲(chóng)的具殺昆蟲(chóng)活性的植物。
本發(fā)明不限于上述玉米、棉花、大豆或水稻植物、轉(zhuǎn)化方法、載體構(gòu)建體(啟動(dòng)子、3’末端等)和所用的特定ISP3蛋白質(zhì)或DNA序列。本發(fā)明包括保留殺昆蟲(chóng)活性的ISP3蛋白質(zhì)的變異體或等同物。
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<223>蘇云金芽孢桿菌isp3-1099E的核苷酸序列<400>1atgaacatga ataatactaa attaaacgca agggccttac caagttttat tgattatttt 60aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaatatgat ttttaaaacg 120gatacaggtg gtaatctaac cctagacgaa atcttaaaga atcagcagtt actaaatgag 180atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240ttaaatacag aattatctaa ggaaatctta aaaattgcaa atgaacagaa tcaagtctta 300aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcatatata tctacctaaa 360attacatcta tgttaagtga tgtaatgaag caaaattatg cgctaagcct gcaaatagaa 420tacttaagta aacaattgca agaaatttcc gataagttag atattattaa cgtaaatgtt 480cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcatatc aacggattaa atatgtgaat 540gaaaaatttg aagaattaac ttttgctaca gaaaccactc taaaagtaaa agaggatgga 600tcccctgcag atattcttga tgagttaact gagttaactg aattagcgaa aagtgtaaca 660aaaaatgaag tggatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcttcgg aattaattgc taaagaaaat 780gtgaaaacaa gtggcagtga ggtaggaaat gtttataatt tcttaattgt attaacagct 840ctacaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgga aattattagg attagcagat 900attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960aacatccttc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgtaaa agctaaagga1020
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<223>蘇云金芽孢桿菌ISP3-1099E的氨基酸序列<400>2Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe1 5 10 15Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu35 40 45Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys50 55 60Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn65 70 75 80Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln85 90 95Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr100 105 110Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val115 120 125Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys130 135 140Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val145 150 155 160Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Ile165 170 175Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr180 185 190Thr Leu Lys Val Lys Glu Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu195 200 205Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Glu Val210 215 220Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly225 230 235 240Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile245 250 255Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr260 265 270Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr275 280 285Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr290 295 300Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val305 310 315 320Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Val325 330 335Lys Ala Lys Gly Ser Asp Arg Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys340 345 350
Pro Gly Tyr Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Met Thr355 360 365Val Leu Lys Ala Tyr Gln Ala Lys Leu Lys Gln Asp Tyr Gln Val Asp370 375 380Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ile Val Tyr Gly Asp Met Asn Lys Leu Leu385 390 395 400Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Ash Asn Ile Ala Phe405 410 415Pro Arg Glu Tyr Val Ile Thr Lys Leu Thr Phe Thr Lys Lys Met Asn420 425 430Ser Leu Arg Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly435 440 445Asp Met Asp Leu Asn Lys Thr Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr450 455 460Ser Arg Leu Ser Ala Ser Asn Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Leu465 470 475 480Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Val Val485 490 495Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg500 505 510Glu Ile Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile515 520 525Val Pro Pro Asn Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Asn Leu530 535 540Glu Gly Glu Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr545 550 555 560Ile Asp His Thr Gly Gly Val Lys Gly Thr Lys Val Leu Tyr Val His565 570 575Lys Asp Gly Glu Phe Ser Gln Phe Ile Gly Tyr Lys Leu Lys Ser Lys580 585 590Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Ile Val Lys Gly Lys Ala Val Ile Tyr595 600 605Leu Lys Asp Glu Lys Asn Gly Asp Tyr Ile Tyr Glu Glu Ile Asn Asn610 615 620Glu Leu Glu Asp Phe Gln Thr Val Thr Lys Arg Phe Ile Thr Gly Thr625 630 635 640Asp Ser Ser Gly Val His Leu Ile Phe Thr Ser Gln Asn Gly Glu Glu645 650 655Ala Phe Gly Gly Asn Phe Ile Ile Ser Glu Ile Arg Pro Ser Glu Glu660 665 670Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Lys Ser Asp Ala Trp Val Gly Thr Gln675 680 685
Gly A1a Trp Asn Ser Gly Asn Ser Leu Thr Ile Tyr Thr Asn Thr Asn690 695 700Gly Thr Phe Arg Gln Asn Leu Pro Leu Glu Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser705 710 715 720Met Asn Phe Asn Ile Thr Gly Phe Gly Lys Val Thr Ile Arg Asn Ser725 730 735Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Asn Phe Ser Gln Leu Ser Pro Lys Asp740 745 750Tyr Ser Glu Lys Phe Thr Thr Ala Ala Asn Asn Thr Gly Phe Tyr Val755 760 765Glu Leu Ser Arg Gly Thr Gln Gly Gly Asn Ile Thr Phe Arg Asp Phe770 775 780Ser Ile Lys785<210>3<211>2367<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>蘇云金芽孢桿菌isp3-327D的核苷酸序列<400>3atgaatatga ataatactaa attaaacgca agggccctac cgagttttat tgattatttt 60aatggcattt atggatttgc cactggtatc aaagacatta tgaatatgat ttttaaaacg 120gatacaggtg gtaatctaac cttagacgaa atcctaaaga atcagcagtt actaaatgag 180atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240ttaaatacag aattatctaa ggaaatctta aaaattgcaa atgaacagaa tcaagtctta 300aatgatgtta ataacaaact cgatgcgata aatacgatgc ttcatatata tctacctaaa 360attacatcta tgttaagtga tgtaatgaag caaaattatg cgctaagtct gcaaatagaa 420tacttaagta agcaattgca agaaatttct gataaattag atattattaa cgtaaatgtt 480cttattaact ctacacttac tgaaattaca cctgcatatc aacggattaa atatgtgaat 540gaaaaatttg aagaattaac ttttgctaca gaaaccactt taaaagtaaa aaaggatagc 600tcgcctgctg atattcttga tgagttaact gaattaactg aactagcgaa aagtgttaca 660aaaaatgacg ttgatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720aataatttat tcgggcgttc agctttaaaa actgcttcag aattaattgc taaagaaaat 780gtgaaaacaa gtggcagtga agtaggaaat gtttataatt tcttaattgt attaacagct 840ctacaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgaa aattattagg cttagcagat 900
attgattata cttctattat gaatgaacat ttaaataagg aaaaagagga atttagagta 960aacatccttc ctacactttc taatactttt tctaatccta attatgcaaa agttaaagga1020agtgatgaag atgcaaagat gattgtggaa gctaaaccag gacatgcatt ggttgggttt1080gaaatgagca atgattcaat cacagtatta aaagtatatg aggctaagct aaaacaaaat1140tatcaagttg ataaggattc cttatcggag gttatttatg gtgatacgga taaattattt1200tgtccagatc aatctgaaca aatatattat acaaataaca tagtattccc aaatgaatat1260gtaattacta aaattgattt cactaaaaaa atgaaaactt taagatatga ggtaacagcg1320aatttttatg attcttctac aggagaaatt gacttaaata agaaaaaagt agaatcaagt1380gaagcggagt atagaacgtt aagtgctaat gatgatggag tgtatatgcc attaggtgtc1440atcagtgaaa catttttgac tccgataaat gggtttggcc tccaagctga tgaaaattca1500agattaatta ctttaacatg taaatcatat ttaagagaac tactgctagc aacagactta1560agcaataaag aaactaaatt gatcgtccca ccaagtggtt ttattagcaa tattgtagag1620aacgggtcca tagaagagga caatttagag ccgtggaaag caaataataa gaatgcgtat1680gtagatcata caggcggagt gaatggaact aaagctttat atgttcataa ggacggagga1740ttttcacaat ttattggaga taagttaaaa ccgaaaactg agtatgtaat ccaatatact1800gttaaaggaa aaccttctat tcatttaaaa gatgaaaata ctggatatat tcattatgaa1860gatacaaata ataatttaaa agattatcaa actattacta aacgttttac tacaggaact1920gatttaaagg gagtgtattt aattttaaaa agtcaaaatg gagatgaagc ttggggagat1980aaatttacaa ttttagaaat taagcctgcg gaggatttat taagcccaga attaattaat2040ccgaattctt ggattacgac tccaggggct agcatttcag gaaataaact tttcattaac2100ttggggacaa atgggacctt tagacaaagt ctttcattaa acagttattc aacttatagt2160ataagcttta ctgcatcagg accatttaat gtgacggtaa gaaattctag ggaagtatta2220tttgaacgaa gcaaccttat gtcttcaact agtcatattt ctgggacatt caaaactgaa2280tccaataata ccggattata tgtagaactt tcccgtcgct ctggtggtgg tggtcatata2340tcatttgaaa acgtttctat taaataa2367<210>4<211>788<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>蘇云金芽孢桿菌ISP3-327D的氨基酸序列<400>4
Met Asn Met Asn Asn Thr Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe1 5 10 15Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp20 25 30Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asn Leu Thr Leu35 40 45Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys50 55 60Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn65 70 75 80Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gln85 90 95Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr100 105 110Met Leu His Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val115 120 125Met Lys Gln Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys130 135 140Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val145 150 155 160Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Iyr Gln Arg Ile165 170 175Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr180 185 190Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu195 200 205Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val210 215 220Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly225 230 235 240Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile245 250 255Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr260 265 270Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr275 280 285Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr290 295 300Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val305 310 315 320Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys340 345 350Pro Gly His Ala Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr355 360 365Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gln Asn Tyr Gln Val Asp370 375 380Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Leu Phe385 390 395 400Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe405 410 415Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys420 425 430Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly435 440 445Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr450 455 460Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val465 470 475 480Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly phe Gly Leu Gln Ala485 490 495Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg500 505 510Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile515 520 525Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile530 535 540Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr545 550 555 560Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His565 570 575Lys Asp Gly Gly Phe Ser Gln Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys580 585 590Thr Glu Tyr Val Ile Gln Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His595 600 605Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn610 615 620Asn Leu Lys Asp Tyr Gln Thr Ile Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr625 630 635 640Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gln Asn Gly Asp Glu645 650 655Ala Trp Gly Asp Lys Phe Thr Ile Leu Glu Ile Lys Pro Ala Glu Asp
660 665 670Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Pro Asn Ser Trp Ile Thr Thr Pro675 680 685Gly Ala Ser Ile Ser Gly Asn Lys Leu Phe Ile Asn Leu Gly Thr Asn690 695 700Gly Thr Phe Arg Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Tyr Ser Thr Tyr Ser705 710 715 720Ile Ser Phe Thr Ala Ser Gly Pro Phe Asn Val Thr Val Arg Asn Ser725 730 735Arg Glu Val Leu Phe Glu Arg Ser Asn Leu Met Ser Ser Thr Ser His740 745 750Ile Ser Gly Thr Phe Lys Thr Glu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Tyr Val755 760 765Glu Leu Ser Arg Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Ile Ser Phe Glu Asn770 775 780Val Ser Ile Lys785<210>5<211>2361<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>蘇云金芽孢桿菌isp3-2245J的核苷酸序列<400>5atgaacatga ataatgctaa attaaatgca agggccttac caagttttat tgattatttt 60aatggtattt atggatttgc cactggtatt aaagacatta tgaatatgat ttttaaaacg 120gatacaggtt ctaatctaac cctagacgaa attttaaaga atcagcagtt actaaatgaa 180atttctggta aattggatgg ggtaaatggg agcttaaatg atcttatcgc acagggaaac 240ttaaatacag aattagctaa gcaaatctta aaagttgcaa atgaacaaaa tcaagtttta 300aatgatgtta ataacaaact agatgcgata aattcgatgc ttaaaatata tctacctaaa 360attacatcta tgttaagtga tgtaatgaag caaaattatg tgctaagctt gcaaatagaa 420tacttaagta aacaattgca agaaatctcc gacaagctag atattattaa cgtaaatgtg 480cttattaact ctacgcttac tgaaattaca cctgcgtatc aacgaatgaa atatgtgaat 540gaaaaatttg aagaattaac ttttgctaca gaaaccactt taaaagtaaa aaaggatagc 600cctcctgctg atattcttga cgaattaact gaattaactg aactagcgaa aagtgttaca 660aaaaatgacg tggatggttt tgaattttac cttaatacat tccacgatgt aatggtagga 720aataatttat tcggtcgttc agctttaaaa actgcttcgg aattaattgc taaagaaaat 780
gtgaaaacaa gtggcagtga agtaggaaac gtttataatt tcttaattgt attaacagct 840ctacaagcaa aagcttttct tactttaaca acatgccgaa aattattagg cttagcagat 900attgattata cttctatcat gaatgagcat ttaaataagg aaaaagaaga atttagagta 960aacatccttc ccacactttc taataccttt tctaatccta attatgcaaa agctaaggga1020agtaatgaag atacaaagat gattgtggaa gctaaaccag gatatgtttt ggttggattt1080gaaatgagca atgattcaat tacagtatta aaagcatatc aagctaagct aaaaaaagat1140tatcaaattg ataaggattc gttatcagaa ataatatata gtgatacgga taaattatta1200tgtccggatc aatctgaaca aatatattat acaaagaaca tagcatttcc aaatgaatat1260gttattacta aaattgcttt tacaaaaaaa atgaacagtt taaggtatga ggcgacagcg1320aatttttatg attcttctac aggggatatt gatctaaata agacaaaagt agaatcaagt1380gaagcggagt atagtatgct aaaagctagt gatgatgaag tttacatgcc gctaggtctt1440atcagtgaaa catttttgaa tccaattaat ggatttaggc ttgcagtcga tgaaaattcc1500agactagtaa ctttaacatg tagatcatat ttaagagaga cattgttagc gacagattta1560aataataaag aaactaaatt gattgtccca cctaatgttt ttattagcaa tattgtagag1620aatggaaata tagaaatgga caccttagaa ccatggaagg caaataatga gaatgcgaat1680gtagattatt caggcggagt gaatggaact agagccttat atgttcataa ggatggtgaa1740ttctcacatt ttattggaga caagttgaaa tctaaaacag aatacttgat tcgatatatt1800gtaaaaggaa aagcttctat ttttttaaaa gatgaaaaaa atgaaaatta catttatgag1860gatacaaata ataatttaga agattatcaa actattacta aacgttttac tacaggaact1920gattcgacag gagtttattt aatttttaat agtcaaaatg gagatgaagc ttggggagat1980aactttatta ttttggaaat tagtccgtgt gaaaagttat taagtccaga attaattaaa2040acagataaat ggaatagtac gggatcaact tatattagcg atgatagact cactctttat2100cggggaggac gaggaatttt aaagcaaaac cttcaattag acggtttttc aacttataga2160gtcaattttt ctgtggacgg agatgctaat gtaaggattc gtaattctag ggaagtgtta2220cttgaaaaaa gatatttgaa ccgtaaaggt gtttctgaaa tgtttactac aaaatttgat2280aaagataact tttatgtaga gctttctcaa ggggataatc ttggtactat tgtacatttt2340tatgatttct ctattaaata a 2361<210>6<211>786<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>蘇云金芽孢桿菌ISP3-2245J的氨基酸序列<400>6Met Asn Met Asn Asn Ala Lys Leu Asn Ala Arg Ala Leu Pro Ser Phe1 5 10 15Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp20 25 30Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Ser Asn Leu Thr Leu35 40 45Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gln Gln Leu Leu Asn Glu Ile Ser Gly Lys50 55 60Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gln Gly Asn65 70 75 80Leu Asn Thr Glu Leu Ala Lys Gln Ile Leu Lys Val Ala Asn Glu Gln85 90 95Asn Gln Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Ser100 105 110Met Leu Lys Ile Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val115 120 125Met Lys Gln Asn Tyr Val Leu Ser Leu Gln Ile Glu Tyr Leu Ser Lys130 135 140Gln Leu Gln Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val145 150 155 160Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gln Arg Met165 170 175Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr180 185 190Thr Leu Lys Val Lys Lys Asp Ser Pro Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu195 200 205Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val210 215 220Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly225 230 235 240Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile245 250 255Ala Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr260 265 270Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Lys Ala Phe Leu Thr275 280 285Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr290 295 300Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala325 330 335Lys Ala Lys Gly Ser Asn Glu Asp Thr Lys Met Ile Val Glu Ala Lys340 345 350Pro Gly Tyr Val Leu Val Gly Phe Glu Met Ser Asn Asp Ser Ile Thr355 360 365Val Leu Lys Ala Tyr Gln Ala Lys Leu Lys Lys Asp Tyr Gln Ile Asp370 375 380Lys Asp Ser Leu Ser Glu Ile Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Lys Leu Leu385 390 395 400Cys Pro Asp Gln Ser Glu Gln Ile Tyr Tyr Thr Lys Asn Ile Ala Phe405 410 415Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Ala Phe Thr Lys Lys Met Asn420 425 430Ser Leu Arg Tyr Glu Ala Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly435 440 445Asp Ile Asp Leu Asn Lys Thr Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr450 455 460Ser Met Leu Lys Ala Ser Asp Asp Glu Val Tyr Met pro Leu Gly Leu465 470 475 480Ile Ser Glu Thr Phe Leu Asn Pro Ile Asn Gly Phe Arg Leu Ala Val485 490 495Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Tyr Leu Arg500 505 510Glu Thr Leu Leu Ala Thr Asp Leu Asn Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile515 520 525Val Pro Pro Asn Val Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Asn Ile530 535 540Glu Met Asp Thr Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Glu Asn Ala Asn545 550 555 560Val Asp Tyr Ser Gly Gly Val Asn Gly Thr Arg Ala Leu Tyr Val His565 570 575Lys Asp Gly Glu Phe Ser His Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Ser Lys580 585 590Thr Glu Tyr Leu Ile Arg Tyr Ile Val Lys Gly Lys Ala Ser Ile Phe595 600 605Leu Lys Asp Glu Lys Asn Glu Asn Tyr Ile Tyr Glu Asp Thr Asn Asn610 615 620Asn Leu Glu Asp Tyr Gln Thr Ile Thr Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr625 630 635 640
Asp Ser Thr Gly Val Tyr Leu Ile Phe Asn Ser Gln Asn Gly Asp Glu645 650 655Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Cys Glu Lys660 665 670Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Lys Thr Asp Lys Trp Asn Ser Thr Gly675 680 685Ser Thr Tyr Ile Ser Asp Asp Arg Leu Thr Leu Tyr Arg Gly Gly Arg690 695 700Gly Ile Leu Lys Gln Asn Leu Gln Leu Asp Gly Phe Ser Thr Tyr Arg705 710 715 720Val Asn Phe Ser Val Asp Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser725 730 735Arg Glu Val Leu Leu Glu Lys Arg Tyr Leu Asn Arg Lys Gly Val Ser740 745 750Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Asp Lys Asp Asn Phe Tyr Val Glu Leu755 760 765Ser Gln Gly Asp Asn Leu Gly Thr Ile Val His Phe Tyr Asp Phe Ser770 775 780Ile Lys78權(quán)利要求
1.包含與SEQ ID No.4具有至少91％序列同一性的氨基酸序列的分離的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
2.包含與SEQ ID No.6具有至少88％序列同一性的氨基酸序列的分離的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
3.包含與SEQ ID No.2具有至少91％序列同一性的氨基酸序列的分離的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
4.包含SEQ ID No.2的氨基酸序列或其最小毒性片段的分離的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
5.包含SEQ ID No.4的氨基酸序列或其最小毒性片段的分離的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
6.包含SEQ ID No.6的氨基酸序列或其最小毒性片段的分離的殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
7.如前述權(quán)利要求所述的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)具有抗至少一種選自以下的昆蟲(chóng)物種的殺昆蟲(chóng)活性美洲棉鈴蟲(chóng)、煙芽夜蛾、歐洲玉米螟、草地粘蟲(chóng)、小地老虎、棉花紅鈴蟲(chóng)、三化螟、稻縱卷葉螟、大螟、Chilopartellus和藜豆夜蛾。
8.編碼權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述蛋白質(zhì)的分離的核酸序列。
9.編碼權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述蛋白質(zhì)的分離的核酸序列，其中所述蛋白質(zhì)具有抗至少一種選自以下的昆蟲(chóng)物種的殺昆蟲(chóng)活性美洲棉鈴蟲(chóng)、煙芽夜蛾、歐洲玉米螟、草地粘蟲(chóng)、小地老虎、棉花紅鈴蟲(chóng)、三化螟、稻縱卷葉螟、大螟、Chilo partellus和藜豆夜蛾。
10.包含與SEQ ID No.1具有至少93％序列同一性的核苷酸序列的分離的核酸。
11.包含與SEQ ID No.3具有至少94％序列同一性的核苷酸序列的分離的核酸。
12.包含與SEQ ID No.5具有至少97％序列同一性的核苷酸序列的分離的核酸。
13.包含SEQ ID No.1的第1到2364位核苷酸的分離的核酸序列。
14.包含SEQ ID No.3的第1到2367位核苷酸的分離的核酸序列。
15.包含SEQ ID No.5的第1到2361位核苷酸的分離的核酸序列。
16.包含編碼殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的核酸序列的分離的核酸，其中該殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)包含在嚴(yán)格雜交條件下與SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或SEQID NO.5雜交的核酸序列的翻譯產(chǎn)物的氨基酸序列。
17.編碼權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述蛋白質(zhì)的分離的核酸序列，其中所述核酸序列是合成序列，該合成序列已被優(yōu)化用于單子葉植物或雙子葉植物中的表達(dá)。
18.包含可操作地連接權(quán)利要求8至17任一項(xiàng)所述核酸序列的啟動(dòng)子序列的嵌合基因。
19.包含可操作地連接核酸序列的啟動(dòng)子序列的嵌合基因，該核酸序列編碼SEQ ID No.2的氨基酸序列或其最小毒性片段。
20.包含可操作地連接核酸序列的啟動(dòng)子序列的嵌合基因，該核酸序列編碼SEQ ID No.4的氨基酸序列或其最小毒性片段。
21.包含可操作地連接核酸序列的啟動(dòng)子序列的嵌合基因，該核酸序列編碼SEQ ID No.6的氨基酸序列或其最小毒性片段。
22.包含權(quán)利要求18至21任一項(xiàng)所述嵌合基因的載體。
23.包含權(quán)利要求18至21任一項(xiàng)所述嵌合基因的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞。
24.如權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是微生物。
26.包含權(quán)利要求18至21任一項(xiàng)所述嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物。
27.如權(quán)利要求26所述的植物，其中所述植物是玉米、棉花、稻或大豆植物。
28.保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)損害的方法，包括用殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)接觸所述植物，其中所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID No.2的氨基酸序列。
29.保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)損害的方法，包括用殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)接觸所述植物，其中所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID No.4的氨基酸序列。
30.保護(hù)植物免受昆蟲(chóng)損害的方法，包括用殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)接觸所述植物，其中所述蛋白質(zhì)具有SEQ ID No.6的氨基酸序列。
31.如權(quán)利要求28至30任一項(xiàng)所述的方法，其中所述殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)由整合在所述植物的基因組中的嵌合基因編碼。
32.如權(quán)利要求28至30任一項(xiàng)所述的方法，其中給所述植物外部施用所述蛋白質(zhì)。
33.如權(quán)利要求28至30任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物是玉米、棉花、大豆或稻植物。
34.包含權(quán)利要求8所述核酸序列的蘇云金芽孢桿菌菌株。
35.包含權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述蛋白質(zhì)的殺昆蟲(chóng)組合物，當(dāng)給植物外部施用這種殺昆蟲(chóng)組合物時(shí)，與沒(méi)有施用這種組合物的對(duì)照植物比較，該組合物增加植物對(duì)昆蟲(chóng)損害的抗性。
36.進(jìn)化編碼ISP3蛋白質(zhì)的核酸序列的方法，該方法包括步驟(a)提供編碼SEQ ID No.2和/或4和/或6的氨基酸序列、或SEQID No.2和/或4和/或6的氨基酸序列的變異體或片段的核酸序列群，其中所述變異體或片段與SEQ ID No.2或4具有至少91％序列同一性，與SEQID No.6具有至少88％序列同一性，(b)改組所述變異體或片段的群體以形成重組核酸分子，(c)選擇或篩選編碼具有殺昆蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)的重組核酸分子，(d)用在步驟(c)中選擇的重組核酸分子重復(fù)步驟(a)到(c)，直到在步驟(c)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)編碼的蛋白質(zhì)具有期望的殺昆蟲(chóng)特性的重組核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物害蟲(chóng)控制領(lǐng)域，特別是昆蟲(chóng)控制。提供了來(lái)源于蘇云金芽孢桿菌的、編碼殺昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)的核苷酸序列。進(jìn)一步提供了利用所述核苷酸序列控制植物昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的方法和手段。
文檔編號(hào)A01N65/00GK1642977SQ03806654
公開(kāi)日2005年7月20日 申請(qǐng)日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月22日
發(fā)明者G·阿爾諾, A·伯特斯, K·德魯?shù)聽(tīng)? S·萬(wàn)內(nèi)斯特, J·范瑞 申請(qǐng)人:拜爾生物科學(xué)公司