專利名稱：青枯病生防菌anti－8098a及其培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和生防應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及其篩選、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基，特別涉及一種青枯病生防菌及其培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和生防應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)菌性青枯病是一種由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一類毀滅性土傳病害，此病菌可危害44個科300多種植物，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，該病害危害較重分布較廣的寄主主要有馬鈴薯、番茄、煙草、茄子、辣椒、花生、姜、香蕉、甘茹、麻等。近年又陸續(xù)報道在油橄欖、桑、木麻黃、木薯、番荔枝、澳洲松、桉樹等木本植物和蠶豆、大豆、豇豆、羽扇豆、南瓜、大白菜、蘿卜、茴香、棉花、三葉草、聚合草、草莓等草本植物上發(fā)生的青枯病，可以說細(xì)菌性青枯病是危害最大，分布最廣，損失最重的植物病害之一。單就福建省而言，就有近500萬畝煙草、花生、番茄、甜辣等作物感染該病害，一般年份發(fā)病率在10-30％，嚴(yán)重田塊達(dá)100％。近年來，隨著全球性氣候變化，氣溫上升，細(xì)菌性青枯病的危害逐年加重，成為一些地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主要障礙。
對于此病的防治，長期以來主要采用高抗品種和進(jìn)行水旱輪作的方式，但防治效果不甚理想，其原因，一是細(xì)菌性青枯病沒有真正高抗品種，二是水旱輪作在許多地區(qū)難以施行。而藥劑防治一般說來成本高，害蟲病菌容易產(chǎn)生抗藥性而效果不穩(wěn)定，并且會因藥物的殘留而破壞土壤，污染環(huán)境。
生物防治是近幾年來國內(nèi)外十分重視的防治措施，我國亦有利用從土壤中篩選出來的微生物菌株來防治細(xì)菌性青枯病的事例，例如熒光假單孢桿菌(何禮遠(yuǎn)等，1990)及芽孢桿菌的利用(楊合同等，1990)，但是利用蠟狀芽孢桿菌來防治細(xì)菌性青枯病，有見報導(dǎo)只有Silveira等在1995年篩選所得的蠟狀芽孢BA3(Bacillus cereus)，其溫室防治效果為42.60％。上述這些微生物制劑在實際應(yīng)用過程中，防治效果經(jīng)常不穩(wěn)定，或不顯著，可治療的植物種類也較單一，適用范圍較窄，主要原因是所篩選的生防菌株品質(zhì)不理想，?；蕴?。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，而提供一種可用于防治細(xì)菌性青枯病的高效、廣譜、性能穩(wěn)定、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的青枯病生防菌菌株；該青枯病生防菌供篩選菌株的采集及對其進(jìn)行進(jìn)一步篩選的方法；青枯病生防菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法及所采用的培養(yǎng)基；含有該青枯病生防菌的生物農(nóng)藥，即其生防應(yīng)用。
本發(fā)明的目的之一提供一種青枯病生防菌菌株可經(jīng)如下方案來實現(xiàn)。
青枯病生防菌菌株，其要點在于，該菌株為ANTI-8098A，于2001年12月11日保藏于“德國微生物保存中心(DSMZ)”，其保藏號為DSMID 00-1000，其微生物分類命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。
該青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 00-1000)具有如下的微生物學(xué)特征1、形態(tài)學(xué)特征觀察在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度30℃，時間72小時)的菌落形態(tài)特征為菌落呈圓形，擴展速度快，表面呈乳白色，菌苔較厚，中間微凸起且光滑，邊緣半光滑且整齊。在30℃下培養(yǎng)24小時單菌落直徑可達(dá)1.5-2.0mm，培養(yǎng)48小時菌落直徑增大到6.0-7.5mm，且顏色加深，菌苔加厚，培養(yǎng)72小時菌苔豐滿有光澤。
在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的個體形態(tài)特征為呈桿狀，寬0.6-10um，長2.0-4.5um(如圖1所示)。
在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的鞭毛特征為細(xì)，只有0.02-0.03um。
芽孢及伴孢晶體在光學(xué)顯微鏡下所觀察的形態(tài)特征為呈長橢圓型，周邊長有鞭毛且能夠運動(如圖2所示)。
2、生理生化特征
①其檢測方法如下碳源利用試驗在Ayer’s基本培養(yǎng)基(NH4H2PO41.0g，KCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，蒸餾水1000.0ml，水洗瓊脂17g)中加入各碳素化合物，使最終濃度為0.2％，培養(yǎng)基倒成平板，用移菌環(huán)蘸細(xì)菌懸浮液(106cfu/ml)點種，在28℃下培養(yǎng)72-96小時，觀察細(xì)菌生長情況。
卵磷脂酶試驗在無菌的條件下取出新鮮雞蛋的蛋黃，加入等量的生理鹽水，混合均勻，取10ml花生蛋黃溶液加入融化的55℃的200毫升金氏B培養(yǎng)基中混合均勻后移到平板上過夜，取24小時的細(xì)菌培養(yǎng)物點狀接種，28℃培養(yǎng)，48小時后觀察結(jié)果，如果菌落的周圍和菌落下面有不透明區(qū)域出現(xiàn)，表示陽性反應(yīng)。
明膠的液化試驗培養(yǎng)基為牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，明膠120.0g，蒸餾水1000.0ml，pH7.2。每只試管分裝培養(yǎng)基7ml，在121℃滅菌15分鐘，冷卻，穿刺接種，放在25℃培養(yǎng)，于培養(yǎng)后的第3、7、14和21天取出試管，放在15℃冷水中，觀察培養(yǎng)基是否被液化。
接觸酶試驗挑取培養(yǎng)基上生長24-48小時的菌苔置于干凈的載玻片上，滴加3％的過氧化氫，30秒內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生的為陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。
V-P試驗(產(chǎn)生3-羥基丁酮試驗)及pH變化將細(xì)菌接種在以下培養(yǎng)基中蛋白胨9g，葡萄糖5g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml。28℃培養(yǎng)4天，每毫升培養(yǎng)基加入0.1N氫氧化鈉(含肌酸0.3％)溶液，在48-50℃水浴中處理2小時，充分搖動，4小時內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)。另外取培養(yǎng)基用酸度計測定pH變化。
吲哚試驗培養(yǎng)基胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，蒸餾水1000ml滅菌冷卻后接種細(xì)菌，于28℃培養(yǎng)5天，在5毫升培養(yǎng)基中加入2.5毫升Kovacs試劑，如果培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)。Kovacs試劑的配制是溶解5g對二甲氨基甲醛于75毫升戊醇或者丁醇中，在50-55℃水浴中緩緩加熱，冷卻后加入25毫升濃鹽酸，避光儲存于4℃冰箱中備用。
水解酪蛋白和酪氨酸試驗在培養(yǎng)基中加入1％的酪蛋白或者酪氨酸，充分搖勻后制備平板，點接細(xì)菌于28℃條件下培養(yǎng)5天，逐日觀察，如果在菌落周圍或者菌落下面產(chǎn)生了透明的區(qū)域，表示酪蛋白或者酪氨酸被水解。
淀粉水解試驗細(xì)菌可以產(chǎn)生淀粉酶，將淀粉水解為糖類，測定用培養(yǎng)基為牛肉浸膏2.0g，蛋白胨17.5g，淀粉1.5g，瓊脂17.0g，蒸餾水1000ml，pH7.0。細(xì)菌接種于以上培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)48小時，在平板上加入碘液(碘1.0g，碘化鉀2.0g，蒸餾水300ml)，培養(yǎng)基呈現(xiàn)深藍(lán)色，菌落周圍為無色透明或者淺棕色為陽性反應(yīng)。
苯丙氨酸脫氨酶試驗制備如下培養(yǎng)基酵母膏3g，DL-苯丙氨酸2g，磷酸氫二鈉1g，氯化鈉5g，瓊脂12g，pH7.2。分裝培養(yǎng)基于試管中，滅菌后擺成斜面，接種細(xì)菌，28℃培養(yǎng)5天，向試管中加入10％的氯化鐵溶液，如果在培養(yǎng)基表面或者試管中的冷凝水中有綠色出現(xiàn)，表示有苯丙氨酸酶存在。
糖類產(chǎn)酸和產(chǎn)氣試驗采用Ayer’s基本培養(yǎng)基酵母膏0.2g，NH4H2PO41.0g，KCl 0.2g，MgSO4·7H4O 0.2g，蒸餾水1000.0ml，溴百里酚藍(lán)(1.6％酒精溶液)1.5ml，pH7.0。以上基本培養(yǎng)基分裝在試管中，加入杜氏小玻璃管，于121℃20分鐘滅菌后加入過濾滅菌的碳素化合物，使終濃度為1％，用移菌環(huán)蘸細(xì)菌懸浮液(106cfu/ml)接種，以不含有待測碳素化合物的培養(yǎng)基為對照。在28℃下培養(yǎng)5天，觀察細(xì)菌是否生長，如果培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，表示產(chǎn)酸，如果變?yōu)樗{(lán)色，表示產(chǎn)堿，產(chǎn)氣時在杜氏管中可以看到培養(yǎng)基的排空。
好氣性測定試驗采用沒有瓊脂的金氏B培養(yǎng)液，分裝試管，每只試管7毫升，于121℃滅菌20分鐘，快速冷卻后立即接種106cfu/ml的細(xì)菌懸浮液0.1ml，其中5個接種試管于接種后立即用滅菌的石蠟油封閉，另外5只試管不封管，于28℃培養(yǎng)72小時，觀察細(xì)菌是否生長。如果在封閉管中細(xì)菌可以大量生長，表示細(xì)菌可以進(jìn)行厭氧生長。
溫度適應(yīng)性試驗采用沒有瓊脂的金氏B培養(yǎng)液，分裝試管，每只試管7毫升，于121℃滅菌20分鐘，接種106cfu/ml的細(xì)菌懸浮液0.1ml，于5，30和40℃水浴中培養(yǎng)72小時，觀察細(xì)菌是否生長。
未列出的試驗方法采用《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》推薦生理生化測定方法對該青枯病生防菌進(jìn)行生理生化特征測定。
②檢測結(jié)果試驗結(jié)果見表1，該青枯病生防菌菌株V-P反應(yīng)(Ph＝4.9)呈陽性，V-P反應(yīng)(pH4.9)不產(chǎn)生吲哚，甲基紅反應(yīng)、卵黃反應(yīng)、明膠液化、石蕊牛奶胨化、淀粉水解、接觸酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原反應(yīng)均呈陽性，氧化酶呈陰性，不產(chǎn)生H2S；生長特性表現(xiàn)為2％NaCl、5％NaCl、pH5.7、45℃條件下能生長，7％NaCl、10％NaCl、50℃條件下不能生長，好氧和兼性厭氧；產(chǎn)酸反應(yīng)表現(xiàn)為D-葡萄糖、D-果糖陽性，D-木糖、L-阿拉伯糖、D-乳糖、D-甘露醇呈陰性；分解特性上的特征表現(xiàn)為酪蛋白、賴氨酸、檸檬酸鈉、吐溫80呈陽性，酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸鈉、醋酸鈉、水楊苷呈陰性；對7種碳源的利用速度為葡萄糖＞果糖＞麥芽糖＞蔗糖＞纖維糖，而甘露醇和乳糖則不能被分解利用；對3種氮源的利用的速度不一，硫酸銨＞氨水＞硝酸鉀，不能利用尿素。
表1青枯病生防菌(Bacillus cereus strain ANTI-8098A)的生理生化特征


而經(jīng)如下的保藏機構(gòu)保藏單位名稱德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)保藏單位地址德國波恩大學(xué)植物病理研究所(Institut furPflanzenkrankheiten Nussallee 953115 Bonn)聯(lián)系電話0531/26 16-231保藏時間2001年12月11日保藏號DSM ID 01-1000該青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A)的保藏檢測報告見表2表2


同時該保藏中心提供的本青枯病生防菌的檢測報告也表明該菌株為一種新的用于防治青枯病的蠟狀芽孢桿菌。
青枯病生防菌ANTI-8098A對番茄、茄子、辣椒、煙草、生姜的青枯病有較好的防治效果，經(jīng)農(nóng)業(yè)部藥檢所指定的田間藥效測定表明，對茄子青枯病的防效在75-85％(試驗許可編號NF010097)。發(fā)明人所作的大量的田間試驗的結(jié)果為對各種經(jīng)濟作物的田間防治實驗的防治效果達(dá)80％以上，例如對番茄、辣椒青枯病具有較高的防效，采用沾根、毒土、灌根法對辣椒青枯病防治效果分別可達(dá)83.8％、82.1％、85.1％等；采用沾根、毒土、灌根法對番茄青枯病防治效果分別可達(dá)87.7％、86.36％、81.0％等。而現(xiàn)有技術(shù)篩選而得的青枯病防治菌的防治效果一般小于50％，且本發(fā)明提供的蠟狀芽狀桿菌的實施其環(huán)境要求不高，任何田間均可實施，防治效果穩(wěn)定，可治療的植物種類多樣化，適用范圍廣。
本發(fā)明還具有兩個出乎意料的效果被該青枯病生防菌ANTI-8098A處理過的果實果身勻稱光滑、長短適中、果形更好看，因而提高了果實的品質(zhì)；同時經(jīng)處理的果實的產(chǎn)量提高了。
本發(fā)明提供的保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌對青枯病菌的防治作用體現(xiàn)為對普通青枯病菌的抑制作用和對強青枯病菌的弱化作用。
發(fā)明人在觀察保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌對青枯菌的致病性變化的影響(即抑菌機理)過程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌處理后的青枯菌的強菌株(弱化指數(shù)＜75％)再次培養(yǎng)全部變?yōu)榍嗫菥蹙?弱化指數(shù)＞75％)，并將這一現(xiàn)象定義為致弱現(xiàn)象(Attenuation)。
為了減少本發(fā)明的篇幅，至于致弱現(xiàn)象的研究試驗的步驟及詳細(xì)的結(jié)果的比對詳見具體實施方式
中的實施例4的描述。
本發(fā)明所述的青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A)供篩選菌株的采集方法的基本步驟1、提供一種土壤，2、將一份土壤與九份無菌水(重量比)于玻璃器皿中混勻，3、將混合物振蕩20min后靜置20～30s，即得10-1稀釋液，4、將一份10-1稀釋液與九份無菌水(重量比)混勻而得10-2稀釋液，以此類推，連續(xù)稀釋而制得10-4稀釋液、10-5稀釋液、10-6稀釋液，5、將10-4稀釋液、10-5稀釋液、10-6稀釋液分別均勻涂抹于不同編號的培養(yǎng)基上，并于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6、挑取乳白色、邊緣光滑、表面微隆起的桿狀單菌落供篩選使用。
本發(fā)明為獲得對青枯病菌最佳的生物防治菌株，總共采集了近百種的土壤樣本，分離而得供篩選的菌株一萬多種。
所提供的土壤一般為易患細(xì)菌性青枯病的經(jīng)濟作物的根系土壤，特別是茄科作物的根系土壤更為適用。
對稀釋液進(jìn)行稀釋時需采用不同的移液管，這樣可以保證得到準(zhǔn)確濃度的溶液。
培養(yǎng)基為一般固體培養(yǎng)基即可，本發(fā)明人提供一種NA培養(yǎng)基用于對稀釋后的菌液進(jìn)行培養(yǎng)，其配方為牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、瓊脂1.8％。
NA培養(yǎng)基的pH為7.2。
該培養(yǎng)基同樣可供青枯病生防菌篩選時使用。
將10-4稀釋液、10-5稀釋液、10-6稀釋液分別均勻涂抹于不同的培養(yǎng)基后在常溫下平放20～30min，這樣便于稀釋液滲透進(jìn)培養(yǎng)基內(nèi)。
培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)時間為48h。
48h后，培基內(nèi)會有菌落長出，其菌落特征為乳白色、邊緣光滑、表面微隆起，若將菌落制成涂片，經(jīng)堿性品紅染色后在顯微鏡下觀察，具有芽孢、桿狀菌體的單菌落即為青枯病生防菌。
本發(fā)明從復(fù)數(shù)份的土壤樣本中采集分離出成千上萬株供篩選使用的菌株，根據(jù)擇優(yōu)入用的原則，本發(fā)明人采用提供青枯病菌作為病害指示菌對這些采集而得的芽孢桿菌進(jìn)行篩選，該青枯病生防菌的篩選步驟依序如下1、提供一株供篩選菌株，2、將供篩選菌株點接于培養(yǎng)基上，3、將培養(yǎng)基置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時而成第一菌群，4、提供一種青枯病菌指示菌，5、將該指示菌配成濃度為107cfu/ml的懸液，6、將懸液噴布于第一菌群中，并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，7、觀察菌落，抑菌圈大于2mm者為對青枯病菌具有拮抗作用的菌株。
本發(fā)明首先以煙草青枯病菌作為指示菌對供篩選的芽孢桿菌進(jìn)行初篩而得第一批具有一定拮抗作用的芽孢桿菌，接著再從蕃茄、甜菜、煙草、茄子等受害作物中分離青枯病菌作為指示菌，而將對青枯病菌具有拮抗作用的菌株進(jìn)行復(fù)數(shù)次的篩選。最后得出對全部指示菌都有抑菌作用的菌株為青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID01-1000)。
本發(fā)明將最后篩選而得的青枯病生防菌(Bacillus cereusANTI-8098A DSM ID 01-1000)配制成濃度為109cfu/ml的菌液，將分離而得的蕃茄青枯病假單孢桿菌菌株(F4)配制成1×107cfu/ml的菌液，同時提供多個圓形實驗盆，直徑20cm，高度20cm，并裝滿消毒的土壤，接著將3-4片真葉的番茄幼苗根部洗盡后，直接栽于消毒土壤中。處理1澆灌蕃茄青枯病假單孢桿菌菌株菌液20ml，處理2澆灌青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 01-1000)菌液和蕃茄青枯病假單孢桿菌菌株菌液各20ml，處理3澆灌清水20ml為對照。每個處理30株苗，置于28-30℃溫度、90-100％濕度的光波溫室內(nèi)。
試驗結(jié)果為接青枯病菌的30株番茄7天后開始發(fā)病，發(fā)病株達(dá)27株，第九天發(fā)病番茄全株萎蔫，發(fā)病率達(dá)90.0％。接青枯病菌和生防菌ANTI-8098的30株番茄苗發(fā)病2株，發(fā)病率僅為6.6％。對照組皆未發(fā)病。試驗結(jié)果表明，青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID01-1000)組比直接使用番茄青枯病菌的發(fā)病率下降92.6％，說明青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 01-1000)對番茄青枯病有很好的防效。
表3 青枯病生防菌ANTI-8098A對番茄青枯病的控制效果

分離篩選出青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID01-1000)后則需對其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步還在于提供一種青枯病生防菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，所用菌株為分離篩選而得的青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 01-1000)，具體步驟如下1、提供一種青枯病生防菌菌種及裝有第一培養(yǎng)基的若干玻璃器皿，2、將菌種接種到第一培養(yǎng)基上，經(jīng)溫度30℃、時間18h的活化培養(yǎng)而得菌種A，3、將菌種A與無菌水混勻制得懸液，4、提供一種種子罐及第二培養(yǎng)基，5、按5％的接種量將菌種A接種至裝有第二培養(yǎng)基的種子瓶，并發(fā)酵12h而得種子液，6、提供一種發(fā)酵罐及第三培養(yǎng)基，
7、將種子液移入裝有第三培養(yǎng)基的發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度28℃～31℃，時間24～48h，轉(zhuǎn)速180r/m～220r/m，通氣量15～40ml瓶裝量。
8、每隔8h提取菌液一次，觀察菌液中的菌體數(shù)超過30×108個/ml即可放罐。
為了實現(xiàn)青枯病生防菌的大批量工業(yè)化生產(chǎn)，需對該菌株進(jìn)行大規(guī)模擴大培養(yǎng)，以便使該菌株能對各地出現(xiàn)的青枯病菌災(zāi)害進(jìn)行防治，這樣才能真正達(dá)到本發(fā)明的最終目的。
一般菌株的大批量發(fā)酵生產(chǎn)的過程為小批量活化培養(yǎng)→種子瓶(種子罐)培養(yǎng)→大批量發(fā)酵罐培養(yǎng)，所不同的是發(fā)酵生產(chǎn)過程中各種條件參數(shù)的設(shè)定，它們關(guān)系生產(chǎn)的效率、成本及產(chǎn)品的抑菌效果等諸多因素，如不同通氣量、pH值、溫度對青枯病生防菌(Bacillus cereusANTI-8098A DSM ID 01-1000)發(fā)酵液的孢子數(shù)和抑菌圈值有極顯著的影響(P＜0.01)。
采用常規(guī)的技術(shù)方案亦可對本發(fā)明所提供的青枯病生防菌進(jìn)行大批量擴大生產(chǎn)，但是本發(fā)明是通過多次重復(fù)的正交試驗才優(yōu)化選擇而得出所提供的青枯病生防菌發(fā)酵生產(chǎn)方法的各種條件參數(shù)。結(jié)果表明經(jīng)此發(fā)酵生產(chǎn)方法對青枯病生防菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)時，發(fā)酵液的孢子數(shù)量較多，一般能達(dá)30×108cfu/ml以上，抑菌圈值達(dá)10mm以上。發(fā)酵液的孢子數(shù)多說明生產(chǎn)的效率高，進(jìn)而成本就低。
本發(fā)明所提供的第一培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，因而只需含有瓊脂或其類似物用作培養(yǎng)基材料的物質(zhì)即可，例如本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員共知的普通試管斜面培養(yǎng)基，本發(fā)明提供一種第一培養(yǎng)基的配方為牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.5％、NaCl 0.5％、瓊脂2％、pH7.0。
而第二培養(yǎng)基、第三培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，它們的配方可相同亦可不同，本發(fā)明提供一種第二培養(yǎng)基、第三培養(yǎng)基的配方為豆餅粉3.0～5.0％、玉米漿0.8～1.2％、玉米淀粉0.2～0.4％、蛋白胨0.2～0.4％、KH2PO40.06～0.07％、MgSO40.02～0.04％、CaCO30.2～0.3％。
其中的蛋白胨提供氮源，玉米淀粉提供碳源，豆餅粉既提供氮源又提供碳源。
尤以豆餅粉4.0％、玉米漿1.0％、玉米淀粉0.3％、蛋白胨0.3％、KH2PO40.07％、MgSO40.03％、CaCO30.1％為最佳。
而第二培養(yǎng)基、第三培養(yǎng)基的pH值為7.0～8.0。
尤以第二培養(yǎng)基、第三培養(yǎng)基的pH值為7.5最佳。
以下部分主要涉及含有青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098ADSM ID 01-1000)的生物制劑、生物殺蟲劑，即其對青枯病菌的生物防治。
一種純生物菌株培養(yǎng)物，其要點在于，其具有保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌的菌株。
這樣，基于前文所述的青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098ADSM ID 01-1000)對青枯病菌的有效抑制作用，該生物菌株培養(yǎng)物亦可對青枯病菌本身進(jìn)行抑制，且可以用于進(jìn)行青枯病生防菌(Bacillus cereusANTI-8098A DSM ID 01-1000)的擴大再生產(chǎn)。
一種純生物菌株培養(yǎng)物，其要點在于，其具有保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的突變體的所有鑒定特征。
該處突變體的定義為其在高度嚴(yán)格的條件下鑒定具有可與青枯病生防菌ANTI-8098A DSM ID 01-1000的基因組雜交(指一個或多個核苷酸反應(yīng)而形成的核苷酸堿基間的氫鍵穩(wěn)定的化合物的反應(yīng))的基因組。該兩種基因組的相同性(或同源性)以85％以上序列相同為基準(zhǔn)，它們的比對方法可采用本領(lǐng)域所熟知的軟件程序進(jìn)行，而此處鑒定特征以保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的保藏報告為準(zhǔn)。
本發(fā)明還在于提供一種純生物菌株培養(yǎng)物，其要點在于，其包含有保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌的菌株和具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
本發(fā)明進(jìn)一步還在于提供一種含有純生物菌株培養(yǎng)物的生物農(nóng)藥，其要點在于，該生物菌株培養(yǎng)物或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鑒定特征的突變體，或同時具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
生物農(nóng)藥是指作為農(nóng)藥使用的由生物體直接產(chǎn)生的具有生物活性的物質(zhì)或具有拮抗作用的生物體，以及人工合成的與天然化合物結(jié)構(gòu)相同的活性物質(zhì)，也稱生物源農(nóng)藥。
本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究試驗，目的也就是要找出一種高效、廣譜、性能穩(wěn)定的抑制細(xì)菌性青枯病的菌種，并將這種菌種制成生物殺蟲劑?；谇拔乃龅募兩锞昱囵B(yǎng)物對青枯病菌的有效抑制作用，該生物農(nóng)藥亦可對青枯病菌本身進(jìn)行抑制。而其制備方法可以采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)方案進(jìn)行。例如可將發(fā)酵生產(chǎn)的純生物菌株培養(yǎng)物的發(fā)酵液干燥成可濕性粉劑，或濃縮成濃縮液等。
該生物農(nóng)藥還包含有載體。
這種生物農(nóng)藥可以根據(jù)不同載體的介入而成各種劑型，例如，但不局限于，粉劑，顆粒劑，懸液，濃縮液等。而載體的選擇可以本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)方案進(jìn)行，如懸液，則載體為無菌水；粉劑，則載體可為豆餅粉。
該生物農(nóng)藥還包含有助劑。
助劑的功能是可以提高青枯病生防菌在土壤中的存活能力，從而提高生物農(nóng)藥的防治效果及穩(wěn)定性。例如助溶劑、懸浮劑、展著劑等，助劑的選擇可以根據(jù)本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)方案進(jìn)行。
該生物農(nóng)藥還包含有除保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌或其突變體之外的至少一種化學(xué)或生物學(xué)殺蟲劑。
所增加的化學(xué)或生物學(xué)殺蟲劑可以加強本生物農(nóng)藥抑制青枯病菌的能力，還可以通過此結(jié)合實現(xiàn)對經(jīng)濟作物所發(fā)生的其它病蟲害的防治。
針對保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的生防應(yīng)用，本發(fā)明還涉及一種從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的代謝物，其要點在于，該生物菌株培養(yǎng)物或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鑒定特征的突變體，或同時具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
代謝物是指任何具有殺蟲(菌)活性的化合物、物質(zhì)或微生物發(fā)酵的副產(chǎn)品。由于許多微生物在其生命活動過程能產(chǎn)生某種特殊的代謝產(chǎn)物，具有選擇性地抑制或殺死其他微生物的作用，本文所指代謝物更具體是指保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌或其具有抑制青枯病菌的生物活性突變體的發(fā)酵的副產(chǎn)品，它具有抗青枯病菌特異活性的特性，該產(chǎn)品基于前文所述保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的抑制青枯病菌的特性而同樣具有抑制青枯病菌的特性。
進(jìn)一步還在于提供一種第一生物殺菌劑，其要點在于，其含有從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的代謝物，該生物菌株培養(yǎng)物或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鑒定特征的突變體，或同時具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
與上述提供的生物農(nóng)藥特性相同，該生物殺菌劑還可以具有如下特性該生物殺菌劑還包含有載體。
該生物殺菌劑還包含有助劑。
該生物殺菌劑還包含有除此代謝物之外的至少一種化學(xué)或生物學(xué)殺蟲劑。
再提供一種從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的上清液，其要點在于，該生物菌株培養(yǎng)物或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鑒定特征的突變體，或同時具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
“上清”定義為指為了獲取培養(yǎng)物中的細(xì)胞而將液體培養(yǎng)物通過離心、過濾、沉淀等本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法去除剩余液體而得的清液。
涉及本發(fā)明則是指含有青枯病生防菌生物活性的生物細(xì)胞的液體，更具體是指含有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌或其具有抑制青枯病菌的生物活性突變體的細(xì)胞液。
至于采用從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的上清液對青枯病菌的抑制作用及效果詳見本發(fā)明具體實施方式
中的實施例7的描述。
第二生物殺菌劑，其要點在于，其含有從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的上清液，該生物菌株培養(yǎng)物或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鑒定特征的突變體，或同時具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
與上述提供的生物農(nóng)藥特性相同，該生物殺菌劑還可以具有如下特性該生物殺菌劑還包含有載體。
該生物殺菌劑還包含有助劑。
該生物殺菌劑還包含有除此上清液之外的至少一種化學(xué)或生物學(xué)殺蟲劑。
進(jìn)而再提供一種預(yù)防或治療植物青枯病菌的方法，其要點在于，其或應(yīng)用有效劑量的生物農(nóng)藥，或應(yīng)用有效劑量的第一生物殺菌劑，或應(yīng)用有效劑量的第二生物殺菌劑。
此處的有效劑量是指足以達(dá)到預(yù)防或治療植物青枯病菌的有益技術(shù)效果的結(jié)果的量。
綜上所述，本發(fā)明較之現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點所提供的保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌或由其制作的生物農(nóng)藥、生物殺菌劑對植物青枯病菌具有很好的防治效果，經(jīng)農(nóng)業(yè)部藥檢所指定的田間藥效測定表明，對茄子青枯病的防效在75-85％(試驗許可編號NF010097)。發(fā)明人所作的大量的田間試驗的結(jié)果為對各種茄科經(jīng)濟作物的田間防治實驗的防治效果達(dá)80％以上，且被該青枯病生防菌ANTI-8098A處理過的果實果身勻稱光滑、長短適中、果形更好看，因而提高了果實的品質(zhì)；同時經(jīng)處理的果實的產(chǎn)量提高了，而且該菌株的繁殖培養(yǎng)方法簡便易行，適于工業(yè)化大批量生產(chǎn)。


圖1為青枯病生防菌的細(xì)胞形態(tài)特征示意圖。
圖2為青枯病生防菌的芽孢及伴孢晶體的形態(tài)特征示意圖。
圖3青枯病強菌株經(jīng)青枯病生防菌ANTI-8098A處理后的弱致病性示意圖。
圖4為青枯病強菌株的強致病性特征示意圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
實施例1實驗開始于青枯病生防菌供篩菌株的采集，土壤樣品采自福建省福州、莆田、三明、龍巖、寧德、南平、廈門、漳州、泉州等九個地市番茄、辣椒、煙草、生姜、花生等茄科作物根系土壤，樣本個數(shù)87個。
采集方法如下(分別令87個土壤樣品進(jìn)行如下操作)1、提供上述87種土壤樣品的一種，2、將該種土壤與九份無菌水(重量比)于玻璃器皿中混勻，3、將混合物振蕩20min后靜置20～30s，即得10-1稀釋液，4、將一份10-1稀釋液與九份無菌水(重量比)混勻而得10-2稀釋液，以此類推，連續(xù)稀釋而制得10-4稀釋液、10-5稀釋液、10-6稀釋液，5、將10-4稀釋液、10-5稀釋液、10-6稀釋液分別均勻涂抹于不同編號的培養(yǎng)基上，并于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6、挑取乳白色、邊緣光滑、表面微隆起的桿狀單菌落，制片在顯微鏡下觀察，可見桿狀細(xì)菌和芽孢，收集之并供后續(xù)篩選使用。
本實驗從所采集的87種土壤樣品中分離菌株12100多株。
本實施例所采用的實驗設(shè)備均為本領(lǐng)域常規(guī)設(shè)備。
而培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、瓊脂1.8％；pH為7.2；培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)時間為48h。
實施例2
對實施例1分離而得的12100多株菌株分別進(jìn)行如下的篩選。
(1)提供一株供篩選菌株，(2)將供篩選菌株點接于培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，(3)將培養(yǎng)皿置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時而成第一菌群，(4)提供一種青枯病菌指示菌，(5)將該指示菌配成濃度為107cfu/ml的懸液，(6)將107cfu/ml懸液噴布于第一菌群中，并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，(7)觀察菌落周圍抑菌圈大小，抑菌圈大于2mm者為對青枯病菌具有拮抗作用的菌株，并進(jìn)行菌株的命名。
將采集而得12100多株菌株，分別選擇10株青枯病假單孢桿菌菌株作為指示菌株(這些菌株分別從蕃茄、甜椒、煙草、茄子等受害作物病部分離獲得)，重復(fù)對供篩選的菌株進(jìn)行上述篩選步驟。
初篩試驗結(jié)果見表4，初步篩選出一組對煙草青枯病假單孢桿菌(P.solanacearum G7)指示菌株有拮抗作用的菌株，占分離總數(shù)的1.48％。這些來自不同作物上的菌株為芽孢桿菌。不同作物，青枯病生防菌獲得率不同，茄科作物稍高，在番茄、甜椒、煙草獲取生防菌比率分別為1.42％、1.29％、1.22％，而花生、生姜上為0.82％和0.96％，獲取率相差在30％以上，這種差異與指示菌有關(guān)。本研究供篩選出181株生防菌，初篩率達(dá)14.87％。
表4 不同作物根土區(qū)系菌株的分離結(jié)果

對181株初篩菌株進(jìn)一步在培養(yǎng)基上連續(xù)9次轉(zhuǎn)移，結(jié)果只有143株保持拮抗力，37株喪失拮抗力，占初篩菌株20％。143株芽孢桿菌再通過10個來源不同的青枯病菌作為指示菌，在培養(yǎng)基上進(jìn)行交互測試，最后對全部指示菌具有抑菌作用的生防菌僅有2株，定名為ANTI-8098和ANTI-8093菌株，其余99％都有不同程度的?；?。ANTI-8098、ANTI-8093菌株在10株青枯病菌指示菌上，抑菌率分別為100％、80％，抑菌圈范圍0-13mm。詳見表5。
表5 青枯病生防菌對青枯病原菌小種的抑制作用

研究結(jié)果表明，絕大部份菌株都有其固有的拮抗范圍(?；?，每個有效菌對不同的病原菌抑菌圈值大小不同，不同的有效菌株對同種病原菌，抑菌圈值也不同，本研究最終篩選出的ANTI-8098青枯病生防菌的菌株命名為ANTI-8098A，于2001年12月11日保藏于“德國微生物保存中心(DSMZ)”，其保藏號為DSM ID 01-1000，其微生物分類命名為青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A)。
其菌落形態(tài)特征為菌落呈圓形，表面呈乳白色，中間微凸起且光滑，邊緣半光滑且整齊；其細(xì)胞個體形態(tài)特征為呈桿狀，寬0.6-10um，長2.0-4.5um；其細(xì)菌的鞭毛特征為直徑0.02-0.03um；其芽孢及伴孢晶體的形態(tài)特征為呈長橢圓型，周邊長有鞭毛。
該青枯病生防菌菌株V-P反應(yīng)(Ph4.9)呈陽性，不產(chǎn)生吲哚；
甲基紅反應(yīng)、卵黃反應(yīng)、明膠液化、石蕊牛奶胨化、淀粉水解、接觸酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原反應(yīng)均呈陽性；氧化酶呈陰性，不產(chǎn)生H2S；產(chǎn)酸反應(yīng)表現(xiàn)為D-葡萄糖和D-果糖陽性，D-木糖、L-阿拉伯糖、D-乳糖、D-甘露醇陰性；分解特性上的特征表現(xiàn)為酪蛋白、賴氨酸、檸檬酸鈉、吐溫80呈陽性，酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸鈉、醋酸鈉、水楊苷呈陰性。
實施例3青枯病生防菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，所用菌株為分離篩選而得的青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 01-1000)，具體步驟如下(1)提供一種青枯病生防菌菌種及裝有第一培養(yǎng)基的若干玻璃器皿，(2)將菌種接種到第一培養(yǎng)基上，經(jīng)溫度30℃、時間18h的活化培養(yǎng)而得菌種A，(3)將菌種A與無菌水混勻制得懸液，(4)提供一種種子罐及第二培養(yǎng)基，(5)按5％的接種量將含有菌種A的懸液接種至裝有第二培養(yǎng)基的種子瓶，并發(fā)酵12h而得種子液，(6)提供一種發(fā)酵罐及第三培養(yǎng)基，(7)將種子液移入裝有第三培養(yǎng)基的發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度28℃～31℃，時間24～48h，轉(zhuǎn)速180r/m～220r/m，通氣量15～40ml瓶裝量。
(8)每隔8h提取菌液一次，觀察菌液中的菌體數(shù)超過30×108個/ml即可放罐而得大量的青枯病生防菌ANTI-8098A。
其中，第一培養(yǎng)基的配方為牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.5％、NaCl 0.5％、瓊脂2％、pH7.0。
第二培養(yǎng)基、第三培養(yǎng)基的配方為豆餅粉4.0％、玉米漿1.0％、玉米淀粉0.3％、蛋白胨0.3％、KH2PO40.07％、MgSO40.03％、CaCO30.1％，pH值為7.5。
下面對所得青枯病生防菌ANTI-8098A菌株的發(fā)酵液對青枯病菌的抑制作用進(jìn)行測定。
將發(fā)酵的青枯病生防菌ANTI-8098A原液(孢子數(shù)為3.5×109個/ml)，用滅菌水配制成原液含量分別為10、20、30...90％的稀釋液各20ml備用。而后配制SPA培養(yǎng)基10瓶，每瓶25ml，用接種環(huán)從番茄青枯菌強菌株平板上挑取菌落，懸浮在9ml無菌水試管中，充分振蕩后，用吸管各吸0.9ml菌液，分別接種到10瓶SPA培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)青枯菌，48h后用TTC培養(yǎng)基活菌體計數(shù)法，計算致病性活菌體數(shù)量為30.1×108/ml，非致病性活菌體數(shù)量為13.0×108/ml，等量分別與各濃度的青枯病生防菌ANTI-8098A菌液混合，放置在28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，以等量滅菌水與青枯菌混合作對照。用TTC培養(yǎng)基活菌體計數(shù)法計算被青枯病生防菌ANTI-8098A抑制后致病性菌和非致病性菌的數(shù)量。
試驗結(jié)果見表6。青枯病生防菌ANTI-8098A對番茄青枯病致病菌和非致病菌的抑制作用顯著。隨著青枯病生防菌ANIT-8098A濃度的增加，對致病性和非致病性菌的抑制作用加強，35％的青枯病生防菌ANIT-8098A發(fā)酵液對致病性菌的抑制作用達(dá)95.5％，對非致病性菌的抑制作用達(dá)70.8％。青枯病生防菌ANIT-8098A對番茄青枯病致病性菌的抑制作用高于非致病性菌，在低濃度下，5％的青枯病生防菌ANIT-8098A對致病性菌的抑制作用為22.9％，較非致病性菌高1.4倍，在中等濃度下，25％的青枯病生防菌ANIT-8098A對致病性菌的抑制作用為83.4％，較非致病性菌高1.5倍，在高濃度下，45％的生防菌ANTI-8098A對致病性菌的抑制作用為95.7％，較非致病性菌高1.5倍。
表6 不同濃度的青枯病生防菌ANIT-8098A發(fā)酵液對番茄青枯病致病菌和非致病菌的抑制作用


實施例4一種純生物菌株培養(yǎng)物，其具有實施例3發(fā)酵所得的保藏號為DSMID 01-1000的青枯病生防菌的菌株。
效果實驗如下提供實施例3所得的青枯病生防菌ANTI-8098A的發(fā)酵液；提供青枯菌強菌株F.1.3.010702-12-V，并在搖床200r/min、28℃培養(yǎng)48h而得青枯菌發(fā)酵液。
將青枯病生防菌ANTI-8098A的發(fā)酵液及青枯菌發(fā)酵液各取5mL混合在一起靜置24h，以5mL青枯菌發(fā)酵液加5mL無菌水為對照。采用平板計數(shù)法在TTC培養(yǎng)基的平板上分離和計數(shù)青枯菌的數(shù)量，測定弱化指數(shù)，分析青枯菌的致病性變化，處理后的菌株編碼F.1.3.010702-12-V-ANTI。
試驗結(jié)果列表7。青枯菌強菌株F.1.3.010702-12-V發(fā)酵液與青枯病生防菌ANTI-8098A發(fā)酵液混合靜置24h后，用TTC培養(yǎng)基分離得到的青枯菌F.1.3.010702-12-V-ANTI有80％以上為弱致病性(中間紅點大，白邊窄，紅點直徑與菌落直徑比例平均為85.7％。詳見圖3)，而對照(與無菌水混合)中分離得到的青枯菌95％為強菌株(中間紅點小，白邊寬，紅點直徑與菌落直徑比例平均為40％。詳見圖4)?？梢?，青枯菌強菌株經(jīng)過青枯病生防菌ANTI-8098A處理后，致病性明顯減弱，說明ANTI-8098A對青枯菌的生長具有致弱作用。同時，經(jīng)ANTI-8098A處理后，青枯菌數(shù)比對照減少了90％，說明生防菌ANTI-8098A對青枯菌的生長具有抑制作用。
表7 青枯病生防菌ANTI-8098A對青枯菌強菌株F.1.3.010702-12-V的致弱作用

實施例5含有純生物菌株培養(yǎng)物的生物農(nóng)藥，其為含有青枯病生防菌ANTI-8098A(為實施例3提供的具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株)20億個孢子數(shù)/克的生物菌株培養(yǎng)物制劑。
下面使用不同濃度的上述生物農(nóng)藥，處理接種青枯菌后的盆栽苗，并設(shè)清水對照和強菌株接菌對照，觀察盆栽苗的發(fā)病情況，分析的生防菌的使用濃度。
試驗使用青枯菌F.1.3-010702-01菌株，用SPA培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)，配置成1×106cfu/ml青枯菌液備用。供試盆栽苗使用茄子盆栽苗和番茄盆栽苗。青枯菌接菌處理方法為，將4-5葉的番茄小苗和4-5葉的茄子小苗栽入裝有無病菜園土的小試驗盆內(nèi)，試驗盆圓形，直徑20cm，高度20cm，每盆澆灌50ml供試青枯菌液，而后，將生物農(nóng)藥配置成100、200、300、400、500倍液，每盆澆灌50ml，設(shè)清水對照，每處理30株苗，盆栽苗放入光波溫室，溫度控制在30±1.5℃，濕度控制在90±10％RH，逐日觀察小苗發(fā)病率。
試驗結(jié)果表8，試驗結(jié)果表明，生物農(nóng)藥ANTI-8098A制劑不同濃度防治番茄和茄子青枯病的效果差異顯著(P＜0.01)。其中使用100-400倍的生防菌制劑防治番茄和茄子青枯病的效果與清水對照處理7差異不顯著(P＜0.01)，平均發(fā)病率小于7.5％.，而在100-300倍液生物農(nóng)藥制劑處理下的番茄和茄子不發(fā)病。500倍液生防菌制劑對番茄和茄子青枯病的防效與對照接菌處理5差異顯著(P＜0.01)，處理后第10天番茄發(fā)病率為73.3％，茄子的發(fā)病率為63.3％，顯著地低于接菌對照，高于100-400倍生防菌制劑處理。
表8 生物農(nóng)藥ANTI-8098A制劑不同濃度處理對番茄和茄子青枯病的防治效果

實施例6本實驗所用還是實施例3所得的青枯病生防菌ANIT-8098A發(fā)酵液制作而得的生物農(nóng)藥(含量20×108cfu/g)，為測該生物農(nóng)藥采用不同施用方法對田間茄子、番茄、辣椒青枯病的防治效果，于2001年9-11月在福州市新店試驗地試驗。試驗作物茄子、番茄、辣椒，病害茄科青枯病。方法為300倍上述生物農(nóng)藥沾根，每穴1g生物農(nóng)藥的毒土，300倍上述生物農(nóng)藥灌根，設(shè)大劑量鏈霉素(1000倍施用3次)藥劑對照和清水對照，供試作物移栽20天后，用300倍灌根法，間隔20天施用二次藥。小區(qū)面積30M2，每個處理重復(fù)4次，最后一次施藥后30天，調(diào)查茄子、番茄、辣椒青枯病發(fā)病株數(shù)，統(tǒng)計發(fā)病率和防治效果。
試驗結(jié)果見表9。試驗結(jié)果表明生物農(nóng)藥各種使用方法對茄子、番茄、辣椒青枯病具有較高的防效。沾根、毒土、灌根對茄子青枯病的防治效果分別為92.0％、95.6％、95.2％。沾根、毒土、灌根對番茄青枯病防治效果分別為87.7％、86.36％、 81.0％。沾根、毒土、灌根對辣椒青枯病防治效果分別為83.8％、82.1％、85.1％。三個作物的鏈霉素對照防效在73-76％之間，清水對照三個作物發(fā)病率在23.5-32.3之間。
表9 生物農(nóng)藥ANIT-8098A制劑對三種茄科作物青枯病的防治效果

實施例7從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的上清液，將實施例3中種子罐中培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液取出，取液次數(shù)分別為16小時、24小時、32小時、40小時各一次，分別用離心機6000r/min離心10分鐘后得到上清液。
測定從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的上清液對青枯病菌的防效將普通細(xì)胞瓊脂(2.0％)培養(yǎng)基熔化后，倒入平板底層作為平板下層培養(yǎng)基，凝固后，再將普通瓊脂(0.7％)培養(yǎng)基熔化后冷卻到45℃左右，然后加入茄子青枯病原菌菌株作為指示菌，并分別滴加上述所得的ANTI-8098A培養(yǎng)液，然后放置在培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)24小時后測量抑菌圈大小。結(jié)果見表10。
表10 青枯病生防菌ANTI-8098A發(fā)酵液的上清液對青枯病菌的抑制作用

實驗結(jié)果表明ANTI-8098A的不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)液經(jīng)離心取得的上清液有抑菌圈現(xiàn)象出現(xiàn)，說明該上清液對青枯病原菌有抑制作用，同樣上清液中的ANTI-8098A菌株分泌的代謝產(chǎn)物中存在抗青枯病菌物質(zhì)。
實施例8為了提高青枯病生防菌在生物制劑中的存活率，減緩其在土壤中的死亡率，提高其在土壤中定殖水平，本試驗對青枯病生防菌ANTI-8098A的存活基質(zhì)進(jìn)行了研究，篩選所得的存活基質(zhì)(Survival Material)，提高了青枯病生防菌在基質(zhì)保存中的存活率，延緩了其在土壤中的衰亡時間。
一、為進(jìn)行青枯病生防菌ANIT-8098A保存、防效和土壤定殖能力的研究，下面配制不同配方的存活基質(zhì)。
存活基質(zhì)(其中即有合成生物農(nóng)藥或生物殺菌劑所需的載體或助劑)，主要原料來源為豆餅粉、泥炭土、木屑、吸水劑SAP-20、助劑(助溶劑、懸浮劑、展著劑等)、少量KCl和尿素(總和不超過5％)。豆餅粉和泥炭土作為營養(yǎng)基質(zhì)，為生防菌保存期間和釋放期間提供營養(yǎng)；木屑作為結(jié)構(gòu)基質(zhì)，提供通風(fēng)透氣的功能；吸水劑SAP-20是高吸水性樹脂，為一種新型功能的高分子材料，其吸水倍數(shù)可達(dá)數(shù)百倍甚至上千倍，吸水速度可在數(shù)秒內(nèi)生成凝膠，提供產(chǎn)品保存期間和使用釋放時的保濕功能；少量KCl和尿素用于產(chǎn)品保存期間基質(zhì)防腐和隔氧，減少生防菌在基質(zhì)中的死亡率。由以上原料配制加工成5個基礎(chǔ)組分，即組分I、組分II、組分III、組分IV、組分V，將基礎(chǔ)組分按表11配方進(jìn)行配制加工，加入最終含量為20×108cfu/g青枯病生防菌ANIT-8098A，用攪拌器均勻混合后，用造粒機制成4種制劑，編號為ANIT-1號、ANIT-2號、ANIT-3號和ANIT-4號。通過試驗比較青枯病生防菌ANTI-8098A在基質(zhì)中的存活率、在土壤中的定殖率、以及對青枯病的防效的影響。供試茄子品種為“梅茄一號”。
表11 青枯病生防菌ANIT-8098A存活基質(zhì)配方

二、不同配方的存活基質(zhì)對青枯病生防菌ANIT-8098A保存存活率的影響取4種配方制劑(表11)各1000g，初始青枯病生防菌ANIT-8098A的含菌量為18～20×108cfu/g，在室溫(25-27℃)密封條件下保存24個月后，各取1克，用無菌水稀釋成105倍后，用移液管吸取0.2ml稀釋液，置于牛肉膏蛋白胨的平板培養(yǎng)基上涂抹均勻，重復(fù)3次，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，計算活菌數(shù)，比較其存活率。試驗結(jié)果見表12。經(jīng)24個月的保存，在用4種不同配方存活基質(zhì)制成的生物殺菌劑制劑ANIT-1號、ANIT-2號、ANIT-3號、ANIT-4號的保存效果差異極顯著(P＜0.01)。其中ANIT-3號中生防菌的保存效果最好，24個月保存后活菌數(shù)最多，存活率達(dá)82.90％；ANIT-3號較好，存活率為74.63％；ANIT-1號較差，存活率為16.83％；ANIT-2號的效果最差，存活率下降到6.52％，比ANIT-3號下降了76.38％。
表12 4種存活基質(zhì)對青枯病生防菌ANIT-8098A存活的影響

三、不同配方的存活基質(zhì)對青枯病生防菌ANIT-8098A防效的影響試驗在福建省福州市宦溪農(nóng)場進(jìn)行，選擇往年青枯病嚴(yán)重的田塊，于2000年9月7日在茄子4-5片真葉苗期開始用藥，方法為藥液澆灌根部。試驗設(shè)4個處理，即4種配方生物殺菌劑(表11)，分別稀釋至藥液含菌量106cfu/ml，小區(qū)面積50m2，隨機排列，各處理重復(fù)3次，以清水為對照。藥后40天調(diào)查小區(qū)發(fā)病率，同時每小區(qū)取樣10株，測量株高、葉片數(shù)、葉長、葉寬，調(diào)查植株生長情況。采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行Q型系統(tǒng)聚類分析，比較田間防治效果。
試驗結(jié)果見表13。經(jīng)4種不同配方存活基質(zhì)的青枯病生防菌ANIT-8098A生物殺菌劑處理小區(qū)的茄子發(fā)病率都與對照的差異顯著(P＜0.05)，清水對照處理區(qū)的發(fā)病率為16.6％，生物殺菌劑處理區(qū)的發(fā)病率控制在4.3％以下，防效都可高達(dá)74％以上，其中以ANIT-3號的防治效果最好，校正防效達(dá)100％，次之為ANIT-1號和ANIT-2號，第三為ANIT-4號。
不同配方存活基質(zhì)的青枯病生防菌ANIT-8098A生物殺菌劑處理對植株生長有促進(jìn)作用。茄子植株生長情況調(diào)查結(jié)果表明，4種ANIT制劑處理的茄子在葉寬、葉長、葉片數(shù)和株高上與清水對照相比都有不同程度的增長。另外田間觀察還表明ANIT-3號處理小區(qū)的茄子植株健壯挺拔，生長一致，生長狀況優(yōu)于其它處理，可見ANIT-3號制劑的存活基質(zhì)優(yōu)于其它3種制劑。
表13 不同存活基質(zhì)的生物殺菌劑ANIT-8098A制劑對茄子青枯病的防治效果

實施例9此實驗為農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥登記田間藥效試驗。試驗單位福建省農(nóng)藥檢定所。
藥物用青枯病生防菌ANIT-8098A菌株經(jīng)上述已知的工藝發(fā)酵，并經(jīng)常規(guī)濃縮加工生產(chǎn)而得的生物殺菌劑。
1、試驗條件(1)試驗地點、作物試驗在福州市晉安區(qū)新店戰(zhàn)峰村的蔬菜地進(jìn)行，試驗地海拔33米，土層厚。土壤肥沃。茄子品種為農(nóng)戶自留種，5月18日移栽。每畝約2500株。在試驗期內(nèi)有用10％吡蟲淋可濕性粉劑防治蚜蟲和美洲斑潛蠅。
(2)防治對象茄子青枯病。
(3)氣象條件試驗期間以晴雨天為主，日平均溫度23.0-32.4℃，最高溫35.2-37.0℃，最低溫21.5-29.1，相對濕度61-93％第一次施藥當(dāng)天無雨，第二次、第三次及第四次施藥當(dāng)天施藥后3個小時后有小雨，雨量不大，持續(xù)時間短。無影響試驗結(jié)果的惡劣氣候條件。
2、試驗設(shè)計與安排(1)供試藥劑青枯病生防菌ANIT-8098A生物殺菌劑(2)試驗設(shè)計(表14)

共設(shè)5個處理，每處理4次重復(fù)，隨機區(qū)組排列，每小區(qū)面積23平方米。
(3)施藥時間、方法6月5在茄子苗期，茄子處于7-8葉期，按設(shè)計劑量灌根，每次每株苗澆灌藥液1公斤，隔20天灌根一次，一共四次。
3、結(jié)果調(diào)查(1)調(diào)查時間、方法最后一次藥后14天、28天各調(diào)一次，調(diào)查每小區(qū)茄子的總株數(shù)、病株數(shù)和死株數(shù)。計算病死率和防效。


(2)試驗結(jié)果青枯病生防菌ANIT-8098A生物殺菌劑100倍、300倍、500倍防治茄子青枯病第四次用藥后14天的防效分別為86.42％、84.16％、62.33％，藥后28天的防效分別為85.19％、85.14％、65.35％。
表15 青枯病生防菌ANIT-8098A生物殺菌劑防治茄子青枯病藥效調(diào)查表(2001年6月福建福州)

權(quán)利要求
1.青枯病生防菌菌株，其特征在于，該菌株為ANTI-8098A，于2001年12月11日保藏于“德國微生物保存中心(DSMZ)”，其保藏號為DSMID 01-1000，其微生物分類命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的青枯病生防菌菌株，其特征在于，其菌落形態(tài)特征為菌落呈圓形，表面呈乳白色，中間微凸起且光滑，邊緣半光滑且整齊；其細(xì)胞個體形態(tài)特征為呈桿狀，寬0.6-10um，長2.0-4.5um；其細(xì)菌的鞭毛特征為直徑0.02-0.03um；其芽孢及伴孢晶體的形態(tài)特征為呈長橢圓型，周邊長有鞭毛。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的青枯病生防菌菌株，其特征在于，該青枯病生防菌菌株V-P反應(yīng)(Ph4.9)呈陽性，不產(chǎn)生吲哚；甲基紅反應(yīng)、卵黃反應(yīng)、明膠液化、石蕊牛奶胨化、淀粉水解、接觸酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽還原反應(yīng)均呈陽性；氧化酶呈陰性，不產(chǎn)生H2S；產(chǎn)酸反應(yīng)表現(xiàn)為D-葡萄糖和D-果糖陽性，D-木糖、L-阿拉伯糖、D-乳糖、D-甘露醇陰性；分解特性上的特征表現(xiàn)為酪蛋白、賴氨酸、檸檬酸鈉、吐溫80呈陽性，酪氨酸、苯丙氨酸、丙二酸鈉、醋酸鈉、水楊苷呈陰性。
4.青枯病生防菌供篩選菌株的采集方法，其特征在于，具有如下步驟(1)提供一種土壤，(2)將一份土壤與九份無菌水(重量比)于玻璃器皿中混勻，(3)將混合物振蕩20min后靜置20～30s，即得10-1稀釋液，(4)將一份10-1稀釋液與九份無菌水(重量比)混勻而得10-2稀釋液，以此類推，連續(xù)稀釋而制得10-4稀釋液、10-5稀釋液、10-6稀釋液，(5)將10-4稀釋液、10-5稀釋液、10-6稀釋液分別均勻涂抹于不同編號的培養(yǎng)基上，并于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，(6)挑取乳白色、邊緣光滑、表面微隆起的桿狀單菌落供篩選使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的青枯病生防菌供篩選菌株的采集方法，其特征在于，培養(yǎng)基配方為牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、瓊脂1.8％；pH為7.2；培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)時間為48h。
6.青枯病生防菌的篩選方法，其特征在于，步驟依序如下(1)提供一株供篩選菌株，(2)將供篩選菌株點接于培養(yǎng)基上，(3)將培養(yǎng)基置于30℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時而成第一菌群，(4)提供一種青枯病菌指示菌，(5)將該指示菌配成濃度為107cfu/ml的懸液，(6)將懸液噴布于第一菌群中，并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，(7)觀察菌落，抑菌圈大于2mm者為對青枯病菌具有拮抗作用的菌株。
7.青枯病生防菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，所用菌株為分離篩選而得的青枯病生防菌(Bacillus cereus ANTI-8098A DSM ID 01-1000)，具體步驟如下(1)提供一種青枯病生防菌菌種及裝有第一培養(yǎng)基的若干玻璃器皿，(2)將菌種接種到第一培養(yǎng)基上，經(jīng)溫度30℃、時間18h的活化培養(yǎng)而得菌種A，(3)將菌種A與無菌水混勻制得懸液，(4)提供一種種子罐及第二培養(yǎng)基，(5)按5％的接種量將菌種A接種至裝有第二培養(yǎng)基的種子瓶，并發(fā)酵12h而得種子液，(6)提供一種發(fā)酵罐及第三培養(yǎng)基，(7)將種子液移入裝有第三培養(yǎng)基的發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度28℃～31℃，時間24～48h，轉(zhuǎn)速180r/m～220r/m，通氣量15～40ml瓶裝量。(8)每隔8h提取菌液一次，觀察菌液中的菌體數(shù)超過30×108個/ml即可放罐。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的青枯病生防菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，第一培養(yǎng)基的配方為牛肉膏0.3％、蛋白胨0.5％、葡萄糖0.5％、NaCl0.5％、瓊脂2％、pH7.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的青枯病生防菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，第二培養(yǎng)基、第三培養(yǎng)基的配方為豆餅粉3.0～5.0％、玉米漿0.8～1.2％、玉米淀粉0.2～0.4％、蛋白胨0.2～0.4％、KH2PO40.06～0.07％、MgSO40.02～0.04％、CaCO30.2～0.3％；pH值為7.0～8.0。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的青枯病生防菌的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，豆餅粉4.0％、玉米漿1.0％、玉米淀粉0.3％、蛋白胨0.3％、KH2PO40.07％、MgSO40.03％、CaCO30.1％。
11.一種純生物菌株培養(yǎng)物，其特征在于，其具有保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌的菌株。
12.一種純生物菌株培養(yǎng)物，其要點在于，其具有保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的突變體的所有鑒定特征。
13.純生物菌株培養(yǎng)物，其要點在于，其包含有保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌的菌株和具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
14.含有純生物菌株培養(yǎng)物的生物農(nóng)藥，其要點在于，該生物菌株培養(yǎng)物或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鑒定特征的突變體，或同時具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的含有純生物菌株培養(yǎng)物的生物農(nóng)藥，其特征在于，該生物農(nóng)藥還包含有載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的含有純生物菌株培養(yǎng)物的生物農(nóng)藥，其特征在于，該生物農(nóng)藥還包含有助劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的含有純生物菌株培養(yǎng)物的生物農(nóng)藥，其特征在于，該生物農(nóng)藥還包含有除保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌或其突變體之外的至少一種化學(xué)或生物學(xué)殺蟲劑。
18.從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的代謝物，其特征在于，該生物菌株培養(yǎng)物或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鑒定特征的突變體，或同時具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
19.第一生物殺菌劑，其特征在于，其含有從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的代謝物，該生物菌株培養(yǎng)物或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鑒定特征的突變體，或同時具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的第一生物殺菌劑，其特征在于，該生物殺菌劑還包含有載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的第一生物殺菌劑，其特征在于，該生物殺菌劑還包含有助劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的第一生物殺菌劑，其特征在于，該生物殺菌劑還包含有除此代謝物之外的至少一種化學(xué)或生物學(xué)殺蟲劑。
23.從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的上清液，其特征在于，該生物菌株培養(yǎng)物或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鑒定特征的突變體，或同時具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
24.第二生物殺菌劑，其特征在于，其含有從純生物菌株培養(yǎng)物中分離而得的上清液，該生物菌株培養(yǎng)物或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株，或具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性所有鑒定特征的突變體，或同時具有保藏號為DSM ID 01-1000的青枯病生防菌的菌株及具有保藏號為DSM ID01-1000的青枯病生防菌抑制青枯病菌活性的所有鑒定特征的突變體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的第二生物殺菌劑，其特征在于，該生物殺菌劑還包含有載體。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的第二生物殺菌劑，其特征在于，該生物殺菌劑還包含有助劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的第二生物殺菌劑，其特征在于，該生物殺菌劑還包含有除此上清液之外的至少一種化學(xué)或生物學(xué)殺蟲劑。
28.預(yù)防或治療植物青枯病菌的方法，其特征在于，其或應(yīng)用有效劑量的生物農(nóng)藥，或應(yīng)用有效劑量的第一生物殺菌劑，或應(yīng)用有效劑量的第二生物殺菌劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物—青枯病生防菌ANTI－8098A及其培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和生防應(yīng)用，具體提供青枯病生防菌菌株，該菌株為ANTI－8098A，于2001年12月11日保藏于“德國微生物保存中心(DSMZ)”，其保藏號為DSM ID 01－1000，其微生物分類命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)；提供該青枯病生防菌的采集、篩選方法、發(fā)酵生產(chǎn)方法及其培養(yǎng)基；提供含有該青枯病生防菌、或含有其發(fā)酵液的上清液、或含有其代謝產(chǎn)物的生物農(nóng)藥和生物殺菌劑。該青枯病生防菌或由其制作的生物農(nóng)藥、生物殺菌劑對各種植物青枯病菌的田間防治實驗的防治效果達(dá)80％以上，且經(jīng)處理的果實的品質(zhì)、產(chǎn)量提高了。
文檔編號A01N25/00GK1570078SQ0313203
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月11日
發(fā)明者劉波 申請人:福建省眾智生物農(nóng)藥工程有限公司