專利名稱：鑒別玉米細胞質(zhì)雄性不育材料胞質(zhì)類型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鑒別玉米細胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility，CMS)材料胞質(zhì)的方法，專門用于玉米CMS育種者和玉米雜交種不育化制種生產(chǎn)者對胞質(zhì)類型(正常胞質(zhì)(N)和T，C，S型不育胞質(zhì))的田間鑒定與實驗室鑒定。
背景技術(shù)：
玉米細胞質(zhì)雄性不育材料最早由Rhoades.M.M于1931年發(fā)現(xiàn)。至今，世界上已發(fā)現(xiàn)一百多種不同胞質(zhì)來源的CMS材料，玉米是世界上最早利用CMS種質(zhì)生產(chǎn)雜交種的重要糧食作物。利用CMS遺傳種質(zhì)配制雜交種，不僅能保證雜交種種子的質(zhì)量，而且能減少勞力投入、降低生產(chǎn)成本、減輕勞動強度，從而獲得巨大的經(jīng)濟效益。因此一直受到各國育種家和種子生產(chǎn)者的關(guān)注，到1970年，利用選自Texas”墨西哥六月”的玉米不育系生產(chǎn)的CMS雜交種已占全美國玉米生產(chǎn)面積的85％。然而CMS雜交種在生產(chǎn)上的巨大增益，使人們完全忽視了1961年在菲律賓發(fā)現(xiàn)專化性侵染Texas”墨西哥六月”不育胞質(zhì)的玉米小斑病T型生理小種的報道。從而導致這一病原小種在美國大面積的玉米不育胞質(zhì)寄主群體中瘋狂地蔓延，造成全美1970年玉米生產(chǎn)嚴重減產(chǎn)，損失高達30億美圓。慘痛的歷史教訓使科學家意識到尋找新型的細胞質(zhì)不育種質(zhì)，避免單一細胞質(zhì)不育材料的廣泛使用是有效利用作物CMS的重要前提。CMS胞質(zhì)的鑒定與分類是實現(xiàn)這一前提的重要保證。1971年Beckett J.B.(Crop Science，1971，11，p724)率先選用18個玉米測驗種，對30種不同胞質(zhì)來源的CMS材料進行廣泛的測交和雜交后代的育性鑒定，根據(jù)育性恢，保關(guān)系的歸納分析，將玉米CMS的胞質(zhì)類型分類為T，C，S三種，并證明S型不育胞質(zhì)是玉米CMS種質(zhì)中的最大一類。華中農(nóng)業(yè)大學玉米組從20世紀70年代以來，先后育成S組胞質(zhì)的華玉2號、華玉3號和華玉4號雄性不育雜交種。中國農(nóng)業(yè)大學，河南農(nóng)業(yè)大學先后育成C型細胞質(zhì)雄性不育的雜交種，均收到了良好的經(jīng)濟效益，近年來仍有擴大發(fā)展的趨勢。
由于玉米T，C，S三種胞質(zhì)類型的CMS，各自具有不同的遺傳規(guī)律和表型效應。育種者在組配三系雜交組合時，需首先明了所利用的CMS材料的胞質(zhì)類型；研究者對新發(fā)現(xiàn)的玉米CMS材料需研究其不育胞質(zhì)類型的歸屬；雜交種生產(chǎn)者在收獲，加工及包裝時需對CMS種子的胞質(zhì)質(zhì)量進行嚴格的檢測。而Beckett J.B所采用的18個測驗種的龐大測交鑒定體系幾乎無法在研究和生產(chǎn)中使用。他所使用的測驗種在我國也難以尋覓。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在建立一種準確，快速的鑒定玉米CMS胞質(zhì)類型的方法，它既可對新發(fā)現(xiàn)的CMS材料進行胞質(zhì)歸類鑒定，又可用于對制種田間的植株樣本和收獲后的種子樣本進行質(zhì)量檢測，同時本發(fā)明中包括了CMS胞質(zhì)的DNA指紋圖譜技術(shù)，因此也可為解決種子質(zhì)量糾紛提供具有法律效益的司法證據(jù)。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)1、一種鑒別玉米細胞質(zhì)雄性不育(CMS)材料T、C、S胞質(zhì)類型的方法，其特征在于，利用確定基因型的玉米自交系與待測材料進行常規(guī)有性雜交，根據(jù)雜交后代雄花育性被恢復或被保持的表型，鑒別待測材料的不育胞質(zhì)類型(簡稱胞質(zhì)類型鑒別的雄花育性恢復專效性測定)；或利用線粒體DNA的分子雜交，根據(jù)限制性片段長度的多型性(RFLP)指紋圖譜，鑒別待測材料的不育胞質(zhì)類型(簡稱胞質(zhì)類型鑒別的線粒體DNA的RFLP指紋圖譜技術(shù))；或利用設(shè)計的引物，對線粒體DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)反應，根據(jù)PCR指紋圖譜，鑒別待測材料的不育胞質(zhì)類型(簡稱胞質(zhì)類型鑒別的線粒體DNA的PCR指紋圖譜技術(shù))。
2、所述的胞質(zhì)類型鑒別的雄花育性恢復專效性測定按照下列步驟；1)以確定基因型的自交系恢313、自鳳1作為玉米CMS材料胞質(zhì)類型鑒別的測驗種；2)將待測材料分別與恢313、自鳳1自交系雜交，配制雜交種，按常規(guī)大田方式種植；3)開花期對測交后代按雄花完全不育、高度不育、半可育、高度可育和完全可育5級育性表型進行育性鑒定，確定不育性被保持或被恢復的表型；4)根據(jù)育性的表型鑒別玉米CMS的不育胞質(zhì)類型。
3、所述的胞質(zhì)類型鑒別的線粒體DNA的RFLP指紋圖譜按照下列步驟；1)將待測材料在30℃黑暗條件下播種，出苗后暗培養(yǎng)7天；2)提取黃化苗總DNA；3)用BamHI或HindIII限制性核酸內(nèi)切酶酶切總DNA；4)分別從線粒體DNA克隆B376和pH2-7-1中，分離5.6kb的cob克隆片段和1.7kb的coxII克隆片段，制備探針；5)按cob/BamH I或coxII/HindIII的探針/酶組合進行Southern雜交6)根據(jù)RFLP指紋圖譜鑒別玉米CMS不育胞質(zhì)類型。
在cob/HindIII探針/酶組合的Southern雜交圖譜中(圖2)N、T、C材料的實驗結(jié)果完全一樣，雜交帶為6.4kb和1.8kbS胞質(zhì)具有4.4kb和1.8kb的雜交帶紋，凡具有4.4kb帶紋的CMS胞質(zhì)被確定為S胞質(zhì)。
在coxII/BamH I探針/酶組合的Southern雜交圖譜中(


圖1)T胞質(zhì)材料具有2.5kb的特定雜交帶紋凡具有2.5kb帶紋的CMS胞質(zhì)被確定為T胞質(zhì)C胞質(zhì)材料具有5.0kb的特定雜交帶紋凡具有5.0kb帶紋的CMS胞質(zhì)被確定為C胞質(zhì)S胞質(zhì)材料具有2.0kb的特定雜交帶紋凡具有2.0kb帶紋的CMS胞質(zhì)被確定為S胞質(zhì)N胞質(zhì)材料具有6.0kb的特定雜交帶紋，凡具有6.0kb帶紋的胞質(zhì)被確定為(N)正常胞質(zhì)4、所述的胞質(zhì)類型鑒別的線粒體DNA的PCR指紋圖譜按照下列步驟；1)取待測材料籽?；蛉~片，用小樣法提取總DNA；2)加入鑒別玉米T、C、S材料不育胞質(zhì)的特異引物；3)進行一次聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增，電泳；4)根據(jù)PCR指紋圖譜鑒別玉米CMS不育胞質(zhì)類型。.
5、所述的引物如序列表SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO5和SEQ ID NO6所示。
以下對CMS材料胞質(zhì)類型鑒別的線粒體DNA的PCR測定方法作進一步地描述(1)取待測材料籽?；蛉~片，用小樣法提取總DNA(2)加入本發(fā)明設(shè)計的玉米T、C、S材料胞質(zhì)不育相關(guān)基因的三對(如序列表SEQ ID NO1-6所示)特異引物以下是根據(jù)GENEBANK的登記序列Z11843所設(shè)計的引物 設(shè)計引物C-1 5′-TGAAAGGGTGGTGGAATA-3(序列表中的編號為SEQ ID NO1)引物C-2 5′-GAGCCAAAGTAATGAGAAAA-3(序列表中的編號為SEQ ID NO2)擴增的目標片斷為Z11843的第176Nt至第854Nt共698個堿基。
以下是根據(jù)GENEBANK的登記序列AF542203設(shè)計的引物 設(shè)計引物S-1 5′-GATGCTATGCTAAGCGAGAT-3′((序列表中的編號為SEQ ID NO3))引物S-2 5′-CCGCTAACCCACTCTTCT-3′(序列表中的編號為SEQ ID NO4)擴增的目標片斷為AF542203的第3766Nt至第4633Nt共885個堿基。以下是根據(jù)GENEBANK的登記序列M12582設(shè)計的引物 設(shè)計引物T-1 5′-GTCGTGTCCTGGTAGCCT-3′(序列表中的編號為SEQ ID NO5)引物T-2 5-CCTCCTTCATTCCGTTGT-3序列表中的編號為(SEQ ID NO6)擴增的目標片斷為M12582的第1052Nt至第1469Nt共435個堿基。
(3)進行一次多聚酶鏈式反應(PCR)，擴增，電泳PCR擴增的程序為94℃/1min(變性)---55℃/1min(退火)---72℃/1min(延伸)，30次循環(huán)，擴增產(chǎn)物在Agarose凝膠(溴化乙錠染色)上，90V電泳1小時30分鐘。
(4)根據(jù)PCR指紋圖譜(如圖3所示)鑒別玉米CMS不育胞質(zhì)類型。
電泳圖譜顯示PCR擴增產(chǎn)物為689個堿基帶紋的試材，被確定為C胞質(zhì)電泳圖譜顯示PCR擴增產(chǎn)物為885個堿基帶紋的試材，被確定為S胞質(zhì)電泳圖譜顯示PCR擴增產(chǎn)物為435個堿基帶紋的試材，被確定為T胞質(zhì)電泳圖譜顯示沒有PCR擴增產(chǎn)物的試材，被確定為正常(N)胞質(zhì)使用者可根據(jù)各單位的具體條件和目的選用本發(fā)明中的某一項鑒定方法開展工作；胞質(zhì)類型鑒別的雄花育性恢復專效性測定方法；本發(fā)明的方法經(jīng)濟有效，不需特殊的儀器設(shè)備，但需經(jīng)過兩個生長季節(jié)才能得出可靠的結(jié)論，適于育種者使用。
本發(fā)明的胞質(zhì)類型鑒別的線粒體DNA的RFLP指紋圖譜方法需要特殊的從事分子生物學研究的儀器設(shè)備，約15天可以獲得胞質(zhì)分類結(jié)果，適于應用基礎(chǔ)研究者使用。
本發(fā)明的胞質(zhì)類型鑒別的線粒體DNA的PCR指紋圖譜方法簡便實用，它不僅只需少許的玉米葉片或單粒玉米，而且在6小時內(nèi)就可得到準確可靠的鑒定結(jié)果。因而更適于種子生產(chǎn)者和管理部門對田間大樣本和種籽大樣本進行質(zhì)量檢測。
本發(fā)明的線粒體DNA的RFLP指紋圖譜和PCR指紋圖譜的生物技術(shù)，具有不受環(huán)境條件影響，不受生長季節(jié)限制，帶型特征穩(wěn)定的優(yōu)點，因此也適用于為種子質(zhì)量糾紛需要調(diào)處，接受有關(guān)司法鑒定機構(gòu)的委托的測試分析任務。
附圖及其說明
圖1玉米CMS線粒體DNA coxII/BamHI探針/酶組合RFLP的指紋圖譜；圖中M表示分子量標記，數(shù)字1-18表示表1中的材料樣本序號，N，T，C，S分別表示胞質(zhì)類型圖2玉米CMS線粒體DNA cob/HindIII探針/酶組合RFLP的指紋圖譜；圖中M表示分子量標記，數(shù)字1-18表示表1中的材料樣本序號，N，T，C，S分別表示胞質(zhì)類型圖3玉米CMS線粒體DNA PCR的指紋圖譜；圖中M表示分子量標記，數(shù)字1-10表示表3中的材料樣本序號，N，T，C，S分別表示胞質(zhì)類型具體實施方式
實施例1玉米77CMS-X胞質(zhì)類別的鑒定1、供試材料本試驗共采用18種兩套同核異質(zhì)和同質(zhì)異核材料，由本申請人華中農(nóng)業(yè)大學玉米室提供。每種材料分別與玉米自交系恢313、自鳳1雜交，根據(jù)F1育性進行胞質(zhì)分類。
表1供試材料序號材料名稱 序號材料名稱1 Mo1710 77CMS-T2 Mo17CMS-T 11 77CMS-EL3 Mo17CMS-RB 12 77CMS-C4 Mo17CMS-EL 13 77CMS-唐徐5 Mo17CMS-唐徐14 77CMS-Vg6 Mo17CMS-C 15 77CMS-X(未知胞質(zhì))7 Mo17CMS-雙 16 77CMS-江8 Mo17CMS-J 17 77CMS-S9 77 18 77CMS-R金2、實驗方法2.1育性恢復專效性鑒定18種供試材料分別與帶有特定基因型的玉米自交系恢313、自鳳1雜交，配制雜交種；按常規(guī)大田方式種植；開花期按雄花育性5級鑒定標準進行育性鑒定。
表2玉米雄花育性表型的分級標準表2 玉米雄花育性表型的分級標準1完全不育 花藥干癟，不露出穎殼，無花粉或花粉敗育2高度不育 極少數(shù)花藥露出穎客，無花粉或花粉敗育3半可育 花藥半飽滿，多數(shù)花藥外露，部分散粉4高度可育 花藥飽滿，花粉正常，大部分花藥外露并散粉5完全可育 正常開花，大量散粉2.2玉米黃化苗總DNA提取和純化所有試材的黃化苗DNA提取采用CTAB法(如下所述)①取玉米葉片5.0g于液氮中研磨，轉(zhuǎn)入50ml離心管中，按每克樣本加入2ml預熱至65℃的CTAB提取液(1.17MNaCL、0.1016M EDTA-8.0，0.835M Ttis-7.5，1.6％CTAB，1％β-疏基乙醇)，混勻，65℃水浴60-90分鐘，每15min搖勻一次。
②水浴結(jié)束后，冷卻至室溫(25℃)，加入等體積氯仿異醇(24∶1)，小心搖動試管10分鐘，使下層有機相由無色→綠色→黑色(深綠色)。
③室溫下(≥20℃)，3.2Krpm離心10分鐘，用剪去頭部的5ml吸頭將上清轉(zhuǎn)移另一離心管中，若上清仍為綠色則用24∶1再提一次。
④加入2/3體積異丙醇，輕柔顛倒兩下，靜置20min后輕柔地充分混勻，使DNA成團。用鉤子挑出DNA，用70％乙醇于1.5ml離心管中浸洗24小時，中途換一次洗液。
⑤DNA純化將DNA吹干，加入適量TE-8.0緩沖液，置于65℃水浴中15分鐘，以溶解DNA；冷至室溫后，加入10μl 10mg/ml RNaseA，混勻；在37℃下，溫育2小時，再用等體積苯酚∶氯仿(1∶1)和氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提一次，室溫下，8Krpm離心10分鐘，在上清液中加入1/10體積的3M NaAC(pH5.2)，加入2倍體積無水乙醇沉淀DNA；鉤出絮狀DNA，放入1.5ml Eppendorf試管中，用70％乙醇洗滌一次，短暫離心，使DNA貼壁，倒去乙醇，吹干DNA沉淀。每管加入適量T.E-8.0緩沖液，充分溶解DNA沉淀，存在-20℃冰箱中備用。
2.3限制性片段長度的多型性(RFLP)分析①用適量的TE緩沖液溶解葉片總DNA，在260nm和280nm的波長下測定吸光值，確定DNA濃度，并用0.8％的瓊脂糖電泳檢查DNA提取的質(zhì)量，主帶清晰的樣品可用于下一步的實驗。
②取10μg左右的總DNA于1.5μl的Eppendorf試管中，加入30單位的限制性內(nèi)切酶，5μl10×緩沖液，2μlBSA，加入ddH2O使終體積至50μl，混勻后在37℃下酶切16-20hrs。酶切后的樣品取4μl在0.8％的瓊脂糖上電泳檢測，100V電泳1.5hrs，DNA呈彌散狀表明DNA酶解反應完全。確認酶切效果后，制備0.8％的瓊脂糖凝膠，每50μlDNA酶切反應液加入5μl點樣緩沖終止酶切反應，每一泳道點入全部(55μl)的DNA酶切樣本液，完成電泳過程。
③將凝膠切割成適宜的大小，用0.2mol/L HCl液變性8分鐘直至膠塊變黃，迅速地用0.4mol/L NaOH溶液作為轉(zhuǎn)移液，通過毛細管原理將膠上的DNA轉(zhuǎn)移至N′-尼龍膜上，24小時后將尼龍膜用2×SSC液漂洗2次，每次5分鐘，晾干后用濾紙夾好，80℃-120℃真空烘箱中烘烤2-3小時，使DNA固定在膜上。
④探針的標記每張雜交膜使用探針液25μl
ddH2O 7.7μl探針DNA(100ng/μl)2.0μlλ/HindIII(1ng/μl) 0.8μl隨機引物+緩沖液 7.5μldNTP(-dCTP)(2mM) 3.0μlKlenow酶(2unit/μl) 2.0μlα32P-dCTP 20μci總體積 25μl混勻后，37℃保溫4-8小時，再加入等體積TE緩沖液，10倍體積的探針預雜交液250μl(0.05Mtris-8.0，0.01M EDTA-8.0，5XSSC，1倍denhardts，0.2％SDS)，100℃水浴10min，再冰浴10min備用。
⑤分子雜交和放射自顯影轉(zhuǎn)移后的尼龍膜在預雜交液中，65℃下進行4~6小時的預雜交后，到掉預雜交液，加入標記好的探針，根據(jù)膜的數(shù)量(按每張膜5~10ml雜交液)加入預熱至65℃的雜交液(10％Dextran Sulfate，0.05Mtris-8.0，0.01M EDTA-8.0，5×SSC，1×denhardts，0.2％SDS)，于65℃緩慢轉(zhuǎn)動雜交16~20小時左右。
棄去雜交液，加入2×SSC，0.5％SDS低嚴謹度的洗膜緩沖液于室溫下洗膜2次，每次20分鐘，以0.2××SSC，0.1％SDS高嚴謹?shù)南茨ぞ彌_液，于65℃洗膜2次，每次30min。取出膜用吸水紙吸干膜表面浮水，保鮮膜包好雜交膜，檢測膜上放射性強度，記錄數(shù)據(jù)，打開暗匣依次放好增感前屏，X光片，雜交膜，增感屏后屏。關(guān)好暗匣存于-70℃冰箱中，根據(jù)放射性強度大小，自顯影10~15天。
雜交膜去探針重復使用0.1×SSC，0.1％SDS，90℃~95℃條件下洗膜30min，確定探針洗脫后，重復雜交使用。
3、實驗結(jié)果3.1育性恢復專效性鑒定結(jié)果按照育性恢復專效性分類的方法，凡被恢313恢復的(測交后代的育性為高度可育或完全可育)，待測材料被確定為具有S型胞質(zhì)、凡被恢313保持(測交后代的育性為完全不育或高度不育)，同時被自鳳1恢復的，待測材料被確定為具有C型胞質(zhì)、凡被恢313保持，同時又被自鳳1保持的，待測材料被確定為具有T型胞質(zhì)。
除77為正常可育胞質(zhì)外，在其他17種CMS材料中，被鑒定為T胞質(zhì)的有Mo17CMS-T、77CMS-T；C胞質(zhì)的有Mo17CMS-C、Mo17CMS-RB、Mo17CMS-EL、77CMS-EL、77CMS-C；S胞質(zhì)的有Mo17CMS-唐徐、Mo17-雙、Mo17CMS-J、77CMS-唐徐、77CMS-Vg77CMS-江、77CMS-R金、77CMS-S。
未知胞質(zhì)77CMS-X被鑒定為C胞質(zhì)。
3.2 RFLP技術(shù)測定結(jié)果3.21 cob/HindIII的探針/酶組合供試材料在cob/HindIII的探針/酶組合中的RFLP結(jié)果如圖2。
結(jié)果表明15號材料未知胞質(zhì)77CMS-X被鑒定為不屬于S胞質(zhì)。供試材料在cox II/BamH I的探針/酶組合中的RFLP結(jié)果如
圖1結(jié)果表明15號材料未知胞質(zhì)77CMS-X被鑒定為C胞質(zhì)。
實施例2玉米胞質(zhì)的PCR指紋鑒定1、供試材料表3 玉米胞質(zhì)的PCR指紋鑒定供試材料序號材料名稱 序號材料名稱1 Mo17CMS-C6 Mo17CMS-S2 77CMS-C 7 Mo17CMS-雙3 Mo17CMS-EL 8 77CMS-T4 Mo17 9 Mo17CMS-T5 77CMS-S 10 W23-T2、實驗方法2.1 DNA提取使用”小樣本總DNA提取方法①取100mg樣于1.5ml離心管中，加入500μlCTAB提取液(1M tris-8.0 100mM；0.5MEDTA-8.0 150mM；5M NaCl 2100mM；PVP 2％；CTAB 2％；14M βME 140mM)，用自制與離心管相配的玻璃鉆頭，電鉆碾磨一分鐘；②將磨好的樣品置于65℃水浴20min；水浴過程中，間隔5-10min輕輕混勻樣品一次；③向經(jīng)過水浴處理的樣品中加入600μl 24∶1的氯仿∶異戊醇溶液，輕輕混勻3min④將混勻好的樣品于臺式離心機中12000rpm離心8分鐘；⑤將上清液轉(zhuǎn)入另一新的1.5ml離心管中，加入400μl-20℃預冷的無水乙醇，10000rpm離心3分鐘；⑥倒掉上清液，用75％的乙醇清洗DNA沉淀物一次，小心吸干乙醇，室溫下晾干DNA沉淀物；⑦加500μl滅過菌的雙蒸水溶解DNA沉淀。取5μl用于PCR反應。
2.2聚合酶鏈式反應(PCR)反應體系DNA樣品液5ul10×緩沖液(Mg2+)2uldNTPs(2mM) 2ulTaq酶(5u/ul) 0.2ul引物(50uM) 0.2ulddH2O 10.6ulTatal V 20ul注將C1、C2、S1、S2、T1、T2六種引物各0.2ul加入反應體系中2.3聚合酶鏈式反應(PCR)程序步驟1 94℃/3分鐘步驟2 {94℃/1分鐘；55℃/1分鐘；72℃/1分鐘}30個循環(huán)步驟3 72℃/5分鐘，1個循環(huán)步驟4 4℃，保存3、實驗結(jié)果
3、實驗結(jié)果實驗結(jié)果如圖3所示；序號為1-3號測試材料(Mo17CMS-C，77CMS-C，Mo17CMS-EL)擴增帶大小為698bp被鑒定為C胞質(zhì)；序號為4號測試材料(Mo17)無帶紋，被鑒定為正常(N)胞質(zhì)；序號為5-7號測試材料(77CMS-S，Mo17CMS-S，Mo17CMS-雙)擴增帶大小為885bp被鑒定為S胞質(zhì)；序號為8-10號測試材料(77CMS-T，Mo17CMS-T，W23-T)擴增帶大小為435bp被鑒定為T胞質(zhì)。
實施例3；本發(fā)明用于種子質(zhì)量糾紛的司法委托鑒定與測試2000年本發(fā)明人接受某司法鑒定機構(gòu)的委托對某一玉米雜交組合的正常胞質(zhì)和不育胞質(zhì)兩種雜交種的胞質(zhì)類型進行鑒定，本發(fā)明人采用本發(fā)明的RFLP指紋技術(shù)對樣品進行了檢測分析(所述的測試步驟如本發(fā)明的說明書所述)。測試與分析結(jié)果表明 樣本中部分標簽的被測試品種有正常可育胞質(zhì)雜交種的樣本確證為S型不育胞質(zhì)雜交種，而部分標簽的被測試品種有不育胞質(zhì)雜交種的樣本確證為正?？捎|(zhì)(N)雜交種。本發(fā)明人的分析檢測報告為司法部門正確裁決這起種子質(zhì)量糾紛提供了具有法律效力的科學依據(jù)。
SEQUENCE LISTING<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120>鑒別玉米細胞質(zhì)雄性不育材料胞質(zhì)類型的方法<130>
<141>2003-03-10<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>玉米(maize)<220>
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<400>5gtc gtg tcc tgg tag cct18Val Val Ser Trp Pro1 5<210>6<211>18<212>DNA<213>玉米(maize)
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<400>6cct cct tca ttc cgt tgt 18Pro Pro Ser Phe Arg Cys1 權(quán)利要求
1.一種鑒別玉米細胞質(zhì)雄性不育(CMS)材料T、C、S胞質(zhì)類型的方法，其特征在于，利用確定基因型的玉米自交系與待測材料進行常規(guī)有性雜交，根據(jù)雜交后代雄花育性被恢復或被保持的表型，鑒別待測材料的不育胞質(zhì)類型，即胞質(zhì)類型鑒別的雄花育性恢復專效性測定；或利用線粒體DNA的分子雜交，根據(jù)限制性片段長度的多型性(RFLP)指紋圖譜，鑒別待測材料的不育胞質(zhì)類型；或利用設(shè)計的引物，對線粒體DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)反應，根據(jù)PCR指紋圖譜，鑒別待測材料的不育胞質(zhì)類型。
2.根據(jù)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胞質(zhì)類型鑒別的雄花育性恢復專效性測定按照下列步驟；1)以確定基因型的玉米自交系恢313、自鳳1作為CMS材料胞質(zhì)類型鑒別的測驗種；2)將待測材料分別與恢313、自鳳1自交系雜交，配制雜交種，按常規(guī)大田方式種植；3)開花期對測交后代按雄花完全不育、高度不育、半可育、高度可育和完全可育5級育性表型進行育性鑒定，確定不育性被保持或被恢復的表型；4)根據(jù)育性的表型鑒別玉米CMS的不育胞質(zhì)類型。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胞質(zhì)類型鑒別的線粒體DNA的RFLP指紋圖譜按照下列步驟；1)將待測材料在30℃黑暗條件下播種，出苗后暗培養(yǎng)7天；2)提取黃化苗總DNA；3)用BamHI或HindIII限制性核酸內(nèi)切酶酶切總DNA；4)分別從線粒體DNA克隆B376和pH2-7-1中，分離5.6kb的cob克隆片段和1.7kb的coxII克隆片段，制備探針；5)按cob/BamH I或coxII/HindIII的探針/酶組合進行Southern雜交；6)根據(jù)RFLP指紋圖譜鑒別玉米CMS不育胞質(zhì)類型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胞質(zhì)類型鑒別的線粒體DNA的PCR指紋圖譜按下列步驟；1)取待測材料籽?；蛉~片，用小樣法提取總DNA；2)加入鑒別玉米T、C、S材料不育胞質(zhì)的特異引物；3)進行一次聚合酶鏈式反應(PCR)，擴增，電泳；4)根據(jù)PCR指紋圖譜鑒別玉米CMS不育胞質(zhì)類型。.
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物如序列表SEQ ID NO1、SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別玉米細胞質(zhì)雄性不育(CMS)材料T、C、S胞質(zhì)類型的方法，其特征在于，利用確定基因型的玉米自交系與待測材料進行常規(guī)有性雜交，根據(jù)雜交后代雄花育性被恢復或被保持的表型，鑒別待測材料的不育胞質(zhì)類型，即胞質(zhì)類型鑒別的雄花育性恢復專效性測定；或利用線粒體DNA的分子雜交，根據(jù)限制性片段長度的多型性(RFLP)指紋圖譜，鑒別待測材料的不育胞質(zhì)類型；或利用設(shè)計的引物，對線粒體DNA進行聚合酶鏈式反應(PCR)反應，根據(jù)PCR指紋圖譜，鑒別待測材料的不育胞質(zhì)類型。
文檔編號A01H1/04GK1514017SQ0311956
公開日2004年7月21日 申請日期2003年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者鄭用璉, 方明鏡, 張方東, 劉紀麟 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學