專利名稱：編碼顯性失活查耳酮合成酶的基因序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的通泉草(mazus)CHS核酸，這些核酸編碼經(jīng)修飾的CHS酶，這些酶對CHS進行顯性失活抑制，本發(fā)明還涉及這些序列對于遺傳改變植物體以降低該植物中花色素苷的含量的用途。
背景技術(shù)：
花的顏色是一種重要的園藝學(xué)性狀，該性狀主要由類黃酮色素花色素苷產(chǎn)生。這些類黃酮主要為吸引傳粉者而產(chǎn)生，還可以保護該植物及其生殖器官免于紫外線傷害、害蟲以及病原體侵襲(Brouillard andCheminat，1988；Gronquist et al.，2001)。經(jīng)典的育種方法已被用于開發(fā)不同顏色和色度的花的品種。近來在生物化學(xué)和分子水平上花色形成的知識的進展使得通過基因工程來進行開發(fā)成為可能(Tanaka et al.，1998)。
在許多被子植物中，三類不同的花色素負責花色的深淺花葵素(橙色到磚紅)、花青素(紅色到粉色)、花翠素(紫色到藍色)。花色素的生物合成途徑已被熟知，而且多數(shù)參與該合成的酶已被鑒定(Holton and Cornish，1995；Winkel-Shirley，2001)。該途徑始于4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A通過查耳酮合成酶(CHS)縮合形成四羥基查耳酮。該化合物通過查耳酮異構(gòu)酶(CHI)和黃烷酮3-羥化酶(F3H)相繼作用而轉(zhuǎn)換成為二氫黃酮醇。最初所產(chǎn)生的二氫黃酮醇為二氫山奈素(DHK)。DHK隨后通過黃酮醇合成酶(FLS)轉(zhuǎn)化成為山奈素，或者通過二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)轉(zhuǎn)化成為白天竺葵苷元?；蛘?，DHK可通過類黃酮3’-羥化酶(F3’H)或者類黃酮3’5’-羥化酶(F3’5’H)被羥化成為二氫五羥黃酮(DHQ)或者二羥基楊梅黃酮(DHM)。DHR和DHM通過FLS被進一步轉(zhuǎn)化成為它們對應(yīng)的黃酮醇(五羥黃酮和楊梅黃酮)，或者被DFR還原而產(chǎn)生無色花色素(白矢車菊花苷元和白飛燕草苷元)。通過花色素合成酶(ANS)由無色花色素而合成的花色素隨后通過類黃酮3-0-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(3GT)而進行糖基化以產(chǎn)生花色素苷。通過鼠李糖化、甲基化或者?；M行的進一步修飾產(chǎn)生了多種多樣的花色素苷(Kroon et al.，1994；Ronchi et al.，1995；Fujiwara et al.，1997；Yoshida et al.，2000；Yabuya et al.，2001)?；ㄉ墓庾V差異主要決定于不同類別的花色素苷的比例以及其它因素，例如液泡的pH，色素共沉著、金屬離子絡(luò)合以及分子堆積(Holton et al.，1993；Markham and Ofman，1993；Mol et al.，1998；Tanaka et al.，1998；Aida et al.，2000)。最終的顏色深淺可能會受到多種因素的進一步影響，包括表皮細胞的形狀或者產(chǎn)生乳脂色的淀粉的存在(Markham and Ofman，1993；Noda et al.，1994；Mol et al.，1998；van Houwelingen et al.，1998)。
已經(jīng)利用多種基因來嘗試進行基因工程來該變花的顏色。由于缺乏該途徑的某種生物合成基因或者缺乏某種酶的底物特異性，一些花種缺少某種特定的顏色。例如，由于F3’5’H的缺乏，康乃馨缺少藍色/紫色的花，而矮牽牛由于其DFR不能還原DHK而缺少橙色和磚紅色的花(Gerats et al.，1982；Forkmann and Ruhnau，1987)。藍色/紫色的康乃馨的基因工程已經(jīng)通過引入矮牽牛F3’5’H基因而完成，并且通過引入其它物種的DFR而開發(fā)出了橙色的矮牽牛(Meyer et al.，1987；Brugliera et al.，2000；Johnson et al.，2001)。對色度的調(diào)節(jié)已經(jīng)成為基因工程的另一個目標。諸如CHS、F3H和DFR這樣的生物合成基因以有義或者反義方向的表達已經(jīng)成為最常用的方法(van der Krol et al.，1990；Courtney-Gutterson et al，1994；Jorgensen et al.，1996；Tanaka et al.，1998)。所導(dǎo)致的有義抑制或反義抑制被統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)。盡管這些途徑在色素合成的下調(diào)中頗為成功，必須從特定物種或者密切相關(guān)物種中克隆目的基因是一個主要的缺陷。進一步，將PTGS限制于特定的組織中是很困難的(Palauqui et al.，1997；Voinnet and Baulcombe，1997；Voinnet et al.，1998；Fagard and Vaucheret，2000；Crete et al.，2001；Vaucheret et al.，2001)。另外，可激活或者抑制花色素苷生物合成基因的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子在諸如鼠耳芥、煙草以及矮牽牛這樣的模型植物中已被證明可用于調(diào)節(jié)色度(Lloyd et al.，1992；Mol etal.，1998；Borevitz et al.，2000；Aharoni et al.，2001)。但是，這些轉(zhuǎn)錄因子的過表達通常該變了許多基因的表達，由此，這樣的轉(zhuǎn)基因花的商業(yè)可靠性仍有待確認(Lloyd et al.，1994；Bruceet al.，2000)。
CHS的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)鑒定提出了設(shè)計一種顯性失活CHS的可能性，該顯性失活CHS可被用于色度的調(diào)節(jié)。CHS在包括花色素苷在內(nèi)的多種類黃酮的生物合成中是第一個酶。它作為一種同二聚體發(fā)揮功能并在一個單一活性位點進行一系列的反應(yīng)(Tropf et al.，1995)。該酶將一個分子的4-香豆酰輔酶A同三個分子的丙二酰輔酶A進行縮合并將該tetraketide中間體折疊成為一個芳香環(huán)結(jié)構(gòu)(Schroder，1999)。定位誘變和抑制劑的研究已經(jīng)鑒定出對于CHS的催化活性重要的保守半胱氨酸和組氨酸殘基(Lanz et al.，1991；Suh et al.，2000)。紫花苜蓿CHS的晶體結(jié)構(gòu)表明保守的Cys164、Phe215、His303和Asn336形成了催化活性位點(Ferrer et al.，1999)。另外，該晶體結(jié)構(gòu)還顯示，來自鄰接單體的Met137伸入了CHS的環(huán)化袋。這提示一個CHS單體的活性需要來自鄰接單體的甲硫氨酸。根據(jù)這一結(jié)構(gòu)信息，我們已經(jīng)制出了一種CHS，該CHS在活性位點上由丙氨酸取代了半胱氨酸并以甘氨酸或者賴氨酸取代了甲硫氨酸。半胱氨酸突變?yōu)楸彼釋?dǎo)致失活形式的CH5，而如果甲硫氨酸的功能果如晶體結(jié)構(gòu)所提示的那樣重要的話，甲硫氨酸突變?yōu)楦拾彼峄蛘哔嚢彼釋⑹灌徑覥HS的功能失活。通過使用轉(zhuǎn)基因的鼠耳芥，我們證實該突變CHS確實是顯性失活的。我們的結(jié)果證實了該甲硫氨酸殘基的重要性并且表明了該顯性失活CHS在對花色強度的調(diào)節(jié)中的利用價值，即使是在一種遠緣的物種中也是如此。
因此，本發(fā)明的目的是提供經(jīng)修飾的通泉草CHS，該CHS編碼一種經(jīng)修飾的查耳酮合成酶，該酶在通泉草CHS的165位氨基酸上由丙氨酸取代了半胱氨酸，并且在通泉草CHS的138位氨基酸上由甘氨酸或者賴氨酸取代了甲硫氨酸。
本文的另一個目的為提供表達該經(jīng)修飾的通泉草CHS的轉(zhuǎn)基因植物，該通泉草CHS產(chǎn)生一種表型，其特征在于在該植物體內(nèi)花色素苷的含量降低。
發(fā)明概述根據(jù)這些目的，本發(fā)明包含了經(jīng)修飾的通泉草CHS核酸，該核酸編碼一種經(jīng)修飾的通泉草CHS，該CHS在通泉草CHS的165位氨基酸上由丙氨酸取代了半胱氨酸，并且在通泉草CHS的138位氨基酸上由甘氨酸或者賴氨酸取代了甲硫氨酸。該經(jīng)修飾的CHS的特征在于其以顯性失活方式抑制CHS的能力。
本發(fā)明還包括了一些植物，這些植物的至少一個細胞被一種載體所轉(zhuǎn)化，該載體含有至少一部分經(jīng)修飾的CHS核酸。這樣的植物具有一種表型，該表型的特征在于含量降低的花色素苷。
本發(fā)明還包括一些載體，這些載體能夠轉(zhuǎn)化一種植物細胞以降低花色素苷的含量。
本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生具有含量降低的花色素苷的植物的方法。這些方法包括的步驟有以含有經(jīng)修飾的CHS基因的載體對植物細胞進行轉(zhuǎn)化；從該被轉(zhuǎn)化細胞再生成為植物以及選擇花色素苷含量降低的植物進行選擇。
附圖簡述


圖1.常規(guī)的花色素苷生物合成途徑，顯示主要的酶。PAL，苯丙氨酸氨裂解酶；C4H，肉桂酸4-羥化酶；4CL，4-香豆酰輔酶A連接酶；CHS，查耳酮合成酶；CHI，查耳酮異構(gòu)酶；F3H，黃烷酮3-羥化酶；FLS，黃酮醇合成酶，F(xiàn)3’H，類黃酮3’羥化酶；F3’5’H，類黃酮3’5’羥化酶；DFR，二氫黃酮4-還原酶；ANS，花色素合成酶；3GT，3-O-葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
圖2.進化系統(tǒng)樹，示來自通泉草的CHS同來自其它物種的CHS之間的同源性。ger ps1，大丁草吡喃酮合成酶1；sts1，二苯乙烯合成酶1。
圖3.鼠耳芥MjCHS的功能分析。(A)MjCHS可以回復(fù)CHS突變體tt4的黃色子葉和種子(插圖)的顏色。tC1、2和3為表達通泉草CHS的tt4的獨立純合系。(B)表達通泉草CHS的幼苗的花色素苷水平。LC1、2和3為獨立的純合轉(zhuǎn)基因系。(C)過表達系中的MjCHS表達分析。MjCHS同AtCHS并不交叉雜交，并且在LC3中表達的缺乏與其花色素苷水平相對應(yīng)。
圖4.顯性失活品系的分析。(A)CHS的氨基酸比對，顯示了加框的殘基Met138和Cys165，Met138預(yù)計對于鄰接單體的功能十分重要，Cys165表現(xiàn)為催化性半胱氨酸。編號基于通泉草序列。mCHSG和mCHSK代表所誘導(dǎo)的突變。alf為紫花苜蓿；arab為鼠耳芥；pet為矮牽牛；snap為金魚草；tor為蝴蝶草。(B)花色素苷在表達顯性失活的MjCHS的Ler幼苗中的積累。(C)Ler和顯性失活品系中的內(nèi)源CHS(AtCHS)(上排)和轉(zhuǎn)基因(MjCHS)(中排)的表達。下排所示為核糖體RNA。
圖5.表達一種顯性失活的MjCHS(mCHSK)的轉(zhuǎn)基因矮牽牛品系中的花色度。TR1和TR2為獨立的轉(zhuǎn)基因品系。WT為野生型。
發(fā)明詳述匍莖通泉草(Mazus japonicus)CHS的克隆和功能鑒定從匍莖通泉草克隆出一種推定的CHS，氟基通泉草為一種常見的園景植物，它屬于玄參科(Genbank獲取號No.AY131328)。通泉草開兩側(cè)對稱的白色花，具有淺藍灰色的花冠筒。作為對所有來自通泉草的花色素苷合成基因進行的克隆的一部分，我們已經(jīng)克隆出了推定的CHS基因。種系發(fā)生分析顯示來自通泉草的CHS非常近似于其它已知的CHS酶，特別是金魚草(Antirrhinum Majus)和蝴蝶草(Toreniahybrida)，它們也屬于玄參科(圖2)。由于二苯乙烯合成酶(STS)以及其它的類CHS酶在進化系統(tǒng)樹上并未隔離分支(Tropf et al.，1994)，所以盡管該基因很可能在實際上編碼CHS，但仍需要進一步的證據(jù)。
為確定分離自通泉草的這一推定的CHS是否編碼有功能的CHS，我們在野生型鼠耳芥(Ler)和chs突變體(tt4)的背景下對該基因進行了表達。建立了一些獨立的純合系，并且各自隨機選取三個進行進一步分析。為確定該推定的CHS是否能夠?qū)t4突變進行補充，我們在含有3％的蔗糖的水瓊脂平板中對幼苗進行培育。如圖3A所示，野生型植株和全部三個表達該推定的CHS的轉(zhuǎn)基因系表現(xiàn)出紫色的子葉，而tt4表現(xiàn)出黃色的子葉。與此一致，野生型和轉(zhuǎn)基因的種子顯示出棕褐色的外皮顏色，而非tt4突變體的黃色種皮(圖3A，插圖)。轉(zhuǎn)基因系中花色素苷生產(chǎn)的恢復(fù)顯示這一來自通泉草的推定的CHS編碼功能性的CHS。此后我們稱該基因為MjCHS。
鼠耳芥中玉米CHS的過表達并不提高花色素苷的產(chǎn)量(Dong et al.，2001)。為測試MjCHS的過表達是否能夠增加鼠耳芥中的花色素苷，我們在含有2％的蔗糖的MS-瓊脂平板中對野生型和轉(zhuǎn)基因的鼠耳芥植株進行培育并且使用分光光度計對花色素苷含量進行定量。在Ler背景，隨機選擇的3個表達MjCHS的純合系中有兩個積累了更多的花色素苷(圖3B)。為研究這一提高是否反映了MjCHS的表達，我們進行了Northern分析。如圖3C所示，這兩個顯示出較高量的花色素苷的品系表達了MjCHS。該結(jié)果表明，MjCHS的過表達能夠提高鼠耳芥中的花色素苷水平。玉米CHS過表達的相反結(jié)果可能是由于兩種CHS酶的細微差異或者在實驗中采用的不同分析條件導(dǎo)致。兩種顯性失活MjCHS的開發(fā)紫花苜蓿CHS的晶體結(jié)構(gòu)提示一個單體的保守甲硫氨酸為一個鄰接的單體的功能所需要(Ferrer et al.，1999)。如果這一甲硫氨酸在功能上很重要，該甲硫氨酸變成其它的氨基酸將抑制其鄰接CHS的功能，由此該突變體為顯性失活。為對其進行檢測，我們通過定位誘變產(chǎn)生了兩種突變MjCHS(圖4A)。一個突變的MjCHS(mCHSG)的138位殘基的甲硫氨酸被甘氨酸取代。由于甘氨酸同甲硫氨酸相比具有較短的側(cè)鏈，因此改變了其鄰接單體的底物結(jié)合袋。另一個突變的MjCHS(mCHSK)的138位殘基的甲硫氨酸被賴氨酸取代。由于賴氨酸帶正電荷，因此改變了其鄰接單體的底物結(jié)合袋的電化學(xué)特性。為排除該突變MjCHS的催化活性，我們還將催化上重要的165位半胱氨酸變?yōu)楸彼帷?jù)顯示該半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸或者丙氨酸會使CHS失活(Lanz et al.，1991；Tropf et al.，1995；Jez et al.，2000)。
為確定這些突變的MjCHS酶是否以顯性失活的方式發(fā)揮作用，我們制備了一些表達突變的mCHSG和mCHSK的轉(zhuǎn)基因鼠耳芥，并且隨機選擇三個品系進行進一步分析。為進行該分析，在含有2％的蔗糖的MS-瓊脂平板上培養(yǎng)了野生型以及這些轉(zhuǎn)基因的品系。使用分光光度計對花色素苷含量進行定量(圖4B)。mCHSG和mCHSK轉(zhuǎn)基因系均表現(xiàn)出水平降低的花色素苷。這一降低并非由于在轉(zhuǎn)基因系中內(nèi)源鼠耳芥CHS的表達降低所導(dǎo)致(圖4C)。
CHS二聚體中的每個單體均獨立發(fā)揮功能，并且一個單體的半胱氨酸殘基突變所導(dǎo)致的該單體的失活并不影響鄰接單體的活性(Tropfet al.，1995)。因此，在mCHSG和mCHSK轉(zhuǎn)基因系中花色素苷水平的降低顯示出這些突變的MjCHS酶以顯性失活的方式發(fā)揮作用。作為推論，甲硫氨酸延伸到形成二聚體的配對部分的環(huán)化袋中對于鄰接單體的活性具有功能上的重要性。mCHSG和mCHSK中顯性失活作用進一步提示通過改變側(cè)鏈長度或改變電化學(xué)特性而導(dǎo)致的底物結(jié)合袋的改變可以抑制CHS活性。
顯性失活的程度取決于顯性失活蛋白的量。因此，預(yù)計轉(zhuǎn)基因植物中花色素苷的含量與突變MjCHS酶的表達水平負相關(guān)。為檢驗這種假設(shè)，我們進行了MjCHS的Northern分析。然而，如圖4C所示，未檢測出相關(guān)性?；ㄉ剀账降淖兓梢詺w因于被翻譯的突變蛋白的實際量?；蛘撸捎诓煌霓D(zhuǎn)基因品系具有不同的MjCHS組織表達特征，有可能在轉(zhuǎn)基因幼苗中主要產(chǎn)生花色素苷的頸部和子葉區(qū)域的突變MjCHS的不同水平被總MjCHS信息所掩蓋。顯性失活MjCHS對花色的調(diào)節(jié)為進一步檢測是否該顯性失活MjCHS能夠被用于在異源系統(tǒng)中調(diào)控花色度，我們以MjCHK轉(zhuǎn)化了矮牽牛。獲得了幾個轉(zhuǎn)化體并且它們?nèi)勘憩F(xiàn)出類似的表型。如圖5所示，表達mCHSK的矮牽牛轉(zhuǎn)化體同野生型相比表現(xiàn)出花色度降低，這表明該突變的MjCHS還可以抑制矮牽牛的CHS。與在有抑制品系或反對抑制品系中觀察到的多種顏色模式有所不同，所有表達顯性失活的CHS的轉(zhuǎn)基因矮牽牛品系均表現(xiàn)為花色度的均勻降低。該突變MjCHS酶的顯性失活活性依賴于它們同內(nèi)生的CHS酶形成異二聚體的能力。對花色素苷產(chǎn)生的抑制顯示MjCHS能夠同鼠耳芥和矮牽牛CHS形成異二聚體。在兩種不同物種中調(diào)控花色素苷產(chǎn)量的能力提示了該顯性失活MjCHS在多種園藝物種中調(diào)控花色度的進一步的利用價值。
本發(fā)明還提供了一些植物，這些植物具有一些細胞，這些細胞以含有至少部分經(jīng)修飾的通泉草CHS核酸的載體進行了轉(zhuǎn)化。這樣的植物所具有的表型的特征在于由經(jīng)修飾的CHS所造成的花色素苷含量降低。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一些植物，這些植物具有一些細胞，以含有至少部分經(jīng)修飾的通泉草CHS核酸的載體對這些細胞進行了轉(zhuǎn)化，該核酸編碼經(jīng)修飾的查耳酮合成酶。這樣的植物所具有的表型的特征在于花色素苷含量降低?？杀挥糜趯嵤┍景l(fā)明的植物包括在欄門之中，即，包括雙子葉和單子葉植物在內(nèi)的被子植物。該經(jīng)修飾的CHS核酸的廣闊的應(yīng)用性是基于CHS酶在多種不同植物類群的花色素苷生物合成中的普通功能。用于實施本發(fā)明的親本植物可以是野生型變體、通過誘變產(chǎn)生的突變體或者通過重組技術(shù)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因品系。
本發(fā)明還提供了植物轉(zhuǎn)化載體，這些載體含有經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分。
這些植物的轉(zhuǎn)化可根據(jù)本發(fā)明通過多種轉(zhuǎn)化方法來進行，這些方法為植物分子生物學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員公知。用于轉(zhuǎn)化的特定方法包括，通過微注射、聚乙二醇、電穿孔或者粒子轟擊將核酸轉(zhuǎn)移入植物細胞?；蛘撸参锛毎赏ㄟ^農(nóng)桿菌來進行轉(zhuǎn)化，該農(nóng)桿菌攜帶含有該經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分的載體。
植物從轉(zhuǎn)化細胞開始進行的再生可通過任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的方法來進行。例見上文引用過的Method in Enzymology；Methodin Enzymology，Vol 118以及Klee et al.，Annual Review of PlantPhysiology 38467-486。根據(jù)被轉(zhuǎn)化的細胞或者植株對特定化學(xué)物質(zhì)的抗性或者基于特征為含量降低的花色素苷的表型來對它們進行選擇，所述的化學(xué)物的例子如抗生素。這些被轉(zhuǎn)化的植物可以進行自花傳粉或者同其它植物進行交叉?zhèn)鞣?。授粉之后，表達經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分的植物根據(jù)其對特定化學(xué)物的抗性或者基于特征為含量降低的花色素苷的表型來進行選擇，所述的化學(xué)物的例子如抗生素?；蛘?，該轉(zhuǎn)化細胞或者轉(zhuǎn)化植株的一部分可被嫁接入其它植物。
以下內(nèi)容作為實施例而被出示，并且這些內(nèi)容不應(yīng)被視為對本發(fā)明的范圍的限制。
實施例匍莖通泉草CHS的克隆和鑒定使用簡并引物(5’-TAYCARCARGCNTGYTTYGCNGG-3’(SEQ ID NO7)，5’-NAGD ATNGCNGGNCCNCC-3’(SEQ ID NO8))從匍基通泉草克隆出一種推定的CHS片段，匍莖通泉草為一種常見的園景植物，它屬于玄參科。以廠商(Clontech，Palo Alto，CA，USA)提供的AP2引物和特定的引物(對于3’RACE，5’-GTTGTCTGCTCCGAGATCACT-3’(SEQID NO9)，對于5’RACE，5’-AGTGATCTCG GAGCAGACAAC-3’(SEQ IDNO10))使用Marathon RACE試劑盒克隆出了全長的CHS基因。
為確定該推定的CHS基因是否編碼一種功能性CHS，以引物(5’-GAGATCTAGAAAAATGACGCCGACCGTCGAGGAG-3’(SEQ ID NO11)和5’-GAGATCTAGATCAATTCATGAAGGGCACACT-3’(SEQ ID NO12))對基因進行擴增，并且將以XbaI切割的擴增產(chǎn)物克隆入經(jīng)GUS刪除的pBI121載體的XbaI位點。將克隆入載體的基因引入農(nóng)桿菌菌株GV3101并且轉(zhuǎn)化入鼠耳芥野生型Landsberg erecta(Ler)或者tt4突變體。從所建立的多個獨立的純合系中隨機選取三個品系進行進一步分析。
為測定該推定的CHS對tt4突變進行補充的能力，我們在含有3％的蔗糖的水瓊脂平板(0.05％MES，0.8％植物瓊脂，3％蔗糖，pH5.7)中對該轉(zhuǎn)基因tt4品系進行5天的培育。顯性失活的CHS的構(gòu)建和鑒定將全長的MjCHS克隆入pTOPII載體。為將163位殘基的半胱氨酸突變?yōu)楸彼?Cys165Ala)，我們使用適當?shù)囊锝M合(5’-TTCGCCCGCGGGACGGTCCTC-3’(SEQ ID NO13)和5’-AGCACCCTGCTGGTACATCAT-3’(SEQ ID NO14))以Pfu聚合酶在pTOPII中擴增了MjCHS。以多核苷酸激酶對被擴增產(chǎn)物進行磷酸化并且用T4DNA連接酶進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。通過測序確認突變克隆。為同Cys165Ala突變一起將138位殘基的甲硫氨酸突變成為賴氨酸(mCHSK)或者甘氨酸(mCHSG)，我們以K-引物組合(5’-CCCGGTGCCGACTACCAGCTC-3’(SEQ ID NO15)和5’-CTTGTCGACCCCGCTGGTGGT-3’(SEQ ID NO16))或者G-引物組合(5’-CCCGGTGCCGACTACCAGCTC-3’(SEQ ID NO17)和5’-GCCGTCGACCCCGCTGGTGGT-3’(SEQ ID NO18))在pTOPII中對Cys165Ala突變CHS克隆進行了擴增。以多核苷酸激酶對被擴增產(chǎn)物進行磷酸化并且用T4DNA連接酶進行連接。通過對突變基因測序證實突變將該突變的全長MjCHS基因克隆入二元載體并且引入鼠耳芥。在對花色素苷進行定量之后對純合品系進行重新編號?；ㄉ剀盏亩繛闄z測這些轉(zhuǎn)基因植物中的花色素苷水平，將經(jīng)過冷吸收的種子播種于含有2％蔗糖的MS-瓊脂平板中(1×MS鹽，0.05％ MES，0.8％植物瓊脂，2％蔗糖，pH5.7)并在連續(xù)白光下(2mW/cm2)生長5天。如上文所述進行定量(Shirley et al.，1995)。簡而言之，采集50株幼苗并且在4℃下浸泡入0.5ml的提取溶液(100％甲醇+0.5％HCl)過夜。翌日早晨，將樣品短時離心并將溶液用于分光光度分析。通過OD530的吸光度來對花色素苷進行定量。將樣品的OD530值減去tt4的OD530值作為花色素苷含量的指示。該試驗重復(fù)三次。Northern分析如上所述進行Northern分析(Shin et al.，2002)。簡而言之，從5日齡的幼苗中提取出總RNA，該幼苗在含有2％的蔗糖的MS-瓊脂平板上在用于花色素苷提取的連續(xù)白光下生長。在各電泳道中以15μg的總RNA上樣并轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。以32P標記的鼠耳芥全長CHS或者通泉草全長CHS進行探針檢測。矮牽牛轉(zhuǎn)化如Johnson et al.(1999)中所述，以含有mCHSK基因的載體對矮牽牛進行轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化體在土壤中生長直至開花。作為對照，制備只含有該載體的轉(zhuǎn)化體并且并排生長。
序列表<110> 錦湖石油化學(xué)株式會社<120> 編碼顯性失活查耳酮合成酶的基因序列及其用途<160> 6<170> KopatentIn 1.71<210> 1<211> 1179<212> DNA<213> 匍莖通泉草(Mazus japonicus)<400> 1atgacgccga ccgtcgagga gattcgtagg gctcaacgtg ccgaggggcc ggccaccgtt60ttggcgatcg ggaccgcgac gccgtcgaac tgcgtcgatc agagcactta ccccgactac 120tattttcgta tcacgaatag tgaacacatg actgatctta aagaaaaatt caagcgcatg 180tgcgagaaat cgtacatcaa gaagcggtac atgcacctga ccgaagaaat cctgaaagaa 240aacccgaaca tgtgtgcgta catggcccct tccctcgacg cgcgtcagga catcgttgtc 300gtcgagatcc cgaagctcgg caaggaagcg gcccagaagg ccatcaagga atggggccag 360cccaagtcca agatcaccca cctcgtcttc tgcaccacca gcggggtcga catgcccggt 420gccgactacc agctcaccaa gctgctcggc cttcgcccct ccgtcaagcg cttcatgatg 480taccagcagg gttgcttcgc cggcgggacg gtcctccgca tggccaagga ccttgcggag 540aacaatgccg gtgccagggt ccttgttgtc tgctccgaga tcactgcagt tacgttccgt 600ggcccgagcg atagccatct cgatagcctt gtcggccagg cgctgttcgg cgatggagct 660gctgcggtca tcgtgggatc ggatccgatt gtgggagtcg agcgaccgtt gttccagatt 720gtgtcggctg cccagacttt gctgccggat agtcacgggg cgatcgacgg tcacctccgt 780gaagtagggc tcacctttca cctcctcaaa gatgttcccg ggctcatctc caaacacatc 840gagaagagtc tcaaggaggc tttcgaccca ttgggcatct ccgactggaa ctccatcttc 900tggatagccc atcccggtgg accggcaatc ctcgaccagg tcgagtccgt gttggccctg 960aagcccgaaa agatgcgcgc cacgaggcag gtgcttagcg attatggcaa catgtcgagc 1020gcatgcgtgc tgtttatact cgacgagatg aggaaggcgt cggcgaagga agggatggg 1080tctaccggag aaggcctcga ctggggcgtg ctgttcgggt tcgggccggg cctgaccgtg1140gagacggtgg tgctgcatag tgtgcccttc atgaattga 1179<210> 2<211> 392<212> PRT<213> 匍莖通泉草(Mazus japonicus)<400> 2Met Thr Pro Thr Val Glu Glu Ile Arg Arg Ala Gln Arg Ala Glu Gly1 5 10 15Pro Ala Thr Val Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Ser Asn Cys Val20 25 30Asp Gln Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Ile Thr Asn Ser Glu35 40 45His Met Thr Asp Leu Lys Glu Lys Phe Lys Arg Met Cys Glu Lys Ser50 55 60Tyr Ile Lys Lys Arg Tyr Met His Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Glu65 70 75 80Asn Pro Asn Met Cys Ala Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asp Ala Arg Gln85 90 95Asp Ile Val Val Val Glu Ile Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Gln100 105 110Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu115 120 125Val Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln130 135 140Leu Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Phe Met Met145 150 155 160Tyr Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Met Ala Lys165 170 175Asp Leu Ala Glu Asn Asn Ala Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser180 185 190Glu Ile Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Pro Ser Asp Ser His Leu Asp195200 205Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile210 215 220Val Gly Ser Asp Pro Ile Val Gly Val Glu Arg Pro Leu Phe Gln Ile225 230 235 240Val Ser Ala Ala Gln Thr Leu Leu Pro Asp Ser His Gly Ala Ile Asp245 250 255Gly His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Leu Lys Asp Val260 265 270Pro Gly Leu Ile Ser Lys His Ile Glu Lys Ser Leu Lys Glu Ala Phe275 280 285Asp Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Ile Phe Trp lle Ala His290 295 300Pro Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Ser Val Leu Ala Leu305 310 315 320Lys Pro Glu Lys Met Arg Ala Thr Arg Gln Val Leu Ser Asp Tyr Gly325 330 335Asn Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Met Arg Lys340 345 350Ala Ser Ala Lys Glu Gly Met Gly Ser Thr Gly Glu Gly Leu Asp Trp355 360 365Gly Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Val Val370 375 380Leu His Ser Val Pro Phe Met Asn385 390<210>3<211>1179<212>DNA<213>匍莖通泉草(Mazus japonicus)<400>3atgacgccga ccgtcgagga gattcgtagg gctcaacgtg ccgaggggcc ggccaccgtt 60ttggcgatcg ggaccgcgac gccgtcgaac tgcgtcgatc agagcactta ccccgactac 120tattttcgta tcacgaatag tgaacacatg actgatctta aagaaaaatt caagcgcatg 180tgcgagaaat cgtacatcaa gaagcggtac atgcacctga ccgaagaaat cctgaaagaa 240aacccgaaca tgtgtgcgta catggcccct tccctcgacg cgcgtcagga catcgttgtc 300gtcgagatcc cgaagctcgg caaggaagcg gcccagaagg ccatcaagga atggggccag 360cccaagtcca agatcaccca cctcgtcttc tgcaccacca gcggggtcga cggccccggt 420gccgactacc agctcaccaa gctgctcggc cttcgcccct ccgtcaagcg cttcatgatg 480taccagcagg gtgctttcgc cggcgggacg gtcctccgca tggccaagga ccttgcggag 540aacaatgccg gtgccagggt ccttgttgtc tgctccgaga tcactgcagt tacgttccgt 600ggcccgagcg atagccatct cgatagcctt gtcggccagg cgctgttcgg cgatggagct 660gctgcggtca tcgtgggatc ggatccgatt gtgggagtcg agcgaccgtt gttccagatt 720gtgtcggctg cccagacttt gctgccggat agtcacgggg cgatcgacgg tcacctccgt 780gaagtagggc tcacctttca cctcctcaaa gatgttcccg ggctcatctc caaacacatc 840gagaagagtc tcaaggaggc tttcgaccca ttgggcatct ccgactggaa ctccatcttc 900tggatagccc atcccggtgg accggcaatc ctcgaccagg tcgagtccgt gttggccctg 960aagcccgaaa agatgcgcgc cacgaggcag gtgcttagcg attatggcaa catgtcgagc1020gcatgcgtgc tgtttatact cgacgagatg aggaaggcgt cggcgaagga agggatgggg1080tctaccggag aaggcctcga ctggggcgtg ctgttcgggt tcgggccggg cctgaccgtg1140gagacggtgg tgctgcatag tgtgcccttc atgaattga 1179<210>4<211>392<212>PRT<213>匍莖通泉草(Mazus japonicus)<400>4Met Thr Pro Thr Val Glu Glu Ile Arg Arg Ala Gln Arg Ala Glu Gly1 5 10 15Pro Ala Thr Val Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Ser Asn Cys Val20 25 30Asp Gln Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Ile Thr Asn Ser Glu35 40 45His Met Thr Asp Leu Lys Glu Lys Phe Lys Arg Met Cys Glu Lys Ser50 55 60Tyr Ile Lys Lys Arg Tyr Met His Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys Glu65 70 75 80Asn Pro Asn Met Cys Ala Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asp Ala Arg Gln85 90 95Asp Ile Val Val Val Glu Ile Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Gln100 105 110Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu115 120 125Val Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Gly Pro Gly Ala Asp Tyr Gln130 135 140Leu Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Phe Met Met145 150 155 160Tyr Gln Gln Gly Ala Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Met Ala Lys165 170 175Asp Leu Ala Glu Asn Asn Ala Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser180 185 190Glu Ile Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Pro Ser Asp Ser His Leu Asp195 200 205Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile210 215 220Val Gly Ser Asp Pro Ile Val Gly Val Glu Arg Pro Leu Phe Gln Ile225 230 235 240Val Ser Ala Ala Gln Thr Leu Leu Pro Asp Ser His Gly Ala 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tgtgtgcgta catggcccct tccctcgacg cgcgtcagga catcgttgtc 300gtcgagatcc cgaagctcgg caaggaagcg gcccagaagg ccatcaagga atggggccag 360cccaagtcca agatcaccca cctcgtcttc tgcaccacca gcggggtcga caagcccggt 420gccgactacc agctcaccaa gctgctcggc cttcgcccct ccgtcaagcg cttcatgatg 480taccagcagg gtgctttcgc cggcgggacg gtcctccgca tggccaagga ccttgcggag 540aacaatgccg gtgccagggt ccttgttgtc tgctccgaga tcactgcagt tacgttccgt 600ggcccgagcg atagccatct cgatagcctt gtcggccagg cgctgttcgg cgatggagct 660gctgcggtca tcgtgggatc ggatccgatt gtgggagtcg agcgaccgtt gttccagatt 720gtgtcggctg cccagacttt gctgccggat agtcacgggg cgatcgacgg tcacctccgt 780gaagtagggc tcacctttca cctcctcaaa gatgttcccg ggctcatctc caaacacatc 840gagaagagtc tcaaggaggc tttcgaccca ttgggcatct ccgactggaa ctccatcttc 900tggatagccc atcccggtgg accggcaatc ctcgaccagg tcgagtccgt gttggccctg 960aagcccgaaa agatgcgcgc cacgaggcag gtgcttagcg attatggcaa catgtcgagc 1020gcatgcgtgc tgtttatact cgacgagatg aggaaggcgt cggcgaagga agggatgggg 1080tctaccggag aaggcctcga ctggggcgtg ctgttcgggt 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7taycarcarg cntgyttygc ngg23<210> 8<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物<400> 8nagdatngcn ggnccncc 18<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9gttgtctgct ccgagatcac t 21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10agtgatctcg gagcagacaa c 21<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11gagatctaga aaaatgacgc cgaccgtcga ggag 34<210>12<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12gagatctaga tcaattcatg aagggcacac t31<210>13<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物<400> 13ttcgcccgcg ggacggtcct c 21<210> 14<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物<400> 14agcaccctgc tggtacatca t 21<210> 15<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物<400> 15cccggtgccg actaccagct c 21<210> 16<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物<400> 16cttgtcgacc ccgctggtgg t 21<210> 17<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物<400> 17cccggtgccg actaccagct c 21<210> 18<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 引物<400> 18gccgtcgacc ccgctggtgg t 2權(quán)利要求
1.一種分離的通泉草查耳酮合成酶(CHS)核酸(SEQ ID NO1)，該核酸編碼查耳酮合成酶(SEQ ID NO2)。
2.權(quán)利要求1的用于編碼查耳酮合成酶的經(jīng)修飾的查耳酮合成酶核酸，其中通泉草CHS的165位殘基的半胱氨酸和138位殘基的甲硫氨酸可被任何氨基酸取代。
3.權(quán)利要求2的用于編碼一種經(jīng)修飾的查耳酮合成酶(SEQ IDNO4)的經(jīng)修飾的通泉草CHS核酸(SEQ ID NO3)，其中在所述殘基位置上的半胱氨酸被丙氨酸取代，甲硫氨酸被甘氨酸取代。
4.權(quán)利要求2的用于編碼一種經(jīng)修飾的查耳酮合成酶(SEQ IDNO6)的經(jīng)修飾的通泉草CHS核酸(SEQ ID NO5)，其中在所述殘基位置上的半胱氨酸被丙氨酸取代，甲硫氨酸被賴氨酸取代。
5.一種載體，該載體用于轉(zhuǎn)化入一種植物細胞以降低某種植物體內(nèi)的花色素苷的含量，該載體含有權(quán)利要求2的經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分。
6.一種載體，該載體用于轉(zhuǎn)化入一種植物細胞以降低某種植物體內(nèi)的花色素苷的含量，該載體含有權(quán)利要求3的經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分。
7.一種載體，該載體用于轉(zhuǎn)化入一種植物細胞以降低某種植物體內(nèi)的花色素苷的含量，該載體含有權(quán)利要求4的經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分。
8.一種轉(zhuǎn)基因的被子植物，該植物含有至少一個被一種載體轉(zhuǎn)化的細胞，該載體含有權(quán)利要求2的經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分，其中所述的植物花色素苷含量降低。
9.一種轉(zhuǎn)基因的被子植物，該植物含有至少一個被一種載體轉(zhuǎn)化的細胞，該載體含有權(quán)利要求3的經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分，其中所述的植物花色素苷含量降低。
10.一種轉(zhuǎn)基因的被子植物，該植物含有至少一個被一種載體轉(zhuǎn)化的細胞，該載體含有權(quán)利要求4的經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分，其中所述的植物花色素苷含量降低。
11.一種方法，該方法用于產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因植物，該植物具有一種表型，該表型的特征在于花色素苷的含量降低，該方法至少包括以下步驟(i)以一種載體轉(zhuǎn)化植物細胞，該載體含有經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分；(ii)從該轉(zhuǎn)化的植物細胞再生出植株；并且(iii)選出至少一種具有降低含量的花色素苷的植物。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求11的方法而產(chǎn)生的被子轉(zhuǎn)基團植物。
全文摘要
本發(fā)明包括經(jīng)修飾的通泉草查耳酮合成酶(CHS)的核酸，該核酸編碼一種經(jīng)修飾的查耳酮合成酶，該合成酶在通泉草CHS的165位殘基的半胱氨酸被丙氨酸取代，138位殘基的甲硫氨酸被甘氨酸或者賴氨酸取代。該被編碼的修飾通泉草CHS的特征在于其對CHS的顯性失活抑制。本發(fā)明還包括一些植物，這些植物具有至少一個表達該經(jīng)修飾的通泉草CHS的細胞。這樣的植物的特征在于花色素苷含量降低。本發(fā)明還包括一些載體，這些載體含有該經(jīng)修飾的CHS核酸的至少一部分。本發(fā)明還包括一些方法，這些方法使用了這些載體以產(chǎn)生具有含量降低的花色素苷的植物。
文檔編號A01H1/00GK1478894SQ0214148
公開日2004年3月3日 申請日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者M·翰南麻帕, 崔高, 崔吉柱, M 翰南麻帕 申請人:錦湖石油化學(xué)株式會社