專利名稱：紫點杓蘭種子無菌繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及杓蘭屬植物種子無菌繁殖方法。
杓蘭屬是著名的蘭科(Orchidaceae)觀賞屬之一。該屬全世界有47種，中國有32種，主要分布于中國西南的橫斷山區(qū)和北美。杓蘭花色艷麗，花型奇特，其唇瓣呈拖鞋狀，故有“拖鞋蘭”之稱，具有很高的觀賞和開發(fā)價值。杓蘭屬是溫帶陸生蘭，種子人工無菌萌發(fā)很困難，有些杓蘭種類的種子萌發(fā)率還不到1％。紫點杓蘭(Cypripedium guttatum Sw．)種子無菌繁殖在歐美等國家開展較多，但繁殖率并不十分理想，目前國內(nèi)外尚未見紫點杓蘭種子無菌繁殖實生苗的報道。
本發(fā)明的目的在于提供一種杓蘭屬紫點杓蘭種子無菌繁殖實生苗的方法，該方法操作簡單，種子萌發(fā)率高，易于大規(guī)模生產(chǎn)。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案紫點杓蘭種子無菌繁殖方法，包括種子的采集、預(yù)處理，培養(yǎng)基配制，播種，原球莖培養(yǎng)步驟，采用Harvais培養(yǎng)基改良型，將Harvais培養(yǎng)基中的NH4NO3去除，添加2．0mg／甘氨酸，100mg／L谷氨酰胺，500mg／L酪蛋白水解物；原球莖培養(yǎng)將剛萌發(fā)形成的原球莖轉(zhuǎn)移到Harvais培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于黑暗中23℃恒溫培養(yǎng)，約培養(yǎng)一個月后，將原球莖轉(zhuǎn)移到新的Harvais培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)原球莖分化出芽和根，形成幼苗時，將幼苗轉(zhuǎn)移到溫度為5±2℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，低溫處理幼苗4個月后，將幼苗轉(zhuǎn)移到23℃培養(yǎng)箱中光下培養(yǎng)，光照強度為20001ux，待幼苗芽轉(zhuǎn)綠，出瓶栽培。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果和優(yōu)異性在于1)進行了紫點杓蘭種子無菌繁殖研究，成功得到實生苗；2)采用的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為發(fā)明人自己研制的改良型培養(yǎng)基，紫點杓蘭種子萌發(fā)率很高，可達70％以上；3)采用本發(fā)明的種子萌發(fā)和原球莖培養(yǎng)技術(shù)，紫花杓蘭原球莖成苗過程不需要經(jīng)過低溫春化處理，與國外報道的杓蘭屬其它種的成苗技術(shù)不同。大大縮短了實生苗成苗周期，實生苗粗壯，易移栽成活。
下面用本發(fā)明的實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例11、種子的采集采用人工授粉得到的紫點杓蘭(Cypripedium guttatum Sw．)成熟蒴果或者野生杓蘭成熟蒴果。2、種子的預(yù)處理1)剖開蒴果，取出種子，無菌條件下將種子置于0．1％升汞溶液中浸泡10分鐘，無菌濾紙吸干，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干。2)將種子置于0．5％NaClO溶液中處理15分鐘，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干。3、培養(yǎng)基配制1)培養(yǎng)基Hatvais培養(yǎng)基(見附表1)改良型，即是將Harvais培養(yǎng)基中的NH4NO3去除。添加2．0mg／甘氨酸，100mg／L谷氨酰胺，500mg／L酪蛋白水解物。2)配制改良型Harvais培養(yǎng)基＋20g／L葡萄糖＋2％土豆＋6．5g／L瓊脂，pH值用1N的NaOH調(diào)節(jié)至5．5。將配好的培養(yǎng)基分裝到100mL的玻璃三角瓶中，每瓶約30mL，用橡皮塞塞住瓶口。培養(yǎng)基在121℃，15個大氣壓條件下滅菌15分鐘。冷卻備用。4、播種無菌條件下將紫點杓蘭種子播于改良型Harvais培養(yǎng)基中。置于黑暗中23℃恒溫培養(yǎng)。5、原球莖培養(yǎng)1)將剛萌發(fā)形成的原球莖轉(zhuǎn)移到Harvais培養(yǎng)基中培養(yǎng)，100mL玻璃三角瓶中每瓶約播原球莖10個。置于黑暗中23℃恒溫培養(yǎng)。2)培養(yǎng)一個月后，將原球莖轉(zhuǎn)移到新的Harvais培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。3)當(dāng)原球莖分化出長約1．0cm的芽和1-3條根，形成幼苗時，將幼苗轉(zhuǎn)移到溫度為5±2℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。低溫處理幼苗4個月后，將幼苗轉(zhuǎn)移到23℃培養(yǎng)箱中光下培養(yǎng)，光照強度為20001ux。2周后幼苗的芽轉(zhuǎn)綠，幼苗即可出瓶栽培。
附表1Harvais 培養(yǎng)基大量元素 每升培養(yǎng)基用量 母液Ca(NO3)2·4H2O 400mg 4g／LNH4NO31400mg 14g／LKH2PO4200mg2g／LMgSO4·7H2O 200mg2g／LKNO3200mg2g／LKCl 100mg1g／L微量元素H3BO30．5mg 500mg／LCuSO4·5H2O 0．025mg25mg／LZnSO4·7H2O 0．5mg 50mg／LNa2MoO4·2H2O 0．02mg20mg／LCo(NO3)2·6H2O 0．025mg25mg／LKI 0．1mg100mg／LMnSO4·H2O 1．54mg1540mg／L檸檬酸鐵鹽(NH4)3C6H5O719mg 190mg／LFe(NH4)3(C6H5O7)225mg 250mg／L有機成分煙酸 10mg100mg／L泛酸鈣 5mg 50mg／L維生素B15mg 50mg／L土豆 2％葡萄糖 20g瓊脂 6．5gpH＝5．權(quán)利要求
1.紫點杓蘭種子無菌繁殖方法，包括種子的采集、預(yù)處理，培養(yǎng)基配制，播種，原球莖培養(yǎng)步驟，其特征在于采用Harvais培養(yǎng)基改良型，將Harvais培養(yǎng)基中的NH4NO3去除，添加2．0mg／L甘氨酸，100mg／L谷氨酰胺，500mg／L 酪蛋白水解物；原球莖培養(yǎng)將剛萌發(fā)形成的原球莖轉(zhuǎn)移到Harvais培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于黑暗中23℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)一個月后，將原球莖轉(zhuǎn)移到新的Harvais培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)原球莖分化出芽和根，形成幼苗時，將幼苗轉(zhuǎn)移到溫度為5±2℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，低溫處理幼苗4個月后，將幼苗轉(zhuǎn)移到23℃培養(yǎng)箱中光下培養(yǎng)，光照強度為20001ux，待幼苗芽轉(zhuǎn)綠，出瓶栽培。
全文摘要
提供一種杓蘭屬紫點杓蘭種子無菌繁殖實生苗的方法,該方法包括種子的采集、預(yù)處理,培養(yǎng)基配制,播種,原球莖培養(yǎng)步驟,操作簡單,大大縮短了實生苗成苗周期,實生苗粗壯,易移栽成活,種子萌發(fā)率高,易于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號A01G1/00GK1278400SQ00109998
公開日2001年1月3日 申請日期2000年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月10日
發(fā)明者胡虹, 黃家林, 王 華, 李樹云, 羅桂芬 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所