專利名稱：一種植物耐硒蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中一個(gè)植物耐硒相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用和利用該基因增強(qiáng)植物耐硒的方法。
背景技術(shù)：
硒是環(huán)境中一種重要的生命元素，是人體必需的微量元素，對(duì)機(jī)體發(fā)揮著極其重要的作用。然而一方面硒在地殼中的含量相當(dāng)稀少和分散，硒缺乏在全世界是一種很普遍的現(xiàn)象，另一方面硒污染在某些地區(qū)也同時(shí)存在著。硒污染的產(chǎn)生主要與人類的生產(chǎn)活動(dòng)有關(guān)，它可以從一些礦業(yè)、農(nóng)業(yè)、石化產(chǎn)品和工業(yè)制造業(yè)所產(chǎn)生的廢棄原料中釋放出來，從而在土壤、水體中富集形成污染。植物、動(dòng)物吸收了土壤或水體中過量的硒就會(huì)產(chǎn)生毒害作用，在植物、動(dòng)物體內(nèi)形成富集，并最終通過食物鏈對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用。因此，硒的缺乏和過剩都與人的生命活動(dòng)休戚相關(guān)，深入探討植物對(duì)硒耐受性機(jī)制具有重要理論意義和實(shí)踐價(jià)值。利用先進(jìn)的分子生物學(xué)手段分離耐硒的抗性基因，再利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出更多的耐硒植物是未來的發(fā)展趨勢(shì)。其潛在的應(yīng)用價(jià)值一方面是通過在農(nóng)作物中表達(dá)硒代謝關(guān)鍵基因來調(diào)節(jié)農(nóng)產(chǎn)品含硒水平，滿足人類健康攝硒的需要；另一方面利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)通過植物治理環(huán)境硒污染的目標(biāo)。擬南芥是一種模式植物，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域。擬南芥的大多數(shù)基因在其它植物中都能找到，有關(guān)擬南芥的任何發(fā)現(xiàn)都能應(yīng)用于其它植物研究。因此，對(duì)擬南芥耐硒的分子生物學(xué)機(jī)制的研究對(duì)提高植物的耐硒能力具有重要的理論與經(jīng)濟(jì)意義。擬南芥基因組已完全測(cè)序，根據(jù)擬南芥測(cè)序數(shù)據(jù)庫尋找和發(fā)現(xiàn)新的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的功能基因是國(guó)際植物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。利用突變技術(shù)研究基因功能已成為一種有效的方法，通過對(duì)突變體的研究，發(fā)現(xiàn)了一些耐硒基因的功能，如AtGPX， AtHMT，APS等，這些基因在突變體和野生型中的轉(zhuǎn)錄水平不一樣。目前定位出的耐硒基因還非常有限，我們從化學(xué)誘導(dǎo)型激活標(biāo)簽子系統(tǒng)構(gòu)建的擬南芥突變體庫中篩選到功能獲得性耐硒及增加硒吸收的突變體vsel，克隆獲得具有耐硒功能的基因VSEl，基因轉(zhuǎn)錄水平分析顯示，在硒鹽脅迫條件下，其轉(zhuǎn)錄水平提高。為此，我們研究了該基因功能，并在分子生物學(xué)水平上闡明了該基因耐硒脅迫的機(jī)理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白及其編碼基因，本發(fā)明所提供的植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白的編碼基因VSE1，來源于哥倫比亞野生型的擬南芥(Col-O)，其蛋白是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)，氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID No :2所示或是將SEQ ID No :2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與SEQ ID No :2限定的蛋白質(zhì)具有相同活性的由SEQ ID No 2衍生的氨基酸殘基序列。序列表中的序列2由250個(gè)氨基酸殘基組成。
所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。VSEl的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。VSEl的cDNA基因，選自下述核甘酸序列之一；(I)序列表中 SEQ ID No 1 的 DNA 序列；(2)編碼序列表中SEQ ID No 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列雜交的核甘酸序列；(4)與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列表中的序列I由1269個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5’端第446 位至1876位喊基，編碼序列SEQ ID No 2的蛋白質(zhì)。含有本發(fā)明VSEl的表達(dá)載體，細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增 VSEl中任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種利用該基因增強(qiáng)植物對(duì)硒耐受性及增加植物中硒含量的方法。本發(fā)明所提供的增強(qiáng)植物對(duì)硒耐受性及增加硒含量的方法，是抑制植物耐硒及增加植物硒含量相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)，該表達(dá)可通過多種方法實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明抑制基因表達(dá)的方法并不限于上述幾種方法，只要能抑制VSEl表達(dá)即可。利用任何一種植物基因敲除技術(shù)，將此基因敲除后，植物表現(xiàn)為耐硒性狀；利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的VSEl轉(zhuǎn)入野生型植物中，植物就表現(xiàn)出對(duì)硒非耐受。本發(fā)明利用正向遺傳學(xué)手段從化學(xué)誘導(dǎo)型激活標(biāo)簽子系統(tǒng)構(gòu)建的突變體庫中篩選并通過表型和生理生化鑒定得到功能獲得型耐硒突變體vsel，用經(jīng)典的CTAB法提取 vsel基因組DNA，再通過Tail-PCR獲得耐硒基因VSE1，后經(jīng)上海生工生物工程有限公司測(cè)序鑒定并在TAIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)，最后進(jìn)行基因定位，獲得一個(gè)新的耐硒基因。構(gòu)建了 VSEl基因的過量表達(dá)載體，并導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌C58菌株中，用花絮浸潰法進(jìn)行擬南芥植株的遺傳轉(zhuǎn)化，并用抗生素篩選轉(zhuǎn)化株，以期觀察該轉(zhuǎn)基因植株在硒脅迫下的表型，并研究其功能。本發(fā)明的VSEl基因在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以植物耐硒癥狀來篩選轉(zhuǎn)化植株。攜帶有本發(fā)明VSEl基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物經(jīng)組織培育成植株。本發(fā)明的植物耐硒相關(guān)基因?yàn)檗r(nóng)作物耐硒育種提供基因與技術(shù)的支持。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。


圖1是本發(fā)明以40mg/LNa2Se03作為篩選的臨界濃度，獲得耐硒突變體vsel圖2是本發(fā)明突變體vsel和野生型植株在土培條件下生長(zhǎng)狀況比較圖3是本發(fā)明突變vse 1在不同Na2Se03濃度下發(fā)芽率比較圖4是本發(fā)明突變體vsel和野生型植株對(duì)硒鹽耐受性比較圖5是本發(fā)明vsel和野生型主根長(zhǎng)、鮮重、蛋白質(zhì)、GSH_Px、APX、硒含量等比較圖6是本發(fā)明vsel突變體在硒鹽脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)圖7是本發(fā)明T-DNA插入位點(diǎn)圖譜分析圖8是本發(fā)明VSE1基因基因表達(dá)模式分析
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、VSE1基因的獲得利用正向遺傳學(xué)手段從化學(xué)誘導(dǎo)型激活標(biāo)簽子系統(tǒng)構(gòu)建的突變體庫中通過對(duì)野 生型和突變體擬南芥在20mg/L、30mg/L和40mg/L三個(gè)Na2Se03濃度梯度選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行 培養(yǎng)，在40mg/L Na2Se03濃度下，WT完全不能存活而突變體有三株能夠生長(zhǎng)，得到疑似耐硒 突變體，并通過表型和生理生化鑒定得到功能獲得型耐硒突變體vsel，用經(jīng)典的CTAB法提 取vsel基因組DNA，以提取出來的DNA為模板，進(jìn)行如下Tail-PCR反應(yīng)20iil反應(yīng)體系， 內(nèi)含10XPCR緩沖液、dNTPs(2. 5mM)混合物、巢式引物(2 u M)和隨機(jī)引物(50yM)、Taq酶 (5U/iU)，其余加雙蒸水至 20iU。其中，巢式引物 1 :LexA2、LexA3、LexA4、LexA5、LexA6 以 及隨機(jī)引物2 :AD1、AD2、AD3、AD4見表一。Tail-PCR所用的引物序列
權(quán)利要求
1.一種植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白，其特征在于氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID No 2所示或是將SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與SEQ ID No 2限定的蛋白質(zhì)具有相同活性的由SEQ ID No 2衍生的氨基酸殘基序列。
2.權(quán)利要求I所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白的編碼基因，其特征在于 選自下列核苷酸之一(1)序列表中SEQID No I的DNA序列；(2)編碼序列表中SEQID No 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQID No 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；(4)與SEQID No :1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白的編碼基因，其特征在于，所述基因序列的開放閱讀框架為SEQ ID No 2自5’端第446位至1876位堿基。
4.含有權(quán)利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白的編碼基因序列的載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白的編碼基因序列的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白的編碼基因序列的宿主菌。
7.一種增強(qiáng)植物對(duì)硒耐受性及增加植物中硒含量的方法，其特征在于是抑制植物中如權(quán)利要求2所述的耐硒及增加植物硒含量相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種增強(qiáng)植物對(duì)硒耐受性及增加植物中硒含量的方法，其特征在于抑制植物中耐硒相關(guān)蛋白編碼基因表達(dá)的方法包括植物病毒載體介導(dǎo)基因沉默的方法，或者反義核酸技術(shù)沉默基因的方法，或者SiRNA介導(dǎo)的基因沉默方法。
9.權(quán)利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白的編碼基因在增強(qiáng)植物對(duì)硒耐受性及增加植物中硒含量的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。植物耐硒及增加植物硒吸收相關(guān)蛋白是序列表中SEQ ID No2，其編碼基因是序列表中SEQ ID No1 DNA序列。本發(fā)明所提供的增強(qiáng)植物耐硒及增加植物中硒含量的方法，是抑制植物中的上述植物耐硒及增加植物中硒含量相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)。為農(nóng)作物耐硒育種提供基因與技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102603877SQ20121004484
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者盧云峰, 慈凌坤, 曹樹青, 江力 申請(qǐng)人:合肥工業(yè)大學(xué)