一種檢測肉牛pomc基因單核苷酸多態(tài)性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含POMC基因的待測肉牛全基因組DNA為模版，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增肉牛POMC基因；用限制性內(nèi)切酶ScaI消化PCR產(chǎn)物后，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定肉牛POMC基因第5141位的基因型；由于POMC基因功能涉及宰前活重，肌肉嫩度性狀，基因型數(shù)據(jù)與這些性狀關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)：CC型個體在肌肉嫩度和宰前活重方面顯著優(yōu)于其他個體。以上說明CC基因型可以作為一個提高肉牛宰前活重和肌肉嫩度的候選分子遺傳標(biāo)記。本發(fā)明提供的檢測方法可以用于肉牛生長肉質(zhì)性狀的標(biāo)記輔助選擇（MAS），加快良種群的選育。
【專利說明】—種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態(tài)性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測肉牛POMC基因第5141位單核苷酸多態(tài)性的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對于牛肉的數(shù)量和品質(zhì)要求日益提高。雖然我國已成為第三大養(yǎng)牛與牛肉生產(chǎn)國，但是高檔大部分依賴于進(jìn)口。因此提高肉用性能勢在必行，途徑主要有改善飼料營養(yǎng)，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理水平和培育優(yōu)良品種等，而良種是肉牛業(yè)發(fā)展的先決條件和物質(zhì)基礎(chǔ)。人們在了解肉用性狀的遺傳規(guī)律和相應(yīng)的生長發(fā)育、脂肪沉積等生命活動調(diào)控規(guī)律的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子生物學(xué)方面的研究，發(fā)現(xiàn)了與肉用性狀有密切聯(lián)系的功能基因和主效基因以及和這些基因連鎖的分子遺傳標(biāo)記，根據(jù)目標(biāo)性狀與候選基因基因型間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行選擇，提高了育種方向的準(zhǔn)確性，縮短了育種年限。
[0003]單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transit1n)或顛換(transvers1n)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種:一種是同義cSNP (synonymous cSNP),即SNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基的含義相同；另一種是非同義cSNP (non-synonymous cSNP),指堿基序列的改變可使以其為藍(lán)本翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響了蛋白質(zhì)的功能。這種改變常是導(dǎo)致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。這些SNPs作為遺傳標(biāo)記在群體遺傳和生物進(jìn)化的研究中也具有重要意義。
[0004]分子生物學(xué)的發(fā)展為分子標(biāo)記輔助選擇提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，通過檢測功能基因某位點(diǎn)的多態(tài)性，對不同基因型個體與其生產(chǎn)性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，找出優(yōu)勢基因型和優(yōu)勢等位基因，為選種提供依據(jù)，這一過程中檢測多態(tài)性和基因分型的準(zhǔn)確是很關(guān)鍵的。目前主要的方法有PCR-RFLP技術(shù)或PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合DNA測序。
[0005] 阿片黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原(pro-op1melanocortin, P0MC),也叫“促皮質(zhì)素前體”，是一種合成于下丘腦神經(jīng)元中的激素原前體，該基因轉(zhuǎn)錄翻譯后，經(jīng)歷了廣泛的和組織特異的翻譯后加工，產(chǎn)生一系列具有生物活性的多肽，由于不同組織中加工酶類型的不同而表達(dá)產(chǎn)生不同的多肽。腦垂體促皮質(zhì)激素細(xì)胞產(chǎn)生了促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和β-促脂解素，下丘腦產(chǎn)生α -促黑激素(a -MSH)、β -促黑激素(β -MSH)、Y -促黑激素(Y -MSH)、類促腎上腺皮質(zhì)激素樣的中間多肽(CLIP)和β_促脂解素，這些物質(zhì)進(jìn)一步分解產(chǎn)生Y-促脂解素和內(nèi)啡呔。其中MSH (促黑激素)與其相應(yīng)受體MCRs (黑素皮質(zhì)素受體)相互作用，共同組成了大腦黑皮質(zhì)素系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)食欲、介導(dǎo)能量代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，控制著動物的食物攝取和能量消耗。這些生命活動都將影響生長速度、體組成和脂肪沉積，因此編碼POMC的基因成為影響人類肥胖和家畜肉質(zhì)性狀的重要基因。本發(fā)明提供的檢測方法為POMC基因SNP與肉質(zhì)性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于肉牛肉質(zhì)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS )，快速建立遺傳資源優(yōu)良的肉牛種群。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，利用PCR-RELP方法檢測肉牛POMC基因的多態(tài)性，并將其與肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，驗證是否可以作為肉牛分子育種中輔助選擇的分子標(biāo)記，從而加快良種選育速度。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
一種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含POMC基因的待測肉牛全基因組DNA模版，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增肉牛POMC基因；用限制性內(nèi)切酶ScaI消化PCR產(chǎn)物后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定肉牛POMC基因第5141位的單核苷酸多態(tài)性。
[0008]所述的引物對P為:
上游引物:5’ -GGTGCCAAATACCTCCTG-3’
下游引物:5’ -ACAGCCCATTGACAGAACT-3，。
[0009]所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s ;60°C退火40s ；72°C延伸30s ;72°C延伸7min ;4°C保存。
[0010]所述的瓊脂糖凝膠電泳為2%瓊脂糖凝膠電泳。
[0011]所述根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定肉牛POMC基因第5141位的單核苷酸多態(tài)性為:TT基因型表現(xiàn)為361bp/161bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為522bp/361bp/161bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為522bp條帶。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
本發(fā)明根據(jù)POMC基因的序列設(shè)計引物，分別以8個肉牛品種的基因組DNA為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序后得到肉牛POMC基因的部分序列。與NCBI公布的序列進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)在第5141位存在SNP多態(tài)性。
[0013]針對上述第5141位的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公布了其篩查和檢測方法，通過設(shè)計特定的引物，PCR擴(kuò)增目的片段，然后用特定的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，能夠簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。
[0014]本發(fā)明對8種肉牛品種的SNP基因型進(jìn)行了檢測和基因型頻率分析，對上述SNP位點(diǎn)與肉牛部分生長性狀(宰前活重、酮體重、屠宰率、凈肉重、大理石花紋評分、眼肌面積、實(shí)測背膘厚、嫩度、大腿肉厚、腰部肉厚、酮體長)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)能夠作為提高肉牛宰前活重和肌肉嫩度的分子標(biāo)記。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是引物P擴(kuò)增不同牛個體(牛POMC基因第5141位多態(tài)位點(diǎn))PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為600bp Marker, 1-7為PCR產(chǎn)物。
[0016]圖2是本發(fā)明中PCR產(chǎn)物混合測序篩查到的牛POMC基因序列第5141為T或C突變測序結(jié)果圖。
[0017]圖3是本發(fā)明牛POMC基因引物P擴(kuò)增片段PCR產(chǎn)物的RFLP分析圖。其中1、4、7泳道為 TT 型，2、5、6、8、9、12 泳道為 TC 型，3、10、11 泳道為 CC 型，M 為 600bp Marker。
[0018]

【具體實(shí)施方式】
本發(fā)明利用PCR-RFLP方法對肉牛POMC基因第5141位突變的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，下面對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0019]A、肉牛POMC基因第二內(nèi)含子區(qū)域PCR引物的設(shè)計
以NCBI所公布的牛(NC_007309.5)序列為參考，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計能夠擴(kuò)增包含肉牛POMC基因第二內(nèi)含子區(qū)域的PCR產(chǎn)物，其引物序列如下:
上游引物:5’ -GGTGCCAAATACCTCCTG-3’
下游引物:5’ -ACAGCCCATTGACAGAACT-3’
B、以引物P進(jìn)行PCR擴(kuò)增待測肉牛的POMC基因片段 1、牛樣品的采集和處理
本發(fā)明采用8個牛群體共計318個個體，具體為:(I)安格斯(Angus)牛血液樣品18份，晉南牛(Jinnan)血液樣品23份,利木贊(Limousin)牛血液樣品22份,魯西黃牛(Luxi)血液樣品29份,秦川牛(Qinchuan)血液樣品27份,西門塔爾(Simmental)牛血液樣品30份，夏洛萊(Charolais)牛血液樣品29份，采自河北大廠縣華安肉牛育肥場；(2)安格斯(Angus)牛血液樣品30份,海福特(Hereford)牛血液樣品30份,西門塔爾(Simmental)牛血液樣品28份，采自內(nèi)蒙古通遼三元肉牛育肥場；(3)西門塔爾(Simmental)牛血液樣品，采自內(nèi)蒙古通遼寶龍山肉牛育肥場。從每頭牛的頸靜脈采血8 mL于10 mL管中，加A⑶抗凝劑(血液與ACD體積比為6:1)搖勻，將血樣用加冰塊的泡沫箱帶回實(shí)驗室，于_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0020]2、基因組DNA的提取
(I)冰凍血樣室溫下融化、搖勻，用移液槍吸取1.5mL全血加入5mL離心管中，加入1.5mL (或與血樣等體積)PBS緩沖液,顛倒混勻lOmin, 12000r/min離心1min,結(jié)束后可看到離心管底部白細(xì)胞沉淀。
[0021](2)棄上清液，重復(fù)(I)的步驟I~2次，至下層白細(xì)胞內(nèi)無紅細(xì)胞。
[0022](3)棄上清液，加入ImL裂解液SET，40 μ L 10% SDS，20 μ L蛋白酶K溶液，振蕩器振蕩2~3min，使之充分混勻，至于恒溫水浴振蕩器中55°C水浴，消化過夜至不見粘稠團(tuán)塊。
[0023](4)向管中加入與管內(nèi)液體等體積的Tris飽和酚(約1.5mL)，蓋緊管蓋，緩慢連續(xù)顛倒混合不少于lOmin, 12000r/min離心10min。
[0024](5)小心吸取上清液至新的5 mL離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25: 24:1)混和液,緩慢顛倒離心管不少于1min,使溶液兩相充分混勻，12000r/min離心1min0
[0025](6)轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，混勻，12000r/min 離心 lOmin。
[0026]( 7)轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，蓋緊管蓋，順一個方向水平搖晃數(shù)次即可看到白色絮狀DNA沉淀，離心4min，使DNA貼附在離心管管壁下部。
[0027](8)用預(yù)冷的75%乙醇洗滌兩次，小心倒出乙醇，室溫放置。
[0028](9)乙醇揮發(fā)后，加入10yL ddH20溶解，4°C放置，24h后，將DNA溶液轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5mL離心管中，-20°c保存?zhèn)溆谩?br> [0029]3、DNA濃度和純度檢測
(I)瓊脂糖凝膠電泳檢測
取5 μ L DNA溶液，與I μ L上樣緩沖液(6 X loading buffer)混勻，于1%的瓊脂糖凝膠中以100V電壓電泳30min左右，結(jié)束后利用凝膠成像系統(tǒng)拍照，初步觀察DNA的純度。
[0030](2)紫外分光光度計檢測
將5 μ I待測DNA溶液充分溶于ddH20，并定容至1ml。利用紫外分光光度計測得其260nm和280nm波長處的OD值。根據(jù)以下公式計算DNA純度和濃度:
DNA 濃度=OD260 X 50ng/ μ I X 200
DNA 純度=0D26Q/0D28。
若DNA純度在1.8-2.0之間，則DNA純度較高；若小于1.8，則樣品中可能存在RNA污染；若大于2.0，則樣品中可能存在蛋白質(zhì)污染。經(jīng)紫外分光光度計測定OD值為1.72，純度較聞。
[0031]4、PCR 擴(kuò)增
分別以8個牛品種的DNA為模版，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系為32 μ L，見表1 ;PCR總反應(yīng)程序，見表2 ；
表1本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系

【權(quán)利要求】
1.一種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態(tài)性的引物，其特征在于:所述引物為引物對P，序列為:上游引物:5’-GGTGCCAAATACCTCCTG-3’ ；下游引物:5’-ACAGCCCATTGACAGAACT-3’。
2.一種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含POMC基因的待測肉牛全基因組DNA模版，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增肉牛POMC基因；用限制性內(nèi)切酶ScaI消化PCR產(chǎn)物后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定肉牛POMC基因第5141位的單核苷酸多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態(tài)性的辦法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s ;60°C退火40s ;72°C延伸30s ；72°C 延伸 7min ;4°C 保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態(tài)性的辦法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠電泳為2%瓊脂糖凝膠電泳。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態(tài)性的辦法，其特征在于，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定肉牛POMC基因第5141位的單核苷酸多態(tài)性為:TT基因型表現(xiàn)為361bp/161bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為522bp/361bp/161bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為522bp條帶 。
【文檔編號】C12N15/11GK104131098SQ201410362132
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】甘乾福, 喬慧, 梁學(xué)武, 陳佳欽 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)