片段中加入限制性內(nèi)切酶化nl，置于37°C金屬浴中溫 浴30分鐘進行酶切消化，將體系置于80°C金屬浴中溫浴30分鐘滅酶。最后將酶切后的PCR產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌化21 (DE3)感受態(tài)細胞中。
[0044] 實施例2高熱穩(wěn)β-葡聚糖酶的誘導(dǎo)、表達及篩選
[0045] (1)β-葡聚糖酶的誘導(dǎo)及表達
[0046] 從平板挑取單菌落接入含有25化L LB培養(yǎng)基(含50yg/血的硫酸卡那霉素）的96孔 板中。每孔對應(yīng)一特定轉(zhuǎn)化子且在每塊96孔板中均接種一野生型克隆作為陰性對照。將得 到的96孔板置于搖床中于37°C，200巧m條件下培養(yǎng)11-12個小時。用排式移液器吸取20化培 養(yǎng)得到的菌液轉(zhuǎn)移進入含25化L新鮮LB培養(yǎng)基的96孔板中，剩余的菌液置于4°C臨時保藏。 在37°C，200rpm條件下培養(yǎng)4小時后，在每個孔中分別加入終濃度為0.06mM和8mM的IPTG和 曰-乳糖并將培養(yǎng)溫度降低至24°C繼續(xù)培養(yǎng)6個小時。通過酶標儀測定所得菌液的OD600值后 將96孔板置于離屯、機中于4°C下4000rpm離屯、10分鐘，收集上清液，置于4 °C保藏。在第一輪 飽和突變后獲得4個突變體文庫后，W其中最優(yōu)突變體作為模板，在熱穩(wěn)定性其次的位點進 行第二輪飽和突變。依次類推，直到第四輪最后獲得4個位點的最佳突變酶。
[0047] (2)高熱穩(wěn)β-葡聚糖酶的篩選
[004引對β-葡聚糖酶的高通量篩選主要分為兩輪進行。在第一輪中測定96孔板中誘導(dǎo)得 到的突變體的催化活性。用排式移液器取20化突變體上清液于一塊新96孔板中，并加入40 °C預(yù)熱的藍葡聚糖底物溶液(藍葡聚糖底物與20mM憐酸緩沖液W1:19比例混合)8化L充分 混合后置于40°C下溫浴10分鐘。在每孔中加入300化沉淀液終止反應(yīng)，利用離屯、機于 400化pm離屯、5分鐘后，取上清在590nm處測定吸光度值。在運一輪中，催化活性遠低于野生 型酶的突變體中被首先排除。在第二輪中，W孔一一對應(yīng)的原則采用排式移液器移取適量 發(fā)酵得到的上清液至新的96孔板中，并將96孔板加熱至70°C保溫1小時后置于冰上降溫。在 熱處理之后，采用上述酶活測定方法測定突變體的剩余酶活。突變體的相對酶活采用 咕i?ig/U勵Sig來表示。從中選取相對酶活值最高的突變株作為最優(yōu)突變體，從4°C保藏的96 孔板對應(yīng)的孔中接取相對應(yīng)突變體于新鮮LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒進行測序，同時 將對應(yīng)菌株進行斜面保藏。
[0049] (3)突變體的表達與純化
[0050] 為了進一步驗證所獲得的突變體的催化性質(zhì)和熱穩(wěn)定性和野生型酶相比有所提 升，在平板上挑取含上述重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落于含l(K)yg/mL硫酸卡納霉素的LB液體 培養(yǎng)基，37 °C 20化pm培養(yǎng)10-1化，按4 %接種量轉(zhuǎn)接至含10化g/mL硫酸卡納霉素的TB液體培 養(yǎng)基。重組菌在37 °C 20化pm培養(yǎng)至0〇6日日約為1.0，加入0.06mM終濃度IPTG和和8mM終濃度α- 乳糖誘導(dǎo)表達，并在24°C15化pm下培養(yǎng)化。將表達后的菌液在4°C、900化pm離屯、20min，棄菌 體收集上清。將獲得的上清液加入M-NTA親和層析柱，上樣后使用1 XBinding Buffer洗脫 直至吸光值平穩(wěn)，分別加入50mM、lOOmM及250mM終濃度的咪挫溶液洗脫目的蛋白。通過酶活 測定和SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)突變酶主要出現(xiàn)在lOOmM咪挫洗脫液中，且條帶單一。將含有目 的蛋白的洗脫液通過GE PD-10脫鹽柱，使用20mM憐酸緩沖液(PH6.5)洗下目的蛋白。之后使 用蛋白超濾離屯、管濃縮，從而得到純酶。
[0051 ]實施例3酶活及蛋白濃度分析
[0052] (1)酶活測定方法：
[0053] 3,5-二硝基水楊酸(DNS)法及改良AZ0測定方法相結(jié)合測定β-葡聚糖酶活力的方 法：
[0054] 酶活定義：lmL酶液在40°C和抑值為6.5條件下，每分鐘水解護葡聚糖生成相當(dāng)于1 μπιο?的葡萄糖還原物質(zhì)的量為1個酶活力單位，WU/mL表示。
[0055] 發(fā)酵清液酶活力測定：發(fā)酵液經(jīng)過離屯、后，將上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，測定其酶活 力。
[0化6]葡萄糖標準曲線的繪制:分別吸取1%葡萄糖標準溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于 5〇mL容量瓶中，用蒸饋水定容至刻度，制成每毫升分別含葡萄糖200、400、600、800、1000、 1200yg的稀標準液。各取不同濃度的稀標準液0.5mL于試管中，加入PH6.5憐酸氨二鋼一憐 酸二氨鋼緩沖液1.5mL，再加入DNS試劑3. OmL，于沸水浴中煮沸7min，取出后迅速冷卻至室 溫后加入蒸饋水10血，搖勻。W蒸饋水0.5mL代替葡萄糖稀標準液作為對照，用10mm比色皿， 在波長55化m處用分光光度計分別測定其吸光度。W吸光度為縱坐標，相對應(yīng)的葡萄糖濃度 為橫坐標，繪制標準曲線。
[0057]樣品酶活測定:精確吸取待測稀釋酶液0.5mL(每個樣品3支平行試管），及抑6.5憐 酸二氨鋼一憐酸氨二鋼緩沖液1. OmL，置于40°C水浴預(yù)熱5min，加入經(jīng)預(yù)熱的1.0 %β-葡聚 糖溶液0.5mL，立即開始計時，于40°C水浴精確反應(yīng)lOmin，立即加入3.OmlDNS液終止反應(yīng)， 然后置于沸水浴中7min，取出迅速冷卻后加入lOmL去離子水，搖勻后，測定550nm下的反應(yīng) 液的吸光值。同時進行空白對照測定，其步驟為吸取待測稀釋酶液0.5mL，加入1. OmL P冊.0 憐酸氨二鋼一巧樣酸緩沖液，然后先加入3.OmL DNS液使酶失活，40°C水浴預(yù)熱，再加入同 樣經(jīng)預(yù)熱的1.0%β-葡聚糖溶液〇.5mL，4(TC水浴lOmin，然后置于沸水浴中7min，W后步驟 同于樣品測定，由樣品測定時得到吸光值，根據(jù)標準曲線即可得到相應(yīng)的酶活力單位。
[0化引（2)蛋白濃度測定：
[0059] 化a壯ord法測定溶液中蛋白濃度的方法：
[0060] 取20化L待測樣品加入2mL化a壯ord試劑，混勻后迅速在595皿下測定吸光值，空 白為抑6.5憐酸鹽緩沖液。每組樣品^個平行，所得吸光值對照標準曲線方程7 = 0.0042義+ 0.0082可得溶液中的蛋白濃度。
[0061 ] (3)催化性質(zhì)比較：實驗結(jié)果列于表1、圖1。將野生酶制品和E46P/S43E/H205P/ S40E突變體相比，可W發(fā)現(xiàn)，突變酶的比活力和野生酶相比相差不大，僅有小量提升。而突 變體的Km值、Kcat值和Kcat/Km值和幾乎和野生酶相同。
[0062] 表1野生酶與β-葡聚糖酶E46P/S43E/肥05P/S40E突變體的催化性質(zhì)比較
[0063]
[0064] 實施例4野生酶和突變酶的熱穩(wěn)定性
[0065] (1)野生酶和突變酶的最適溫度測定方法：
[0066] 取獲得的酶制品lOOyL，分別于不同溫度(35、40、45、50、55、，60、65、70°C )測定酶 活力。W酶活最大值作為100%相對酶活，其他溫度下的酶活值除W最大值所得百分數(shù)即為 該溫度下的相對酶活。從圖2可W看出，野生酶的最適溫度為60°C，而E46P/S43E/H205P/ S40E突變體的最適溫度為65°C。
[0067] (2)野生酶與突變酶在60°C和70°C的半衰期測定方法：
[0068] 取獲得的酶制品2mL，分別于60°C和70°C處理不同時間（10-150min)，立即取出置 于冰上冷卻lOmin，將處理液稀釋合理倍數(shù)后取10化L測定β-葡聚糖酶活力。W處理前發(fā)酵 液酶活值作為100%相對酶活，不同處理時間下的酶活值除W最大值所得百分數(shù)即為該條 件下的相對酶活。從圖3和圖4可W看出E46P/S43E/H205P/S40E突變體在60 °C下和70 °C下的 半衰期分別為126.4分鐘和80.4分鐘，而野生酶在60°C下和70°C下的半衰期測定則分別為 59分鐘和27.8分鐘。
[0069] (3)野生酶與突變酶的T50值測定方法：
[0070] 取獲得的酶制品2mL，分別于不同溫度（40、45、50、55、60、65、70、75、80°C)處理 15min，立即取出置于冰上冷卻lOmin，取lOOiiL測定β葡聚糖酶活力。W酶活最大值作為 100%相對酶活，其他溫度下的酶活值除W最大值所得百分數(shù)即為該溫度下的相對酶活。Τ50 值定義為經(jīng)過上述處理酶活降低至初始酶活一半時的溫度。從圖5可W看出，突變酶的失活 曲線均比野生酶緩和。野生酶的Τ50值為76°C而E46P^43E/H205P/S40E突變體的Τ50值為 79.5Γ。
[0071] 雖然本發(fā)明已W較佳實施例公開如上，但其并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該W權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種1，3-1，4-β-葡聚糖酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列:a)如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6或SEQ ID NO.7所示;b)或在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有 1，3-1，4-β-葡聚糖酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2. 編碼權(quán)利要求1所述突變體的核苷酸序列。3. 含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的載體或細胞。4. 表達權(quán)利要求1所述突變體的基因工程菌。5. 根據(jù)權(quán)利要4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pET28a( + )質(zhì)粒為 表達載體，以大腸桿菌為表達宿主。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主為大腸桿菌BL21 (DE3)。7. -種獲得權(quán)利要求1所述突變體的方法，其特征在于，將編碼突變體的基因片斷連接 至原核表達載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行表達。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，是以親本1，3-1，4-β-葡聚糖酶基因為模 板，采用迭代飽和突變的方法進行突變，獲得編碼突變體的基因片段。9. 權(quán)利要求1所述突變體在食品、飼料領(lǐng)域的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求1所述突變體在降低麥汁黏度中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種1,3-1,4-β-葡聚糖酶突變體，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明將特基拉芽孢桿菌(Bacillus？terquilensis)CGX？5-1來源的1,3-1,4-β-葡聚糖酶的第40位的絲氨酸和43位的絲氨酸、46位的谷氨酸和205位的組氨酸通過迭代飽和突變的方法分別突變?yōu)楣劝彼?、谷氨酸、脯氨酸和脯氨酸，最終獲得四株單突變體和三株復(fù)合突變體。七株突變酶均表現(xiàn)出了更好的熱穩(wěn)定性，尤其是S40E/S43E/E46P/H205P突變酶具有極佳的熱穩(wěn)定性。這些突變酶和野生酶相比更有利于其在工業(yè)上的應(yīng)用。
【IPC分類】C12R1/19, C12N1/21, C12N15/56, C12N9/42, A23L29/00, A23K20/189, C12C5/00, C12N15/70, C12C7/04
【公開號】CN105671022
【申請?zhí)枴緾N201610139909
【發(fā)明人】李崎, 鈕成拓, 朱林江, 王金晶, 李永仙, 鄭飛云, 劉春鳳
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年3月11日