一種基于pamam的自組裝納米基因載體復合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物，其是由HA、PAMAM和gene通過相互靜電作用自組裝組成的復合體系，表示為HA/PAMAM/gene，其中PAMAM選自不同代數(shù)的聚酰胺-胺樹狀大分子，HA選自不同分子量的透明質(zhì)酸及其鈉鹽，gene選自治療性基因藥物。該復合物能有效延長血液循環(huán)時間，更有效的將基因藥物輸送入腫瘤組織，同時保護基因藥物不被降解，降低PAMAM的毒副作用，從而提高基因治療的療效，彌補了單一PAMAM載體存在的不足。本發(fā)明同時提供了上述復合物的制備方法，先將PAMAM與gene的水溶液混合孵育，通過靜電吸附作用形成PAMAM/gene復合物，再加入HA溶液，室溫孵育通過靜電吸附作用自組裝形成三元復合物HA/PAMAM/gene。
【專利說明】—種基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種非病毒陽離子載體的基因治療組合物，更具體的說，涉及一種基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物及其制備方法，屬于藥物制劑【技術領域】。
【背景技術】
[0002]近年來，腫瘤已經(jīng)成為繼心血管疾病之后威脅人類健康最嚴重的疾病之一。目前，腫瘤的常用治療手段主要是手術治療、放射治療和化療。這些手段雖然可以使患者獲得較高的生存率，但術后復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移的問題仍然是困擾學者們的一大難題。隨著分子生物學技術及免疫學技術的迅猛發(fā)展和人類對腫瘤發(fā)病機制認識的不斷深入，基因治療逐漸成為腫瘤生物學治療中的重要組成部分。
[0003]對 于成功的基因治療，要求在機體內(nèi)能有效安全地遞送基因進入靶細胞。目前遞送基因藥物的載體主要有兩類:病毒載體和非病毒載體。病毒載體能夠高效穩(wěn)定遞送基因藥物，但是載體本身具有的免疫原性和潛在致突變性是臨床使用病毒性載體遞送基因藥物的主要障礙。非病毒載體能很好地克服病毒載體的缺陷，但轉(zhuǎn)染效率低，傳遞基因的表達效率低及體內(nèi)循環(huán)時間較短。
[0004]Starburst PAMAM dendrimers 是 1985 年由美國密西根化學研究所 Donald.A.Tomalia等人首先合成的一類新型高分子聚合物。在生理條件下，PAMAM末端-NH2基團完全質(zhì)子化成為帶正電荷的-NH3+,使分子表面具有很高的正電荷密度，能與基因發(fā)生靜電相互作用形成復合物，并具有較高的轉(zhuǎn)染率。但PAMAM作為基因遞送載體在體內(nèi)應用尚存在以下幾個問題需要解決:1.PAMAM的高正電荷密度導致高毒性；2.在體內(nèi)環(huán)境下，PAMAM可非特異性地結(jié)合大量的負電大分子影響轉(zhuǎn)染效率；3.實現(xiàn)PAMAM基因遞釋系統(tǒng)的靶向性。
[0005]透明質(zhì)酸(hyahironicacid, HA)是一種獨特的線性大分子酸性粘多糖,作為藥物緩釋載體具有優(yōu)良的生物相容性和可降解性。研究發(fā)現(xiàn)，某些實體腫瘤和轉(zhuǎn)移淋巴細胞表面存在大量透明質(zhì)酸受體一⑶44，而且⑶44目前已成為識別腫瘤干細胞常見的標志物。將HA作為抗腫瘤藥物的靶向載體，所形成的粒子或復合物能使更多的藥物進入腫瘤組織，增加藥物在腫瘤和淋巴結(jié)中的吸收和滯留時間，從而提高藥物的療效，降低毒副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是:針對現(xiàn)有的單一 PAMAM基因載體存在的不足，而提供一種基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物，該基因載體復合物制備簡單，能更有效的將治療性基因藥物送入腫瘤組織，并提高藥物在腫瘤和淋巴結(jié)中的吸收和滯留時間，從而提高藥物的療效，同時具有更低的毒副作用。
[0007]本發(fā)明的技術方案是:一種基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物，其特征在于該基因載體復合物是由HA、PAMAM和gene通過相互靜電(吸附)作用自組裝組成的復合體系，表示為HA/PAMAM/gene，其中PAMAM選自不同代數(shù)的聚酰胺-胺樹狀大分子，HA選自不同分子量的透明質(zhì)酸及其鈉鹽，gene選自治療性基因藥物。
[0008]進一步的，本發(fā)明中所述基因載體復合物中的PAMAM與治療性基因藥物的正負電荷比為24:1~10:1 ;PAMAM與HA的正負電荷比為1:0.05~1:1。
[0009]優(yōu)選的，本發(fā)明中所述PAMAM是末端帶有氨基，以乙二胺為核的3.0,4.0,5.0或
6.0代的聚酰胺-胺樹狀大分子。
[0010]優(yōu)選的，本發(fā)明中所述治療性基因藥物是指siRNA和DNA。在實際實施時，其中的siRNA 優(yōu)選為 negative control siRNA,該 siRNA 的
[0011]反義鏈:5，-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3，；
[0012]正義鏈:5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，。
[0013]優(yōu)選的，本發(fā)明中所述透明質(zhì)酸及其鈉鹽的分子量范圍為5000Da_200000Da。在實際實施時，優(yōu)選分子量為IlOOODa的透明質(zhì)酸及其鈉鹽。
[0014]本發(fā)明的另一目的是提供一種上述基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物的制備方法，包括下述步驟:
[0015](I)將PAMAM的水溶液 與gene的水溶液混合孵育，通過靜電吸附作用形成PAMAM/gene的復合物；
[0016](2)向步驟(1)得到的PAMAM/gene的復合物中加入HA溶液，室溫孵育通過靜電吸附作用自組裝形成HA/PAMAM/gene三元復合物；
[0017]其中PAMAM選自不同代數(shù)的聚酰胺-胺樹狀大分子，HA選自不同分子量的透明質(zhì)酸及其鈉鹽，gene選自治療性基因藥物。
[0018]進一步的，上述制備方法的步驟(1)中所述PAMAM的水溶液由下述方法配制而成:
[0019](I)將PAMAM干燥，除去甲醇溶劑后，再用PH=7.4的PBS緩沖液溶解，制備成
5-20mg/mL 儲存液；
[0020](2)將步驟(1)制成的儲存液溶解于DEPC水中，振蕩混勻，配制成l_2mg/mL的所述PAMAM的水溶液。
[0021]進一步的，上述制備方法的所述步驟(1)中所述gene的水溶液由下述方法配制而成:
[0022]將所述gene溶于DEPC水中，震蕩搖勻，配制成0.1-0.2mg/mL的所述的gene的水溶液。
[0023]進一步的，上述制備方法的所述步驟(1)的渦旋孵育中，將所述PAMAM水溶液，gene水溶液和opt1-MEM培養(yǎng)基已1:1:25的體積比混合，混勻后置室溫孵育20_30min形成所述PAMAM/gene復合物。
[0024]進一步的，上述制備方法的所述步驟(2)中具體是將HA先用PH=7.4的PBS緩沖液溶解，配制成濃度為l_5mg/mL的HA溶液，再依次稀釋至0.1-lmg/mL溶液，取HA溶液以I: I的體積比加入到步驟(1)得到的PAMAM/gene復合物中，混勻后置室溫孵育20_30min自組裝形成HA/PAMAM/gene復合物。
[0025]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0026]本發(fā)明提供的基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物，該基因載體復合物制備方法簡單，并能有效的將藥物送入腫瘤組織，提高藥物在腫瘤和淋巴結(jié)中的吸收和滯留時間，從而提高藥物的療效，同時具有更低的毒副作用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0027]圖1為不同HA比例修飾對HA/PAMAM/siRNA復合物粒徑及Zeta電位的影響。
[0028]圖2為HA/PAMAM/siRNA復合物的瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗結(jié)果。
[0029]圖3為HA/PAMAM/siRNA復合物抵抗RNase的穩(wěn)定性實驗結(jié)果。
[0030]圖4為HA/PAMAM/siRNA復合物細胞毒性實驗結(jié)果。
[0031]圖5為裸siRNA的體外轉(zhuǎn)染熒光顯微鏡觀察細胞攝取實驗結(jié)果。
[0032]圖6為制備的PAMAM/siRNA復合物的體外轉(zhuǎn)染熒光顯微鏡觀察細胞攝取實驗結(jié)果O
[0033]圖7為制備的HA/PAMAM/siRNA復合物的體外轉(zhuǎn)染熒光顯微鏡觀察細胞攝取實驗結(jié)果。
[0034]圖8為裸siRNA、PAMAM/siRNA復合物、HA/PAMAM/siRNA復合物的體外轉(zhuǎn)染流式細胞儀測定細胞攝取對比圖譜。
[0035]圖9為siRNA、 PAMAM/siRNA復合物、HA/PAMAM/siRNA復合物的體外轉(zhuǎn)染流式細胞儀測定細胞攝取結(jié)果柱狀對比圖。
[0036]圖10為HA/PAMAM/siRNA復合物轉(zhuǎn)染ant1-VEGF siRNA對乳腺癌腫瘤細胞MCF-7的VEGF蛋白表達的抑制作用考察結(jié)果。
[0037]圖11為HA/PAMAM/siRNA復合物轉(zhuǎn)染ant1-VEGF siRNA對乳腺癌腫瘤細胞MCF-7增殖抑制作用的考察結(jié)果。
【具體實施方式】
[0038]實施例:下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040]聚酰胺-胺(PAMAM)樹狀大分子:末端帶有氨基，以乙二胺為核，4.0代，(購自Sigma-Aldrich，產(chǎn)品目錄號:41244_9，規(guī)格lg，數(shù)均分子量為14215);采用6(TC真空干燥，除去甲醇溶劑，獲得G4.0ΡΑΜΑΜ,再用PBS緩沖液(pH7.4，NaC18.0g, KC10.2g，Na2HPO4* 12H202.9g, KH2PO40.2g，蒸餾水定容至 1000mL)溶解，制備成 10mg/mL 儲存液于 4°C備用。
[0041]透明質(zhì)酸(HA)購自山東福瑞達生物化工有限公司，規(guī)格50g，平均分子量為IlOOODa0
[0042]一、HA/PAMAM/siRNA 復合物的制備
[0043]HA/PAMAM/siRNA復合物按照如下步驟的方法制備而成:
[0044](I)首先將上述制成的G4.0PAMAM(平均分子量為14215) 10mg/mL儲存液溶解于DEPC水中，振蕩混勻，配制成1.15mg/mL的工作溶液，4°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0045](2)將 negative control siRNA
[0046](反義鏈:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’，正義鏈:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)溶于DEPC水中，震蕩搖勻，配制成0.13mg/mL的工作液。向20 μ L的siRNA溶液中加20 μ L濃度為1.15mg/mL的G4.0PAMAM工作溶液，再加入opt1-MEM培養(yǎng)基(購自invitrogen，產(chǎn)品目錄號為11058-021) 460 μ L，混勻后置室溫孵育20_30min形成PAMAM/siRNA復合物。形成的PAMAM/siRNA復合物中，PAMAM與siRNA的正負電荷比為 12:1。
[0047](3)將透明質(zhì)酸(HA)用 PBS 緩沖液(ρΗ7.4，NaC18.0g，KC10.2g，Na2HPO4.12H202.9g，KH2PO40.2g，蒸餾水定容至 lOOOmL)，配制成濃度為 2mg/mL 的 HA 溶液，依次稀釋至 lmg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.15mg/mL 溶液。向 500 μ L 的 PAMAM/siRNA 復合物加入20 μ L不同濃度的HA溶液，混勻后置室溫孵育20-30min形成HA/PAMAM/siRNA復合物。形成HA/PAMAM/siRNA復合物中，PAMAM與siRNA的正負電荷比為12:1 ；PAMAM與HA的正負電荷比分別為1:0.075、1:0.125、1:0.25、1:0.5、1:1。將上述制備的復合物溶液放入激光粒度儀自動檢測粒徑和Zeta電位(美國NICOMP公司，型號NICOMP TM380ZLS)。
[0048]結(jié)果表明，采用HA修飾預先成型的PAMAM/siRNA復合物，隨著復合物中HA的增加，復合物的粒徑增加，正電性減弱，參見圖1所示。
[0049]二、HA/PAMAM/siRNA復合物的瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗及RNase穩(wěn)定性實驗
[0050]將上述實施例1制備HA/PAMAM/siRNA復合物，采用瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗和RNase穩(wěn)定性實驗證明PAMAM與siRNA的復合情況以及穩(wěn)定性，所檢測的HA/PAMAM/siRNA復合物中，PAMAM與siRNA的正負電荷比為12: 1，PAMAM與HA的正負電荷比為1:0.25。具體實驗方法如下:
[0051 ] (I)瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗
[0052]稱取適量瓊脂糖，加入I XTAE溶液，加熱溶解，配制成1.5%瓊脂糖凝膠溶液，室溫冷卻至約40°c，加入I μ L溴化乙錠溶液(500 μ g/ml)灌膠，加樣，60V電泳20min左右，紫外透射儀觀察并拍照。新鮮配制所需轉(zhuǎn)染復合物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定包封效果。瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗結(jié)果如圖2所示(圖2中，泳道I為裸siRNA ;泳道2為PAMAM/siRNA復合物；泳道3為HA/PAMAM/siRNA復合物)，從圖2中可見，與裸siRNA不同，PAMAM/siRNA復合物與HA/PAMAM/siRNA復合物都未能向正極遷移，說明siRNA可分別被完全吸附于PAMAM/siRNA復合物與HA/PAMAM/siRNA復合物中。
[0053](2) RNase穩(wěn)定性實驗
[0054]向上述上述實施例1制備的HA/PAMAM/siRNA復合物中加入0.lmg/mL的RNase溶液，混勻后37°C水浴搖床孵育2h，加入1000IU/mL肝素鈉取代復合物中的siRNA。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色，觀察siRNA的降解情況。結(jié)果如圖3所示(圖3中，泳道I為PAMAM/siRNA復合物+RNase ;泳道2為HA/PAMAM/siRNA復合物+RNase ;泳道3為裸siRNA+RNase ;泳道4為裸siRNA)，從圖3可見，裸siRNA極易被RNase降解，而PAMAM/siRNA、HA/PAMAM/siRNA復合物能維持siRNA長時間不被降解。以上結(jié)果表明，HA/PAMAM/siRNA復合物可以有效包裹并且保護siRNA免受RNase的降解。
[0055]三、HA/PAMAM/siRNA復合物的細胞毒性實驗
[0056]按上述實施例1制備HA/PAMAM/siRNA復合物，采用MTT法檢測其細胞增殖情況，具體方法如下:
[0057]將MCF-7細胞按每孔6 X IO3個細胞接種96孔板，24h后進行轉(zhuǎn)染，將細胞隨機分為正常對照組、PAMAM/siRNA組以及HA/PAMAM/siRNA轉(zhuǎn)染組(siRNA終濃度為100nmol/mL)，每組設6個復孔，重復3次，處理48h。用MTT法測定OD49tl值繪制生長曲線并計算各組MCF-7細胞的相對存活率(％ )。[0058]MCF-7細胞的相對存活率(％ )=(實驗組0D490值/對照組0D490值)X 100%
[0059]實驗結(jié)果如圖4所示，HA/PAMAM/siRNA復合物對MCF-7細胞的增殖抑制作用低于PAMAM/siRNA復合物，表明HA的加入屏蔽了部分PAMAM表面的強正電荷，降低了 PAMAM作為載體本身的細胞毒性。
[0060]四、HA/PAMAM/siRNA復合物的體外轉(zhuǎn)染實驗
[0061 ] 按上述實施例1制備HA/PAMAM/siRNA復合物(本實施例中siRNA采用FAM熒光標記，即FAM-siRNA，委托上海吉瑪公司合成)，測定其體外轉(zhuǎn)染效果，具體方法如下:
[0062]以高表達⑶44受體的乳腺癌腫瘤細胞MCF-7作為考察對象，將對數(shù)生長期的MCF-7細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔I X IO5個，于37°C和5% C02培養(yǎng)24h至細胞達到60%匯合度，棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌三次。然后分別加入熒光標記的siRNA及轉(zhuǎn)染復合物:FAM-siRNA，PAMAM/FAM-siRNA 復合物和 HA/PAMAM/FAM-siRNA 復合物于 37°C培養(yǎng) 4h后置熒光顯微鏡下觀察(結(jié)合圖5~圖7所示)，可知加入HA的復合物HA/PAMAM/FAM-siRNA的細胞轉(zhuǎn)染熒光強度明顯高于沒有HA的復合物PAMAM/FAM-siRNA和裸FAM-siRNA。
[0063]收集細胞用流式細胞儀檢測細胞分別對FAM-siRNA、PAMAM/FAM-siRNA復合物、HA/PAMAM/FAM-siRNA復合物的攝取情況(結(jié)合圖8、圖9所示)，可知MCF-7細胞對HA/PAMAM/FAM-siRNA 的攝取明顯高于 PAMAM/FAM-siRNA，約為 1.5 倍。
[0064]五、HA/PAMAM/siRNA復合物轉(zhuǎn)染anti_VEGF siRNA的有效性考察
[0065]按實施例1所述的方法制備HA/PAMAM/siRNA復合物，不同的是將negativecontrol siRNA替換為針對 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growthfactor, VEGF)的mRNA特異性siRNA序列(委托上海吉瑪公司合成，antisense:5，-GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3，，sense:5，-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3，)。制備的 HA/PAMAM/siRNA復合物中，PAMAM與siRNA的正負電荷比為12:1 ；PAMAM與HA的正負電荷比為 1:0.25。
[0066]將MCF-7細胞按每孔6 X IO3個細胞接種96孔板，24h后轉(zhuǎn)染，將細胞分為正常對照組，PAMAM/N.C.siRNA 組、PAMAM/ant1-VEGF siRNA 組、HA/PAMAM/N.C.siRNA 組和 HA/PAMAM/ant1-VEGF siRNA組，其中ant1-VEGF siRNA具有抑制VEGF蛋白表達的功能，而N.C.siRNA不對細胞增殖產(chǎn)生任何影響。
[0067](I)蛋白表達情況
[0068]采用ELISA法測定復合物轉(zhuǎn)染ant1-VEGF siRNA對MCF-7細胞VEGF蛋白的抑制作用，重復3次，轉(zhuǎn)染48h后進行對照。
[0069]VEGF蛋白相對表達率(％ )=(實驗組蛋白濃度/對照組蛋白濃度)X 100%
[0070]結(jié)果如圖10所示，使用N.C.siRNA的復合物組細胞外排VEGF蛋白無明顯變化，而HA/PAMAM/ant1-VEGF siRNA 組與不加入 HA 的實驗組(即 PAMAM/ant1-VEGF siRNA 組)都表現(xiàn)出明顯的VEGF表達抑制作用，并且HA/PAMAM/ant1-VEGF siRNA組的干擾作用更為顯者。
[0071](2)細胞增殖情況
[0072]采用MTT法檢測復合物轉(zhuǎn)染ant1-VEGF siRNA對MCF-7細胞增殖的抑制作用，每組設6個復孔，重復3次，轉(zhuǎn)染48h后進行對照，MTT法測定0D490值繪制生長曲線并計算各組細胞的相對存活率。[0073]MCF-7細胞的相對存活率(％ )=(實驗組0D490值/對照組0D490值)X 100%。
[0074]結(jié)果如圖11 所示，較 PAMAM/N.C.siRNA 組比，HA/PAMAM/N.C.siRNA 組的細胞存活率顯著提高，說明HA的修飾降低了 PAMAM作為載體本身的細胞毒性；而HA/PAMAM/ant1-VEGF siRNA組對腫瘤細胞的毒性較陰性組HA/PAMAM/N.C.siRNA組顯著提高，細胞存活率下降，約為陰性組的67%，不加入HA的實驗組，PAMAM/ant1-VEGF siRNA的細胞存活率則只下降為PAMAM/N.C.siRNA的90%，可得出HA/PAMAM/ant1-VEGF siRNA對腫瘤細胞表現(xiàn)出更加顯著的干擾抑制作用。
[0075]當然上述實施例只是為說明本發(fā)明的技術構(gòu)思及特點所作的例舉而非窮舉，其目的在于讓熟悉此項技術的人能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā) 明主要技術方案的精神實質(zhì)所做的修飾，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物，其特征在于該基因載體復合物是由HA、PAMAM和gene通過相互靜電作用自組裝組成的復合體系，表示為HA/PAMAM/gene，其中PAMAM選自不同代數(shù)的聚酰胺-胺樹狀大分子，HA選自不同分子量的透明質(zhì)酸及其鈉鹽，gene選自治療性基因藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物，其特征在于:所述基因載體復合物中的PAMAM與治療性基因藥物的正負電荷比為24:1~10:1 ;PAMAM與HA的正負電荷比為1:0.05~1:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物，其特征在于:所述PAMAM是末端帶有氨基，以乙二胺為核的3.0,4.0,5.0或6.0代的聚酰胺-胺樹狀大分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物，其特征在于:所述治療性基因藥物是指siRNA和DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物，其特征在于:所述透明質(zhì)酸及其鈉鹽的分子量范圍為5000Da-200000Da。
6.如權(quán)利要求1~5中任意一項所述的基于PAMAM的自組裝納米基因載體復合物的制備方法，其特征在于包括下述步驟: (1)將PAMAM的水溶液與gene的水溶液混合孵育，通過靜電吸附作用形成PAMAM/gene的復合物； (2)向步驟(1)得到的PAMAM/gene的復合物中加入HA溶液，室溫孵育通過靜電吸附作用自組裝形成HA/PAMAM/gene三元復合物； 其中PAMAM選自不同代數(shù)的聚酰胺-胺樹狀大分子，HA選自不同分子量的透明質(zhì)酸及其鈉鹽，gene選自治療性基因藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中所述PAMAM的水溶液由下述方法配制而成: (1)將PAMAM干燥，除去甲醇溶劑后，再用PH=7.4的PBS緩沖液溶解，制備成5_20mg/mL儲存液； (2)將步驟(1)制成的儲存液溶解于DEPC水中，振蕩混勻，配制成l-2mg/mL的所述PAMAM的水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中所述gene的水溶液由下述方法配制而成: 將所述gene溶于DEPC水中，震蕩搖勻，配制成0.1-0.2mg/mL的所述的gene的水溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6或7或8所述的制備方法，其特征在于所述步驟(1)的渦旋孵育中，將所述PAMAM水溶液，gene水溶液和opt1-ΜΕΜ培養(yǎng)基以1:1:25的體積比混合，混勻后置室溫孵育20-30min形成所述PAMAM/gene復合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中將HA先用PH=7.4的PBS緩沖液溶解，配制成濃度為l_5mg/mL的HA溶液，再依次稀釋至0.1-lmg/mL溶液，取HA溶液以1:1的體積比加入到步驟(1)得到的PAMAM/gene復合物中，混勻后置室溫孵育20-30min自組裝形成HA/PAMAM/gene復合物。
【文檔編號】A61K48/00GK103536934SQ201310404541
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】程麗芳, 程亮, 陳大為, 張璐 申請人:蘇州大學