專利名稱：利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)以及甲殼素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物從海洋動(dòng)物提取蝦青素、蛋白質(zhì)、殼質(zhì)多糖的技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景蝦青素是一種酮式非維生素A原的類胡蘿卜素，分子式Ch)H5204。由于分子 中存在較長(zhǎng)的共軛雙鍵，極易捕獲電子，是單線態(tài)氧的淬滅劑，具有清除自由基的能力和超級(jí)抗氧化活性，效果可為普通維生素E的500倍[1]。其生物活性主 要表現(xiàn)在預(yù)防動(dòng)脈硬化、抗癌活性、增強(qiáng)免疫、維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)健康等方面。 可作為人類高級(jí)營(yíng)養(yǎng)保健及醫(yī)藥產(chǎn)品和水產(chǎn)、畜禽的飼料添加劑，尤其是水產(chǎn) 養(yǎng)殖業(yè)始終是蝦青素最大的市場(chǎng)。在商業(yè)化的魚(yú)類和甲殼動(dòng)物(如鮭魚(yú)、蟲(chóng)下、蟹、 虹鱒魚(yú)等)養(yǎng)殖廠，通常在飼料中添加蝦青素，以保證魚(yú)苗的成活率及提高產(chǎn)品 的市場(chǎng)價(jià)值[2]。蝦青素是類胡蘿卜素合成的終點(diǎn)，由P-胡蘿卜素轉(zhuǎn)變?yōu)槲r青素需加上兩個(gè) 酮基和兩個(gè)羥基，因此化學(xué)合成困難，生產(chǎn)成本高。同天然蝦青素比，動(dòng)物體對(duì)化學(xué)合成蝦青素吸收能力弱。同時(shí)化學(xué)合成法生產(chǎn)的蝦青素是多種構(gòu)型的混 合物，出于安全性考慮，在食品，詞料，醫(yī)藥及化妝品上的應(yīng)用都有很大限制， 如美國(guó)食品及藥物管理局(FDA)已經(jīng)禁止使用化學(xué)合成的蝦青素[3]。我國(guó)也 已禁止人工合成的蝦青素用于雞、鴨等家禽的飼養(yǎng)[4]。蝦青素廣泛存在于生物界中，特別是水生動(dòng)物如蝦、蟹及魚(yú)中，含量豐富。 目前，全世界每年有幾百萬(wàn)噸的蝦殼作為甲殼素生產(chǎn)的原料我國(guó)沿海水產(chǎn)資源豐富，甲殼類加工尤其是蝦仁加工企業(yè)的下腳料中含有 大量蝦青素，但回收利用較少。目前，我國(guó)主要用這些下腳料來(lái)生產(chǎn)甲殼素。 脫色廢水中的蝦青素增加了廢水的色度。而蛋白質(zhì)經(jīng)堿處理后作為廢水排放， 造成環(huán)境污染，且浪費(fèi)了蛋白質(zhì)和蝦青素等重要資源。以往對(duì)于蝦殼中蝦青素 的提取，主要采用酸堿處理，并用大量有毒溶劑提取。其成本高，效率底，對(duì) 環(huán)境污染嚴(yán)重。而目前在甲殼素，殼多糖及寡糖的生產(chǎn)中使用的脫色工藝仍以 這種方式為主[5]。由于傳統(tǒng)方法的種種弊端，使用生物手段提取色素的方法正逐歩引起人們的重視。國(guó)內(nèi)己有大量學(xué)者嘗試使用不同酶處理蝦殼，取得了很好的效果[6]。而國(guó)外也已經(jīng)有學(xué)者使用了乳酸菌用來(lái)發(fā)酵蝦殼，提取蝦青素m。與酶法相比，除了成本相對(duì)低廉以外使用微牛物發(fā)酵還有(l)使體系中氫離子增多，從 而增強(qiáng)了體系的還原性，抑制了蝦青素的氧化；(2)酸的脫鈣化作用，促進(jìn)了蝦 青素與鈣的解離；(3)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生各種酶(主要是蛋白酶)促進(jìn)了蛋白質(zhì)等的水解，從而提高了蝦青素的提取率等優(yōu)點(diǎn)。但是從報(bào)道的情況看，普遍存在發(fā)酵 時(shí)間較長(zhǎng)、產(chǎn)酸速度慢的問(wèn)題，且所作研究尚處于實(shí)驗(yàn)階段。特別是尚未見(jiàn)到 用蝦殼既提取出蝦青素、又能提取其蛋白粉、還能為甲殼素提供粗品原料的綜 合利用的工藝技術(shù)報(bào)道。 參考文獻(xiàn)-[1]彭小蘭蝦青素的生理功能及其生產(chǎn)與應(yīng)用研究[J].當(dāng)代畜牧.2005年第11 期.[2]李浩明，高藍(lán)蝦青素的結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用[J].精細(xì)化工2003年1月.第20巻第 l期.[3]滕長(zhǎng)英，張立，秦松，屈慧鴿蝦青素的應(yīng)用及生產(chǎn)來(lái)源[J]安徽農(nóng)業(yè)科 學(xué)2007. 35 (8):2298-2299.[4]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部關(guān)于蝦青素(加麗素紅)作為著色劑不能用于家禽飼 料添加劑2004年318號(hào)公告.[5]姜啟興，夏文水.甲殼類加工下腳料中蝦青素的提取研究[J].食品科技.2003.12 [6]朱藝峰魚(yú)飼料著色劑--甲殼類下腳料類胡蘿卜素的提取技術(shù)[J].海洋湖沼通 報(bào).2000.2[7] Armenta L R, Guerrero L I, Huerta S. Astaxanthin extraction from shrimp waste by lactic fermentation an denzymatic hydrolysis of the carotenoprotein complex [J].J Food Chem， 2002, 67(3): 1002-1006. 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明立意是如果能在甲殼素生產(chǎn)之前提取出蟲(chóng)下青素，不但為企業(yè)獲得 更大的經(jīng)濟(jì)效益，而且有利于提高甲殼素的質(zhì)量，減少?gòu)U水的色度，對(duì)廢水治 理具有積極作用。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明旨在提供一種簡(jiǎn)易而有效的從蟲(chóng)下殼中提 取蝦青素的方法。不僅如此，而且能充分利用資源提取其中的蛋白質(zhì)、以及剩余物成為制取殼聚糖精品的原料，從而綜合利用蝦殼資源。研究表明，革蘭氏陰性桿菌鄰單胞桿菌(P/w',o"as)在37'C的條件下可以快速的分解蝦殼，且在此過(guò)程中可以利用蝦殼為唯一營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，不需外加營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)。蝦青素在蝦殼中主要與蛋白質(zhì)結(jié)合，使其提取較為困難。 一旦蝦殼中 的蛋白質(zhì)被分解利用，蝦青素就處于游離或半游離狀態(tài)，提取也就比較容易了。 同時(shí)沒(méi)有被微生物完全消耗的蛋白質(zhì)，還可以做為一種副產(chǎn)品加以回收，剩余 的殘?jiān)勺鳛榧讱に氐纳a(chǎn)原料。本發(fā)明的技術(shù)方案是蝦殼粉碎后水煮滅菌，接種革蘭氏陰性桿菌鄰單胞 桿菌菌種進(jìn)行降解發(fā)酵，降解物離心，液體經(jīng)濃縮、干燥得蛋白粉；固體用溶 劑浸泡，再經(jīng)離心，液體經(jīng)除去溶劑即得蝦青素；沉淀中下層為粗品甲殼素； 沉淀中上層為菌體以及少量蛋白，用作生物肥料。 本發(fā)明得具體工藝為一. 原料處理蝦殼在使用前須經(jīng)過(guò)初歩的清洗除去灰塵雜物，經(jīng)過(guò)粗略的粉碎之后即可 加入質(zhì)量比為h l 3的水進(jìn)行預(yù)煮滅菌。加水量由蝦殼的干燥狀態(tài)決定。滅 菌可以采用巴氏殺菌。有條件的可以用蒸汽滅菌，條件為12rC， 20 30min。二. 發(fā)酵設(shè)備滅菌及菌種的活化 發(fā)酵設(shè)備在使用之前要徹底的清洗，并滅菌。菌種在接入發(fā)酵之前，應(yīng)從保存斜面上先接入活化培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為 滅菌后的蝦殼和無(wú)菌水。在37。C下，活化26 32h。以10~20%的接種量，接入 到滅好菌的蝦殼料中。三. 降解發(fā)酵降解過(guò)程中要保持通氧或振蕩，否則影響降解效率。以振蕩為例，裝液量 不應(yīng)超過(guò)40%，振蕩頻率為170r/min。降解時(shí)間為36 40h。四. 蛋白粉、甲殼素粗品及蝦青素的制備降解后的混合液體呈白色或粉色，經(jīng)3000 4000r/min的離心之后可以分離 出透明的黃色液體，以及紅色蟲(chóng)下殼降解物和白色菌體沉淀。 (1)蛋白粉的制備液體部分通過(guò)過(guò)濾滅菌或12rC， 20min的蒸汽滅菌后，高溫濃縮，并噴霧 干燥，可得到含鈣豐富的蝦殼蛋白粉?？梢杂糜陲暳匣蛭⑸锱囵B(yǎng)。(2) .甲殼素粗品與生物肥料的制備上述離心的沉淀用95%的乙醇，或石油醚乙醇=1: 5的混合溶劑，用與 原料蝦殼l: 1的質(zhì)量比進(jìn)行浸泡。1 3h后離心分離，分為沉淀部分和液體部 分，液體部分待提取蝦青素。沉淀部分分為上、下兩層下層為甲殼素粗品， 上層為菌體以及少量蛋白。通過(guò)40目篩網(wǎng)清洗，洗出物中為菌體以及少量蛋白， 烘干后可作為生物肥料，篩網(wǎng)上留下的部分烘干可作為生產(chǎn)甲殼素素的原料一 即甲殼素粗品。由于在降解過(guò)程中，蝦殼中的大量蛋白質(zhì)被除去，色素也在隨 后的提取工藝中被提出。用所剩粗品甲殼素來(lái)進(jìn)一步加工甲殼素或殼多糖以及 寡糖時(shí)，廢水中的蛋白殘留少，色度底，出品率高。(3) .蝦青素的提取在(2)步驟中離心分離的液體部分為蝦青素的有機(jī)溶液，將該有機(jī)溶液減壓蒸餾除有機(jī)溶劑(回收可再利用)。以真空度100kp下45 55。C的條件減壓蒸 餾為好。完畢后收集得粉紅或橘紅色蝦青素，具體顏色與原料和蝦青素濃度有 關(guān)。蝦青素產(chǎn)量根據(jù)原料不同為50 120)ig/g。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所具有的突出優(yōu)點(diǎn)為一.綜合利用好應(yīng)用微生物降解提取蝦殼中的蝦青素，在生產(chǎn)蟲(chóng)下青素的 同時(shí)，又能回收蛋白質(zhì)，剩余蝦殼殘?jiān)鼮榇制芳讱に?，菌體以及少量蛋白可作 為生物肥料，使蝦殼資源充分利用，達(dá)到"吃干榨盡"的地步。另外所產(chǎn)粗品甲殼 素作為提取甲殼素的原料，可以提高了甲殼素的產(chǎn)出率，降低了污染排放。二. 污染低，與傳統(tǒng)的提取蝦青素的方法相比。微生物降法省去了堿洗和 酸洗的步驟。減少了強(qiáng)酸、強(qiáng)堿廢水的排放，降低了對(duì)環(huán)境的污染。提取時(shí)采 用毒性較低的乙醇或乙醇與石油醚的混合溶劑，較已往采用氯仿、丙酮等有毒 溶劑更為安全。三. 成本低，微生物降解對(duì)于設(shè)備的要求較為簡(jiǎn)單，減少了設(shè)備成本。同 時(shí)所用微生物可以利用蝦殼為唯一營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，不須要外加其它培養(yǎng)基，與酶法 相比，減少了降解成本。生物處理替代了酸洗和堿洗，省去了酸堿的使用，降 低了原料成本。減少了處理排放的費(fèi)用。四. 效果好，研究表明使用微生物降解處理后，蝦殼中的蝦青素的提取率 要高于直接用酸堿處理。同時(shí)使用生物降解法對(duì)于蝦青素的破壞要小于酸堿處 理。


附圖為三種提取蝦青素的方法對(duì)提取物中類胡蘿卜素含量的對(duì)比圖。其中縱坐標(biāo)的Y代表提取物中類胡蘿卜素含量，單位是嗎/ml;橫坐標(biāo)X代表提取方法，其中的1為鹽酸丙酮法2.為微生物降解法3.為油溶法。
具體實(shí)施例方式實(shí)例l:將10g原料蝦殼粗粉碎至0.5-1.0cm后，以l: 2的質(zhì)量比加水。12rC蒸汽 滅菌20min。將活化26h的液態(tài)菌種以15%的比例接種，37。C下降解36h。 3800r/min離心10min。上清液于121°C， 20min蒸汽滅菌。100。C濃縮10min后， 在105。C下烘干，得蛋白粉0.7g。使用乙醇石油醚=1: 5的有機(jī)溶劑10ml從 下層沉淀提取蝦青素，lh后含有蝦青素的有機(jī)溶液在真空度100kp下45-55。C減 壓濃縮，得蝦青素0.58mg，有機(jī)溶劑回收。在40目的篩子上清洗降解后的蝦殼 和菌體沉淀，洗出物自然曬干后得生物肥料2g。剩余蝦殼殘?jiān)娓桑鳛樯a(chǎn) 甲殼素的原料。 實(shí)例2:原料，加水比同實(shí)例l。采用巴氏滅菌60。C， 30min。其它操作同實(shí)例1。 得蝦青素0.60mg，蛋白粉0.73g,生物肥料2.5g。 實(shí)例3:原料、加水及滅菌條件同實(shí)例l。菌種活化32h， 10%接種。降解時(shí)間40h， 提取溶劑采用95%乙醇，其他操作同實(shí)例l。得蝦青素0.53mg，蛋白粉0.77g， 生物肥料2.4g。 實(shí)例4:降解工藝同實(shí)例1 ，降解結(jié)束后以4000r/min離心分離。上清液121°C ， 20min 滅菌。100。C，15min濃縮后，75'C烘干。蝦青素的提取同實(shí)例1。得蝦青素0.54mg， 蛋白粉0.8g，生物肥料2g。 實(shí)例5:原料10g,以1:1的質(zhì)量比加水，降解工藝同實(shí)例1。降解結(jié)束后以4000r/min 離心分離。上清液115。C， 15min滅菌。100°C， 10min濃縮后，75。C烘干。蟲(chóng)下青 素在95%乙醇中浸泡3h后提取。其他操作同實(shí)例1。得蝦青素0.52g，蛋白粉 0.91g生物肥料1.8g。實(shí)例6:本發(fā)明與兩種提取蝦青素的傳統(tǒng)方法的提取效果比較使用同一批次，相同質(zhì)量的蝦殼，分別采用鹽酸酸化丙酮法、本發(fā)明的使用 微生物降解法與加熱油溶法三種方法提取蝦青素的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如附圖 所示與鹽酸酸化丙酮提取和加熱油溶的方式相比，本發(fā)明的使用微生物降解 發(fā)酵處理的提取效率較高。
權(quán)利要求
1.一種利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)以及甲殼素的方法，其特征在于是利用革蘭氏陰性桿菌鄰單胞桿菌(Plesiomonas)在37℃的條件下進(jìn)行降解發(fā)酵，降解物經(jīng)離心分離，液體經(jīng)濃縮、干燥得蛋白粉；固體用溶劑浸泡，再經(jīng)離心，液體經(jīng)除去溶劑得蝦青素；沉淀中下層為粗品甲殼素；沉淀中上層為菌體以及少量蛋白，用作生物肥料。
2.如權(quán)利要求1所述利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)以及甲殼素 的方法，其特征在于工藝步驟為-一. 原料處理蝦殼在經(jīng)清洗、粉碎后加入質(zhì)量比為1: 1 3的水進(jìn)行12TC下20 30min 蒸汽滅菌；二. 菌種的活化菌種在接入發(fā)酵之前，應(yīng)從保存斜面上接入活化培養(yǎng)基，在37。C下，活化 26~32h;三. 降解發(fā)酵以10~20%的接種量，接入到滅好菌的蝦殼料中，降解過(guò)程中要保持振蕩， 振蕩頻率為170r/min;降解時(shí)間為36 40h;四. 蛋白粉、甲殼素粗品及蝦青素的制備降解物經(jīng)3000 4000r/min的離心后分離出透明的黃色液體，以及紅色蝦殼 降解物和白色菌體沉淀；(1) 蛋白粉的制備液體部分通過(guò)過(guò)濾滅菌、濃縮，并噴霧干燥，可得到含鈣豐富的蝦殼蛋白粉；(2) .甲殼素粗品與生物肥料的制備 上述離心的沉淀用溶劑進(jìn)行浸泡，溶劑用量為與原料蝦殼l: l的質(zhì)量比，浸泡l 3h;所述溶劑為95%的乙醇；經(jīng)離心分離，液體部分待提取蝦青素；沉 淀部分分為上、下兩層下層為甲殼素粗品，上層為菌體以及少量蛋白；通過(guò) 40目篩網(wǎng)清洗，洗出物中為菌體以及少量蛋白，烘干后可作為生物肥料，篩網(wǎng) 上留下的部分烘干可作為生產(chǎn)甲殼素素的原料一即甲殼素粗品；(3).蝦青素的提取在(2)歩驟中離心分離的液體部分減壓蒸餾除有機(jī)溶劑，得粉紅或橘紅色 蝦青素。
3.如權(quán)利要求2所述利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)以及甲殼素 的方法，其特征在于其工藝步驟一中，滅菌可以采用巴氏殺菌。
4. 如權(quán)利要求2所述利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)以及甲殼素的方法，其特征在于其工藝步驟二的菌種的活化中培養(yǎng)基成分為滅菌后的蝦殼和無(wú)菌水。
5. 如權(quán)利要求2所述利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)以及甲殼素的方法，其特征在于其工藝步驟三的降解發(fā)酵中保持通氧。
6. 如權(quán)利要求2所述利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)以及甲殼素 的方法，其特征在于其工藝步驟四的蛋白粉、甲殼素粗品及蝦青素的制備中， 所述蛋白粉制備時(shí)液體滅菌采用121°C， 20min的蒸汽滅菌。
7. 如權(quán)利要求2所述利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)以及甲殼素 的方法，其特征在于其工藝步驟四的甲殼素粗品與生物肥料的制備中所述的溶 劑浸泡的溶劑為石油醚乙醇=1: 5的混合溶劑。
8. 如權(quán)利要求2所述利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)以及甲殼素 的方法，其特征在于其工藝步驟四的蝦青素的提取中所述液體部分減壓蒸餾除 有機(jī)溶劑，其真空度為100kp下45 55。C。
全文摘要
一種利用微生物從蝦殼中提取蝦青素、蛋白質(zhì)以及甲殼素的方法，是利用革蘭氏陰性桿菌鄰單胞桿菌(Plesiomonas)在37℃的條件下進(jìn)行降解發(fā)酵，降解物經(jīng)離心分離，液體經(jīng)濃縮、干燥得蛋白粉；固體用溶劑浸泡，再經(jīng)離心，液體經(jīng)除去溶劑得蝦青素；沉淀中下層為粗品甲殼素；沉淀中上層為菌體以及少量蛋白，用作生物肥料。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明所具有的突出優(yōu)點(diǎn)為綜合利用好應(yīng)用微生物降解提取蝦殼中的蝦青素，回收蛋白質(zhì)和粗品甲殼素，菌體以及少量蛋白可作為生物肥料，使蝦殼資源充分利用，達(dá)到“吃干榨盡”的地步。同時(shí)發(fā)明的污染低、成本低、效果好。
文檔編號(hào)C12P23/00GK101215595SQ200710159248
公開(kāi)日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2007年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者葉淑紅, 王際輝, 辛丘巖, 高世偉 申請(qǐng)人:大連工業(yè)大學(xué)