專利名稱：新的修飾的核酸序列以及增加細(xì)胞系統(tǒng)中mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及異源基因表達(dá)。更具體地，本發(fā)明涉及在較高等的真核細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)微生物或寄生生物的基因。相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)綜述在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或體內(nèi)重組生產(chǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行某種異源基因產(chǎn)物的重組生產(chǎn)通常是困難的。例如，許多研究人員發(fā)現(xiàn)，在與蛋白質(zhì)原始來(lái)源的細(xì)胞不同的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中難以表達(dá)來(lái)自細(xì)菌、寄生生物和病毒的蛋白質(zhì)。難以由哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的醫(yī)療上重要蛋白質(zhì)的一個(gè)例子是瘧原蟲(chóng)裂殖子表面蛋白(malaria merozoite surface protein)(MSP-1)。
瘧疾在熱帶國(guó)家是嚴(yán)重的健康問(wèn)題。對(duì)現(xiàn)存藥物的抗性迅速發(fā)展，因而急需疫苗。在惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)生長(zhǎng)周期中表達(dá)的多種抗原中，MSP-1是研究最深入的并且看來(lái)是最成功的接種候選物。暴露于惡性瘧原蟲(chóng)的個(gè)體產(chǎn)生抗MSP-1抗體，研究表明在對(duì)MSP-1的天然獲得性免疫反應(yīng)和減低的瘧疾發(fā)病率之間有相關(guān)性。在一系列研究中，用純化的天然MSP-1或該蛋白的重組片段免疫可以誘導(dǎo)至少部分對(duì)該寄生生物的防護(hù)(Diggs等，(1993)Parasitol Today 9300-302)。因此MSP-1是開(kāi)發(fā)抗惡性瘧原蟲(chóng)疫苗的重要靶。
MSP-1是一種190-220kDA的糖蛋白。C-末端區(qū)域已經(jīng)是可用作疫苗的重組產(chǎn)物的焦點(diǎn)。然而，開(kāi)發(fā)MSP-1用作疫苗的一個(gè)主要問(wèn)題是在細(xì)菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)難以獲得與親和純化的天然蛋白質(zhì)具有同等免疫學(xué)能力的重組蛋白(Chang等，(1992)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)148548-555)以及使疫苗生產(chǎn)可行的足夠量的重組蛋白。
改進(jìn)的方法是有利的，它能夠增強(qiáng)以前難以重組表達(dá)的來(lái)自寄生生物、細(xì)菌和病毒的蛋白質(zhì)的足夠量的表達(dá)。特別是，一種能夠表達(dá)足夠量MSP-1的重組系統(tǒng)是特別有利的。
本發(fā)明的概述本發(fā)明提供了改進(jìn)的重組DNA成分和增加蛋白質(zhì)的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，這里的蛋白質(zhì)是來(lái)自異源細(xì)胞的，優(yōu)選是諸如細(xì)菌、病毒和寄生生物等低等生物的，且以前在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中難以表達(dá)的蛋白質(zhì)。適于依據(jù)本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的優(yōu)選蛋白候選物是那些具有相對(duì)重組表達(dá)系統(tǒng)而言含高總AT量或富AT區(qū)域和/或mRNA不穩(wěn)定基序和/或稀有密碼子的DNA編碼序列的蛋白質(zhì)。
第一個(gè)方面，本發(fā)明特征是一種修飾的已知核酸，優(yōu)選的是能在一種系統(tǒng)中表達(dá)的來(lái)自細(xì)菌、病毒或寄生生物的一個(gè)基因，其中的修飾包括相對(duì)未修飾序列有降低的AT含量，并且可任選的進(jìn)一步包括消除至少一種或全部在天然基因中存在的mRNA不穩(wěn)定基序。在特定優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾進(jìn)一步包括用細(xì)胞系統(tǒng)的優(yōu)選密碼子置換天然基因的一個(gè)或多個(gè)密碼子。
第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的修飾的核酸的方法，包括降低編碼蛋白質(zhì)的天然基因的總AT含量和/或消除mRNA不穩(wěn)定基序中的至少一個(gè)或全部和/或使用選擇的細(xì)胞系統(tǒng)的優(yōu)選密碼子置換一個(gè)或多個(gè)密碼子(均采用選擇的細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別的、優(yōu)選地為選擇的細(xì)胞系優(yōu)選的并且編碼與所置換的密碼子相同的氨基酸的密碼子來(lái)置換天然基因中的一個(gè)或多個(gè)密碼子)。本發(fā)明的這一方面進(jìn)一步包括依據(jù)本發(fā)明方法制備的修飾的核酸。
第三個(gè)方面，本發(fā)明亦提供了含有本發(fā)明核酸和在選擇的細(xì)胞系或生物體中有活性的啟動(dòng)子的載體，以及用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了，用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因泌乳動(dòng)物(lactatinganimal)的含有本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體以及其種系含有本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因非人泌乳動(dòng)物。
第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的泌乳動(dòng)物物種的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，包括本發(fā)明核酸和操作地偶聯(lián)到該核酸上的指導(dǎo)乳腺將該核酸編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中的啟動(dòng)子。
第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有依據(jù)本發(fā)明的修飾的核酸的DNA疫苗。本發(fā)明這一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括依據(jù)本發(fā)明的修飾的MSP-1基因的片段。
附圖的說(shuō)明

圖1描繪了依據(jù)本發(fā)明修飾的MSP-142的cDNA序列[序列1]，其中置換了306個(gè)核苷酸以降低AT含量并消除了mRNA不穩(wěn)定基序同時(shí)保持MSP-142的相同蛋白質(zhì)氨基酸序列。大寫(xiě)字母表示核苷酸置換。
圖2描繪了編碼“野生型”或天然MSP-142序列的核苷酸序列[序列2]。
圖3a是野生型MSP-142(在表中命名為“MSP-1 wt”)和新修飾的MSP-142基因(在表中命名為“編輯的MSP”)以及幾種乳蛋白質(zhì)基因(來(lái)自山羊和小鼠的酪蛋白基因)的密碼子使用表。每一欄中的數(shù)目表示在列出的各基因中特定密碼子出現(xiàn)的實(shí)際次數(shù)。新的MSP-142合成基因是通過(guò)首先選擇給定氨基酸的富GC密碼子結(jié)合選擇在乳蛋白中最常使用的氨基酸從乳房特異密碼子用法中產(chǎn)生的。
圖3b是比較亦如圖3a所示的每一密碼子在野生型MSP-142(在表中命名為“MSP-1 wt”)和新修飾的MSP-142基因(在表中命名為“編輯的MSP”)中的出現(xiàn)次數(shù)的密碼子用法表。圖3b中的表亦將每一密碼子在野生型MSP-142和新修飾的MSP-142基因中的出現(xiàn)頻率與每一密碼子在大腸桿菌基因和人基因中的出現(xiàn)頻率進(jìn)行了比較。從而，如果表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌細(xì)胞，此表可用于確定大腸桿菌識(shí)別或優(yōu)選的密碼子。
圖4a-c分別描繪了如實(shí)施例中所述的MSP-142構(gòu)建體GTC479，GTC564和GTC627。
圖5A欄是Northern檢測(cè)，其中構(gòu)建體GTC627含有依據(jù)本發(fā)明修飾的新MSP-142基因，GTC479是含有天然MSP-142基因的構(gòu)建體，而構(gòu)建體GTC469是陰性對(duì)照DNA。
圖5B欄是親和純化后洗脫組分的Western檢測(cè)。數(shù)字是收獲的級(jí)分。結(jié)果表明來(lái)自修飾的MSP-142合成基因構(gòu)建體GTC679的級(jí)分與MSP-1多克隆抗體反應(yīng)而陰性對(duì)照GTC479則不反應(yīng)。
圖6描繪了實(shí)施例中所述的OT1[序列3]、OT2[序列4]、MSP-8[序列5]、MSP2[序列6]、MSP-1[序列7]的核酸序列。
圖7圖示質(zhì)粒BC574。
圖8圖示BC620。
圖9圖示BC670。
圖10圖示轉(zhuǎn)基因乳汁中的MSP的Westen印跡。
圖11圖示MSP42-2的核苷酸序列[序列8]。
圖12圖示BC-718。
圖13圖示在轉(zhuǎn)基因乳汁中BC718表達(dá)的Westen印跡。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本專利和此處引用的科學(xué)文獻(xiàn)建立了本技術(shù)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可利用的知識(shí)。頒布的美國(guó)專利、允許的申請(qǐng)、公開(kāi)的國(guó)外申請(qǐng)以及此處引用的文獻(xiàn)，通過(guò)參考文獻(xiàn)形式并于本發(fā)明。解決這些文獻(xiàn)和本公開(kāi)之間的任何沖突均以本發(fā)明為準(zhǔn)。
本發(fā)明提供了修飾的重組核酸序列(優(yōu)選的是DNA)以及增加蛋白質(zhì)的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，這里的蛋白質(zhì)是已知或很可能在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中難以表達(dá)的蛋白質(zhì)。使用本發(fā)明重組技術(shù)表達(dá)的優(yōu)選的“困難”蛋白質(zhì)候選物是從優(yōu)選地諸如寄生生物、細(xì)菌和病毒等低等生物的異源細(xì)胞衍生的蛋白質(zhì)。它們的DNA編碼序列相對(duì)使用的重組表達(dá)系統(tǒng)而言含有高的總AT含量或富AT區(qū)和/或mRNA不穩(wěn)定基序和/或稀有密碼子。
第一個(gè)方面，本發(fā)明的特征是一種修飾的已知核酸，優(yōu)選的是能在一種細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的來(lái)自細(xì)菌、病毒或寄生生物的一個(gè)基因，其中的修飾包括相對(duì)未修飾序列有降低的AT含量，并且可任選的進(jìn)一步包括消除至少一種或全部在天然基因中存在的mRNA不穩(wěn)定基序?！凹?xì)胞系統(tǒng)”包括細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、組織培養(yǎng)系統(tǒng)、器官培養(yǎng)系統(tǒng)和活體動(dòng)物的組織。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾進(jìn)一步包括用細(xì)胞系統(tǒng)的優(yōu)選密碼子置換天然基因的一個(gè)或多個(gè)密碼子。這些特征中的每一個(gè)均是通過(guò)用細(xì)胞系統(tǒng)可識(shí)別的并優(yōu)選地是其偏愛(ài)的且與被置換的天然基因中密碼子編碼相同氨基酸的密碼子來(lái)替代天然基因中的一個(gè)或多個(gè)密碼子實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明，這種“沉默”核苷酸和密碼子置換將足以達(dá)到降低AT含量和/或消除mRNA不穩(wěn)定基序和/或減少稀有密碼子數(shù)目同時(shí)保持并優(yōu)選的改善細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生mRNA和表達(dá)所需蛋白能力的目的。
本發(fā)明亦包括那些在適當(dāng)?shù)膰?yán)緊條件下與本發(fā)明修飾核酸序列特異性同源的序列，特別排除改進(jìn)的核酸從其衍生的已知核酸。如果同源性足以使一個(gè)序列與另一個(gè)序列的準(zhǔn)確互補(bǔ)序列雜交，則這個(gè)序列與另一個(gè)序列“特異性”同源。如果在體內(nèi)或離子強(qiáng)度接近生理?xiàng)l件的條件下，例如140mM NaCl、5mM MgCl2的條件下能夠雜交形成Waston-Crick或Hoogsteen堿基對(duì)，則一個(gè)序列與另一個(gè)序列“特異性雜交”。優(yōu)選的，在嚴(yán)緊條件下，例如在68℃ 0.2X SSC條件下保持這種特異性雜交。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中能夠以天然基因在相同條件下(即相同的細(xì)胞類型，相同的培養(yǎng)條件，相同的表達(dá)載體)于體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)量的至少25％，優(yōu)選的是50％，更優(yōu)選的至少為100％或更高的水平表達(dá)蛋白質(zhì)。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)的mRNA轉(zhuǎn)錄?？赏ㄟ^(guò)本技術(shù)領(lǐng)域已知的一系列技術(shù)測(cè)定表達(dá)，包括使用對(duì)目的蛋白特異的抗體?！疤烊换颉被颉白匀换颉笔侵妇幋a野生型蛋白質(zhì)的和作為修飾的核酸來(lái)源的基因序列或其片段(包括天然出現(xiàn)的等位基因變異)。“偏愛(ài)(優(yōu)選)密碼子”是指選擇的細(xì)胞系統(tǒng)更普遍使用的密碼子。并非所有在此描述的密碼子改變都是變成偏愛(ài)密碼子，只需置換的密碼子至少能被細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別。此處使用的術(shù)語(yǔ)“減少的AT含量”是指由于在不改變靶蛋白的氨基酸序列的前提下使用選擇的細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別的核苷酸或密碼子置換含A或T的核苷酸位點(diǎn)或含A和/或T的密碼子而比天然基因具有較低的含A(腺嘌呤)或T(胸腺嘧啶)堿基的核苷酸的總百分?jǐn)?shù)。此處使用的“異源的”是指來(lái)自與其導(dǎo)入的種不同種的遺傳物質(zhì)，或者從這種遺傳物質(zhì)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的特別優(yōu)選的細(xì)胞系統(tǒng)包括諸如COS細(xì)胞和CHO細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，特別是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳房組織。然而，本發(fā)明亦考慮了細(xì)菌、酵母、大腸桿菌和諸如桿狀病毒的病毒表達(dá)系統(tǒng)甚至植物系統(tǒng)。
第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備修飾的核酸的方法，包括降低編碼蛋白質(zhì)的天然基因的總AT含量和/或消除至少一個(gè)或所有mRNA不穩(wěn)定基序和/或使用選擇的細(xì)胞系統(tǒng)的偏愛(ài)密碼子置換一個(gè)或多個(gè)密碼子(均采用選擇的細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別的、優(yōu)選地為偏愛(ài)的并且編碼與所置換的密碼子同樣的氨基酸的密碼子來(lái)置換天然基因中的一個(gè)或多個(gè)密碼子)。描述重組DNA技術(shù)的一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考書(shū)包括Watson，J.D.等，基因的分子生物學(xué)(Molecular Biology of the Gene)卷I和卷II，the Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.publisher，Menlo Park，CA(1987)Darnell，J.E.等，分子細(xì)胞生物學(xué)(MolecularCell Biology)，Scientific American Books，Inc.，Publisher，NewYork，NY(1986)；Old，R.V.等，基因操作原理基因工程入門(mén)(Principle of Gene ManipulationAn Introduction to GeneticEngineering)，第二版，University of California Press，publisher，Berkeley CA(1981)；Maniatis，T.等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory)，publisher，冷泉港(Cold SpringHarbor)，NY(1989)和分子生物學(xué)通用流程(Current Protocols inMolecular Biology)，Ausubel等，Viley Press，New York，NY(1992)。本發(fā)明的這一方面進(jìn)一步包括依據(jù)本發(fā)明方法制備的修飾的核酸。
不局限于任何原理，以前的研究表明GM-CSF mRNA的3’非翻譯區(qū)的一段保守AU序列(AUUUA)介導(dǎo)選擇性mRNA降解(Shaw，G.和Kamen，R.細(xì)胞(Cell)46659-667)。過(guò)去的焦點(diǎn)在于基因非翻譯區(qū)的這些不穩(wěn)定基序的存在。本發(fā)明是第一個(gè)意識(shí)到消除基因編碼區(qū)的不穩(wěn)定序列的益處。
第三個(gè)方面，本發(fā)明亦提供了含有本發(fā)明核酸和在選擇的細(xì)胞系或生物體中有活性的啟動(dòng)子的載體，以及用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的載體含有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，因而在一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞類型中可復(fù)制。某些優(yōu)選的載體是表達(dá)載體，進(jìn)一步具有至少一個(gè)啟動(dòng)子和被動(dòng)終止子，從而使重組表達(dá)元件可以在細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。
第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因泌乳動(dòng)物的含有本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體以及其種系含有本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因非人泌乳動(dòng)物。這種轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體含有能夠使其作為宿主轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因組一部分來(lái)表達(dá)的啟動(dòng)子。本技術(shù)領(lǐng)域已知產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般原理。參看例如Hogan et al.，小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Manipulatingthe Mouse EmbryoA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold SpringHarbor Laboratory)，(1986)；Simons et al，Bio/Technology 6179-183，(1988)；Wall et al.，Biol.Reprod.32645-651，(1985)；Buhler et al.，Bio/Technology 8140-143(1990)；Ebert et al.，Bio/Technology 9835-838(1991)；Krimenfort et al.，Bio/Technology 9844-847(1991)；Wall et al.，細(xì)胞生物化學(xué)雜志(J.Cell.Biochem.)49113-120(1992)。將外源DNA序列導(dǎo)入哺乳動(dòng)物及其生殖細(xì)胞的技術(shù)最初是在小鼠中開(kāi)發(fā)的。參看例如，Gordon et al.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)777380-7384，(1980)；Gordon and Ruddle科學(xué)(Science)2141244-1246(1981)；Palmiter and Brinster，細(xì)胞(Cell)41343-345，1985；Brinster et al.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)824438-4442(1985)and Hogan et al.(出處如上)。隨后將這些技術(shù)改進(jìn)為用于大型動(dòng)物包括牛和羊。直至最近，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠或家畜的最廣泛應(yīng)用的方法是將感興趣的上百個(gè)線性DNA分子以轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體的形式注射到受精卵的一個(gè)前核。將DNA注射到受精卵的細(xì)胞質(zhì)亦有廣泛應(yīng)用。最近，能夠注射到未受精卵的完整轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的克隆已獲得成功(KHS Campbell et al.，自然(Nature)380 64-66，(1996))。
第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明核酸和可操作偶聯(lián)到核酸上的指導(dǎo)乳腺將核酸編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因泌乳期動(dòng)物物種。乳腺表達(dá)系統(tǒng)具有高表達(dá)水平、低成本、正確加工和可及性的優(yōu)點(diǎn)。多名研究人員已經(jīng)在泌乳轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生了已知蛋白質(zhì)，諸如牛和人α-乳清蛋白。(Wright et al.，Bio/technology 9830；834(1991)；Vilotte et al，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)，18643-48(1989)；Kochiet al.，Mol Reprod. And Devel.33160-164(1992)；Soulier et al.，F(xiàn)EBS Letters 297(1，2)13-18(1992))，并且該系統(tǒng)顯示可以產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的啟動(dòng)子在乳房組織中是有活性的。特別有用的是在編碼乳汁特異性蛋白質(zhì)的基因諸如乳房組織中發(fā)現(xiàn)的基因中有特異活性的，即在合成乳汁的生理?xiàng)l件下在乳腺組織中的活性強(qiáng)于其它組織中的啟動(dòng)子。最優(yōu)選的是既對(duì)乳房組織特異又高效的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子中優(yōu)選的是酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白(lactalglobulin)啟動(dòng)子，包括但不限于α-、β-和γ-酪蛋白啟動(dòng)子和α-乳清蛋白以及β-乳球蛋白啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子來(lái)自嚙齒動(dòng)物，山羊和牛。其它的啟動(dòng)子包括調(diào)節(jié)乳清酸性蛋白質(zhì)(WAP)基因的啟動(dòng)子等。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案提供了能夠在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中表達(dá)的編碼MSP-1或其片段的修飾核酸。依據(jù)本發(fā)明修飾了編碼天然MSP-1基因的核酸序列。首先通過(guò)使用編碼相同氨基酸的但與天然MSP-1基因或基因片段相比足以降低修飾的核酸中AT含量的選擇的細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別的并優(yōu)選是其偏愛(ài)的密碼子置換天然基因中的密碼子來(lái)降低總AT含量。其次通過(guò)使用編碼相同氨基酸的但足以消除mRNA不穩(wěn)定基序的選擇的細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別的并優(yōu)選是其偏愛(ài)的密碼子置換天然基因中的密碼子消除了天然基因或基因片段中的mRNA不穩(wěn)定基序(AUUUA，Shaw and Kamen，在前面)。任選地，天然基因中的任何其它密碼子均可用所說(shuō)的選擇的表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)選的密碼子置換。
第六個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有依據(jù)本發(fā)明的修飾核酸的DNA疫苗。在特定優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA疫苗含有依據(jù)本發(fā)明的載體。本發(fā)明的DNA疫苗可能是依據(jù)本發(fā)明的“裸”的或純化的修飾核酸，可能或可能不與啟動(dòng)子可操作地連接。如果核酸與啟動(dòng)子連接的方式使核酸序列表達(dá)，即為核酸與啟動(dòng)子可操作連接。這種DNA疫苗可以不進(jìn)行膠囊化給藥，或可作為脂質(zhì)體的部分給藥，或作為病毒基因組的部分給藥。通常以足夠使核酸表達(dá)并在接受DNA疫苗的動(dòng)物體包括人體誘發(fā)抗體反應(yīng)的量使用這種疫苗。隨后至少在第一次給藥后一星期之后可再次給藥增強(qiáng)抗體反應(yīng)。優(yōu)選的給藥途徑包括經(jīng)粘膜以及腸胃外給藥。
本發(fā)明這一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案包括依據(jù)本發(fā)明的修飾的MSP-1基因的片段。這種片段優(yōu)選的包括大約5％至大約100％的全基因序列并含有依據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)修飾。
圖3b圖示了大腸桿菌和人的密碼子使用的例子。圖3b顯示了MSP-1天然基因和依據(jù)本發(fā)明的修飾的基因的密碼子使用頻率并將其密碼子使用頻率與大腸桿菌和人基因的進(jìn)行了比較。本技術(shù)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員很容易得到和知道諸如酵母、桿狀病毒和哺乳動(dòng)物系統(tǒng)等多種其他表達(dá)系統(tǒng)的密碼子使用頻率表。
下面的實(shí)施例說(shuō)明了實(shí)施本發(fā)明的某些優(yōu)選方式，但并非為了限制本發(fā)明的范圍，因?yàn)榭梢允褂锰娲姆椒ǐ@得類似的結(jié)果。
實(shí)施例制造新的修飾的MSP-142基因在一種實(shí)施方案中，提供了編碼MSP-1 C-末端片段的新的修飾的核酸。圖1顯示了能夠在本發(fā)明哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的編碼MSP-142kD C-末端部分(MSP-142)的本發(fā)明新的修飾的核酸。天然MSP-142基因(圖2)不能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)。對(duì)天然MSP-142基因的分析表明其多種特征與哺乳動(dòng)物有區(qū)別。首先，它有高達(dá)76％的總AT含量。其次，在此1100 bp的DNA片段(圖2)中，mRNA不穩(wěn)定基序AUUUA出現(xiàn)10次。為了針對(duì)這些區(qū)別，設(shè)計(jì)了新的MSP-142基因。向天然MSP-142基因的306個(gè)位點(diǎn)引入了沉默核苷酸置換將總AT含量降至49.7％。同樣經(jīng)過(guò)密碼子用法的改變消除了天然基因中的10個(gè)AUUUA mRNA不穩(wěn)定基序。為了改變密碼子用法，使用多種小鼠和山羊乳房特異蛋白質(zhì)制出了乳房組織特異性密碼子使用表圖3a。將該表用于指導(dǎo)如上所述修飾的MSP-142基因的密碼子用法選擇。例如圖3a中的表中所示，在天然基因中，65％(25/38)的亮氨酸由TTA編碼，它在乳腺中是稀有密碼子。在修飾的MSP-142基因中，100％的亮氨酸由CTG編碼，它是乳腺中亮氨酸的優(yōu)選密碼子。
使用修飾的MSP-142基因構(gòu)建表達(dá)載體，其通過(guò)將山羊β-酪蛋白的前端26個(gè)氨基酸融合到修飾的MSP-142基因的N-末端和將攜帶融合基因的SalI-Xho I片段亞克隆到表達(dá)載體pCDNA3的XhoI位點(diǎn)而進(jìn)行的。將His6標(biāo)記融合到MSP-142基因的3’末端使基因產(chǎn)物能夠親和純化。這樣制備了質(zhì)粒GTC627(圖4c)。
為了比較天然MSP-142基因構(gòu)建體和本發(fā)明修飾的MSP-142核酸，亦構(gòu)建了天然MSP-142基因的表達(dá)載體并將該基因加到哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物和注射到小鼠中形成轉(zhuǎn)基因小鼠，如下所述構(gòu)建天然MSP-142表達(dá)載體為了分泌截短的惡性瘧原蟲(chóng)裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)，將編碼MSP-1 42kD C-末端部分(MSP-142)的野生型基因融合到編碼山羊β-酪蛋白的前15或前25個(gè)氨基酸的DNA序列中。這是通過(guò)首先用引物MSP1和MSP2(圖6)PCR擴(kuò)增MSP-1質(zhì)粒(來(lái)自Dr.David Kaslow，NIH)，然后將PCR產(chǎn)物克隆到TA載體(Invitrogen)獲得的。將PCR產(chǎn)物的BglII-XhoI片段與寡聚物OT1和OT2(圖6)連接進(jìn)入表達(dá)載體pCDNA3。這樣產(chǎn)生了質(zhì)粒GTC564(圖4b)，它編碼15個(gè)氨基酸的β-酪蛋白信號(hào)肽和成熟山羊β-酪蛋白的前11個(gè)氨基酸，隨后是天然MSP-142基因。使用寡聚物MSP-8和MSP-2(圖6)通過(guò)PCR擴(kuò)增MSP-1質(zhì)粒，然后將產(chǎn)物克隆到TA載體。切下XhoI片段并克隆到表達(dá)載體pCDNA3的XhoI位點(diǎn)產(chǎn)生質(zhì)粒GTC479(圖4a)，它編碼融合到野生型MSP-142基因的15個(gè)氨基酸的山羊β-酪蛋白信號(hào)肽。在GTC564和GTC479中的MSP-142基因3’末端加上了組氨酸6(His6)標(biāo)記。
在COS-7細(xì)胞中未表達(dá)天然MSP-142基因通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染檢測(cè)測(cè)定了培養(yǎng)的COS-7細(xì)胞中天然MSP基因的表達(dá)。按照廠商手冊(cè)使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco-BRL)將GTC479和GTC564質(zhì)粒DNA導(dǎo)入COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染兩天后從COS細(xì)胞分離總細(xì)胞RNA。轉(zhuǎn)染兩天后通過(guò)將35S甲硫氨酸加入培養(yǎng)物中代謝標(biāo)記新合成的蛋白質(zhì)10個(gè)小時(shí)。
為了測(cè)定COS細(xì)胞中的MSP mRNA表達(dá)，用來(lái)自GTC479的32P標(biāo)記DNA片段探測(cè)Northern印跡。在GTC479或GTC564轉(zhuǎn)染體中未測(cè)到MSP RNA(未發(fā)表資料)。延長(zhǎng)的曝光揭示有殘余水平的降解的MSPmRNA。用抗MSP的多克隆抗體免疫沉淀35S標(biāo)記的培養(yǎng)物上清和裂解物。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示GTC479或GTC564轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解物或上清中沒(méi)有表達(dá)(未發(fā)表資料)。這些結(jié)果顯示天然MSP-1未在COS細(xì)胞中表達(dá)。
在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中沒(méi)有天然MSP-142基因的表達(dá)將編碼15個(gè)氨基酸的山羊β-酪蛋白信號(hào)肽，山羊β-酪蛋白的前11個(gè)氨基酸以及天然MSP-142基因的GTC479 SalI-XhoI片段克隆到載體BC350中表達(dá)的β-酪蛋白XhoI位點(diǎn)。這樣產(chǎn)生質(zhì)粒BC574(圖7)。將BC574的SalI-NotI片段注射到小鼠胚胎產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。建立了15個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因小鼠。收集雌性建立者小鼠的乳汁并使用抗MSP多克隆抗體進(jìn)行Western檢測(cè)。檢測(cè)的7個(gè)小鼠乳汁中均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)MSP-142蛋白質(zhì)。為了進(jìn)一步確定在乳腺是否有MSP-142的mRNA表達(dá)，從第11天的泌乳轉(zhuǎn)基因小鼠提取總RNA并進(jìn)行Northern印跡檢測(cè)。檢測(cè)的任何一個(gè)BC574株系均未測(cè)到MSP-142mRNA。因而，MSP-142轉(zhuǎn)基因未在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺中表達(dá)。總的來(lái)說(shuō)，這些實(shí)驗(yàn)提示天然寄生生物的MSP-142基因不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其阻斷是mRNA豐度的水平的。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MSP的表達(dá)進(jìn)行了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)本發(fā)明修飾的MSP-142基因在COS細(xì)胞中的表達(dá)。將GTC627和GTC479的DNA導(dǎo)入COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)分離總RNA進(jìn)行Northern檢測(cè)。用32P標(biāo)記GTC627的SalI-XhoI片段探測(cè)固定化RNA。觀察到GTC479和GTC627的顯著不同。如前面顯示，GTC479轉(zhuǎn)染細(xì)胞中未檢測(cè)到MSP-142mRNA，而在GTC627中表達(dá)了豐富的MSP-142mRNA(圖5，A欄)。GTC469用作陰性對(duì)照并且含有克隆到商品化克隆載體PU19的GTC564的插入片段。使用35S甲硫氨酸的代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)以及隨后的使用抗MSP的多克隆抗體(由NIH的D.Kaslow NIAID提供)的免疫沉淀顯示轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞合成了MSP-142蛋白質(zhì)(圖5，B欄)。而且，在轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞上清中檢測(cè)到MSP-142，表明MSP-142蛋白質(zhì)亦分泌出來(lái)。此外，使用Ni-NTA柱，從GTC627轉(zhuǎn)染的COS上清中親和純化了MSP-142。
這些結(jié)果證明寄生性MSP-142基因的修飾導(dǎo)致MSP mRNA在COS細(xì)胞中表達(dá)。隨后，哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成和分泌MSP-142產(chǎn)物。
亦可使用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法制備本實(shí)驗(yàn)中使用的多克隆抗體(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(AntibodiesA Laboratory Manual)，Ed Harlowand David Lane，eds.冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring HarborLaboratory)，publishers(1988))。MSP血清抗體的產(chǎn)生亦描述于Chang et al.，感染和免疫(Infection and Immunity)(1996)64253-261 and Chang et al.，(1992)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(ProcNatl.Acad.Sci.USA)866343-6347。
這些檢測(cè)表明與根本不表達(dá)的天然蛋白質(zhì)相比，本發(fā)明的修飾的MSP-142核酸可以高水平表達(dá)。這些結(jié)果代表了降低基因中的AT％導(dǎo)致MSP基因在異源系統(tǒng)中表達(dá)的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，同時(shí)代表了從MSP編碼區(qū)消除AUUUA mRNA不穩(wěn)定基序?qū)е翸SP蛋白質(zhì)在COS細(xì)胞中表達(dá)的第一個(gè)證據(jù)。
這樣，此處給出的資料提示某些因?yàn)槠涓逜/T含量和/或存在不穩(wěn)定基序，和/或使用了選擇的細(xì)胞系統(tǒng)不識(shí)別的稀有密碼子而難以在細(xì)胞培養(yǎng)物或轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中表達(dá)的異源蛋白質(zhì)可以借助該系統(tǒng)的密碼子用法表進(jìn)行工程改造使它們能在任何給定的系統(tǒng)中表達(dá)。本發(fā)明第一次表明為了消除造成導(dǎo)致低RNA水平或無(wú)RNA的降解的懷疑序列的目的進(jìn)行DNA序列的修飾。圖5A欄Northern的結(jié)果(即天然基因無(wú)RNA而本發(fā)明的修飾的DNA序列有合理的水平的RNA)很可能解釋了蛋白質(zhì)產(chǎn)生的增加。
下面的實(shí)施例描述了MSP1-42作為天然未融合(并且未糖基化)蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的表達(dá)。
MSP轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建為了將MSP1-42與15個(gè)氨基酸的β-酪蛋白信號(hào)肽融合，將編碼15個(gè)氨基酸酪蛋白信號(hào)和結(jié)束于Cla I位點(diǎn)的MSP1-42的前5個(gè)氨基酸的寡聚物對(duì)MSP203和MSP204(MSP203ggccgctcgacgccaccatgaaggtcctcataattgcctgtctggtggctctggccattgcagccgtcactccctccgtcat.MSP204cgatgacggagggagtgacggctgcaatggccagagccaccagacaggcaattatgaggaccttcatggtggcgtcgagc)與編碼其余的MSP1-42基因的BC620的CLA I-Xho I片段(圖8)連接進(jìn)入表達(dá)載體pCDNA3的Xho I位點(diǎn)。然后將這個(gè)質(zhì)粒(GTC669)的Xho I片段克隆到乳汁特異性表達(dá)載體BC350的Xho I位點(diǎn)產(chǎn)生B670(圖9)。
MSP1-42在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的表達(dá)從質(zhì)粒BC670制備Sal I-Not I片段并微注射到小鼠胚胎產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。通過(guò)從尾巴活組織檢查提取小鼠DNA隨后使用寡聚物GTC17和MSP101(寡聚物的序列GTC17，GATTG ACAAG TAATA CGCTGTTTCC TC寡聚物MSP101，GGATTCAATAGATACGG)進(jìn)行PCR檢測(cè)確認(rèn)轉(zhuǎn)基因小鼠。在哺乳第7和9天收集雌性建立者轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁，并使用多克隆抗-MSP抗體和單克隆抗MSP抗體5.2(Dr.David Kaslow，NIH)通過(guò)western檢測(cè)確定MSP-1-42的表達(dá)水平。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中MSP1-42的表達(dá)水平是1-2毫克/毫升(圖10)。
構(gòu)建MSP1-42糖基化位點(diǎn)負(fù)突變體我們對(duì)乳汁產(chǎn)生的MSP檢測(cè)揭示轉(zhuǎn)基因MSP蛋白質(zhì)是N-糖基化的。為了消除MSP1-42基因中的N-糖基化位點(diǎn)，用谷氨酰胺(Q)取代了181和262位點(diǎn)的天冬酰胺(N)。通過(guò)設(shè)計(jì)與MSP1相應(yīng)區(qū)域退火的攜帶AAC到CAG突變的DNA寡聚物導(dǎo)入了置換。然后將這些寡聚物用作PCR引物產(chǎn)生編碼N到Q置換的DNA片段。
為了導(dǎo)入N262-Q突變，使用一對(duì)寡聚物MSPGYLYCO-3(CAGGGAATGCTGCAGATC AGC)和MSP42-2(AATTCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCGCAGAAAATAC CATG圖11)PCR擴(kuò)增含有合成的MSP 1-42基因的質(zhì)粒GTC627。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1載體。這樣產(chǎn)生了質(zhì)粒GTC716。
為了導(dǎo)入N181-Q突變，使用寡聚物MSPGLYCO-1(CTCCTTGTTCAGGAACTTGTAG GG)和MSPGLCO-2(GTCCTGCAGTACACATATGAG圖4)PCR擴(kuò)增質(zhì)粒GTC627。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1載體(Invitrogen)。這樣產(chǎn)生了質(zhì)粒GTC700。
通過(guò)下面三個(gè)步驟構(gòu)建了MSP雙糖基化突變體首先將BC670的Xho I-Bsm I片段和GTC716的BSm I-Xho I片段連接導(dǎo)入pCR2.1載體的Xho I位點(diǎn)。這樣產(chǎn)生了含有具N262-Q突變的MSP1-42基因的質(zhì)粒。然后將這個(gè)質(zhì)粒中的EcoN I-Nde I片段用GTC716質(zhì)粒的EcoNI-Nde I片段取代，引入第二個(gè)突變N181-Q。最后將這個(gè)質(zhì)粒的Xho I片段克隆到BC350產(chǎn)生BC718(圖12)。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中非糖基化MSP1的表達(dá)BC718具有下列特征它攜帶處于β-酪蛋白啟動(dòng)子控制下的MSP1-42基因因而可在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物哺乳期乳腺中表達(dá)。此外，它編碼直接與MSP1-42融合的15個(gè)氨基酸的β-酪蛋白前導(dǎo)序列，這樣在N-末端沒(méi)有任何多余氨基酸的MSP1-42可以分泌到乳汁中。最后，由于N-Q置換，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中此構(gòu)建體產(chǎn)生的MSP不會(huì)被糖基化?？偠灾?，在乳汁中由BC718產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因MSP與寄生生物MSP1是相同的。
從質(zhì)粒BC718制備了SalI/XhoI片段并微注射到小鼠胚胎產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因小鼠。如前面所述鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。收集雌性建立者的乳汁，并使用抗體5.2進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。結(jié)果示于圖13，表明非糖基化MSP1以0.5至1毫克/毫升的濃度表達(dá)。
等價(jià)物本技術(shù)領(lǐng)域熟術(shù)人員僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)會(huì)認(rèn)識(shí)到或能夠確定多種等價(jià)物均被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并由下面的權(quán)利要求所覆蓋。
權(quán)利要求
1.一種能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的寄生生物的修飾的已知核酸，其中的修飾包括通過(guò)用與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的優(yōu)選密碼子置換基因中的一個(gè)或多個(gè)含AT的密碼子來(lái)降低AT含量。
2.一種能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的寄生生物蛋白質(zhì)的修飾的已知核酸，其中通過(guò)用與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的優(yōu)選密碼子置換mRNA不穩(wěn)定基序來(lái)消除基因編碼序列中存在的至少一個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序。
3.權(quán)利要求1或2的修飾的核酸，其中由與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的優(yōu)選的乳汁蛋白特異性密碼子置換已知基因的至少一個(gè)或多個(gè)密碼子。
4.一種能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的寄生生物的修飾的已知核酸，其中通過(guò)乳汁蛋白特異性密碼子的置換降低了已知編碼基因的總AT含量，并且其中用乳汁蛋白特異性密碼子置換消除了基因中存在的至少一個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序以及用優(yōu)選的乳汁蛋白特異性密碼子置換了天然基因中的至少一個(gè)密碼子。
5.權(quán)利要求4的修飾的核酸，其中所述修飾的核酸在體外或體內(nèi)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中能夠以天然基因表達(dá)水平的至少100％的水平表達(dá)所述蛋白質(zhì)。
6.制備用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的寄生生物的修飾的已知核酸的方法，包括用與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的優(yōu)選的乳房特異性密碼子置換天然基因中的一個(gè)或多個(gè)含AT的密碼子來(lái)降低天然基因的AT含量。
7.制備用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的寄生生物蛋白質(zhì)的修飾的已知核酸的方法，包括用與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的優(yōu)選的乳房特異性密碼子置換基因中的一個(gè)或多個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序來(lái)消除基因中至少一個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序。
8.權(quán)利要求5或6的方法，進(jìn)一步包括用與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的優(yōu)選的乳房特異性密碼子置換編碼所述蛋白質(zhì)的天然基因中的一個(gè)或多個(gè)密碼子。
9.用權(quán)利要求5或6的方法制備的修飾的核酸序列。
10.制備用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的寄生生物的修飾的已知核酸的方法，包括下列步驟a)用與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的優(yōu)選乳汁蛋白質(zhì)特異性密碼子置換基因中的一個(gè)或多個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序來(lái)消除編碼所述蛋白質(zhì)的天然基因中至少一個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序。b)用與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的乳汁蛋白質(zhì)特異性密碼子置換基因中的一個(gè)或多個(gè)含AT密碼子來(lái)降低編碼所述蛋白質(zhì)的天然基因的AT豐富含量以及c)用與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的優(yōu)選的乳房特異性密碼子置換編碼所述蛋白質(zhì)的天然基因中的一個(gè)或多個(gè)密碼子。
11.使用權(quán)利要求10的方法制備的修飾的核酸。
12.權(quán)利要求1的修飾的核酸，其中所述寄生生物是瘧原蟲(chóng)并且所述核酸是序列1或序列9的片段或與其特異性同源的序列。
13.權(quán)利要求1的修飾的核酸，其中所述寄生生物是瘧原蟲(chóng)并且所述核酸是序列9或其片段或與其特異性同源的序列。
14.能夠在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的修飾的核酸，其是序列1的片段或與其特異性同源的序列，其中使用與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的但可以有效降低天然基因總AT含量的所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)識(shí)別的密碼子置換一個(gè)或多個(gè)密碼子降低了該天然基因的AT含量。
15.能夠在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的修飾的核酸，其是序列1的片段或與其特異性同源的序列，其中使用可以有效消除不穩(wěn)定基序的且與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的所述細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別的密碼子置換含有不穩(wěn)定基序的一個(gè)或多個(gè)密碼子，消除了天然基因編碼序列中存在的至少一個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序。
16.權(quán)利要求14或15的修飾的核酸，其中用所述細(xì)胞系統(tǒng)的優(yōu)選密碼子置換了天然基因中至少一個(gè)或所有的密碼子。
17.含有權(quán)利要求12的修飾的核酸的載體。
18.使用權(quán)利要求17的載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
19.含有權(quán)利要求12的修飾的核酸的轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體。
20.非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其種系含有權(quán)利要求12的修飾的核酸。
21.含有一個(gè)與權(quán)利要求12的修飾的核酸可操作相連的啟動(dòng)子的用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，其中所述啟動(dòng)子指導(dǎo)所述修飾的核酸編碼的蛋白質(zhì)在乳腺表達(dá)進(jìn)入該動(dòng)物乳汁中。
22.一種能在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的細(xì)菌、病毒或寄生生物的修飾的已知核酸，其中使用與所置換的密碼子編碼相同氨基酸但可以有效降低天然基因總AT豐富含量的所述細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別的密碼子置換一個(gè)或多個(gè)密碼子，降低了該基因的AT含量。
23.一種能在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)的細(xì)菌、病毒或寄生生物的修飾的核酸，其中使用可以有效消除不穩(wěn)定基序且與所置換的密碼子編碼相同氨基酸的所述細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別的密碼子置換含有所述不穩(wěn)定基序的一個(gè)或多個(gè)密碼子，消除了基因編碼序列中存在的至少一個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序。
24.權(quán)利要求22或23的修飾的核酸，其中用所述細(xì)胞系統(tǒng)的優(yōu)選密碼子置換了天然基因中至少一個(gè)或所有的密碼子。
25.含有權(quán)利要求24的修飾的核酸的DNA疫苗。
26.含有權(quán)利要求17載體的DNA疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了修飾的重組核酸序列(優(yōu)選的是DNA)以及增加蛋白質(zhì)的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法,這里的蛋白質(zhì)是已知或很可能在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中難以表達(dá)的蛋白質(zhì)。使用本發(fā)明重組技術(shù)表達(dá)的優(yōu)選的“困難”蛋白質(zhì)候選物是從優(yōu)選是諸如寄生生物、細(xì)菌和病毒等低等生物的異源細(xì)胞衍生的蛋白質(zhì)。它們的DNA編碼序列相對(duì)使用的重組表達(dá)系統(tǒng)而言含有高的總AT含量或富AT區(qū)和/或mRNA不穩(wěn)定基序和/或稀有密碼子。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1276831SQ98810400
公開(kāi)日2000年12月13日 申請(qǐng)日期1998年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月20日
發(fā)明者L·H·陳, H·米德 申請(qǐng)人:根茨美轉(zhuǎn)基因公司