專利名稱：新的修飾的MSP－1核酸序列以及增加細(xì)胞系統(tǒng)中mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及異源基因表達(dá)。更具體地，本發(fā)明涉及在較高等的真核細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)瘧原蟲(malaria)基因。
相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)綜述在體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或體內(nèi)重組生產(chǎn)系統(tǒng)中進(jìn)行特定的異源基因產(chǎn)物的重組生長(zhǎng)通常是困難的。例如，許多研究人員發(fā)現(xiàn)，在與蛋白質(zhì)原始來源的細(xì)胞不同的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中難以表達(dá)來自細(xì)菌、寄生生物和病毒的蛋白質(zhì)。難以由哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的醫(yī)療上重要蛋白質(zhì)的一個(gè)例子是瘧原蟲裂殖子表面蛋白(malaria merozoite surface protein)(MSP-1)。
瘧疾在熱帶國(guó)家是嚴(yán)重的健康問題。對(duì)現(xiàn)存藥物的抗性迅速發(fā)展，因而急需疫苗。在惡性瘧原蟲(P.falciparum)生長(zhǎng)周期中表達(dá)的多種抗原中，MSP-1是研究最深入的并且看來是最成功的接種候選。暴露于惡性瘧原蟲的個(gè)體產(chǎn)生抗MSP-1抗體，研究表明在對(duì)MSP-1的天然獲得性免疫反應(yīng)和減低的瘧疾發(fā)病率之間有相關(guān)性。在一系列研究中，用純化的天然MSP-1或該蛋白的重組片段免疫可以誘導(dǎo)至少部分對(duì)該寄生生物的防護(hù)(Diggs等，(1993)Parasitol Today9300-302)。因此MSP-1是開發(fā)抗惡性瘧原蟲疫苗的重要靶。
MSP-1是一種190-220kDA的糖蛋白。C-末端區(qū)域已經(jīng)是可用作疫苗的重組產(chǎn)物的焦點(diǎn)。然而，開發(fā)MSP-1用作疫苗的一個(gè)主要問題是在細(xì)菌或酵母表達(dá)系統(tǒng)難以獲得與親和純化的天然蛋白質(zhì)具有同等免疫學(xué)能力的重組蛋白(Chang等，(1992)免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)148548-555)以及使疫苗生產(chǎn)可行的足夠量的重組蛋白。
增強(qiáng)足夠量MSP-1表達(dá)的改進(jìn)的方法是有利的。
本發(fā)明的概述本發(fā)明提供了改進(jìn)的重組DNA成分和增加瘧原蟲表面抗原MSP-1在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的優(yōu)選蛋白候選物是相對(duì)重組表達(dá)系統(tǒng)而言具有降低的AT含量和消除了mRNA不穩(wěn)定基序以及稀有密碼子的DNA編碼序列的MSP-1的C-末端衍生物。因而，第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了從序列2衍生的DNA序列。此衍生序列顯示于序列1。
第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明修飾核酸的方法，包括降低編碼MSP-1的天然基因的總AT含量，消除所有mRNA不穩(wěn)定基序以及使用乳腺組織偏愛密碼子置換所有稀有密碼子(均采用乳腺組織識(shí)別的、優(yōu)選的為偏愛的并且編碼與所置換的密碼子同樣的氨基酸的密碼子來置換天然基因中的特定密碼子)等步驟。本發(fā)明的這一方面進(jìn)一步包括依據(jù)本發(fā)明方法制備的修飾核酸。
第三個(gè)方面，本發(fā)明亦提供了含有本發(fā)明修飾MSP-1核酸和山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子以及信號(hào)序列的載體，以及用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
第四個(gè)方面，本發(fā)明提供了種系含有本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物。
第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有依據(jù)本發(fā)明的修飾MSP-1基因的DNA疫苗。
圖的說明

圖1描繪了依據(jù)本發(fā)明修飾的MSP-142的cDNA序列[序列1]，其中置換了306個(gè)核苷酸以降低AT含量并消除了mRNA不穩(wěn)定基序同時(shí)保持MSP-142的相同蛋白質(zhì)氨基酸序列。大寫字母表示核苷酸置換。
圖2描繪了編碼“野生型”或天然MSP-142序列的核苷酸序列[序列2]。
圖3是野生型MSP-142(在表中命名為“MSP-1wt”)和新修飾的MSP-142基因(在表中命名為“編輯的MSP”)以及幾種乳蛋白質(zhì)基因(來自山羊和小鼠的酪蛋白基因)的密碼子使用表。每一欄中的數(shù)目表示在列出的各基因中特定密碼子出現(xiàn)的實(shí)際次數(shù)。新的MSP-142合成基因是通過首先選擇給定氨基酸的富GC密碼子結(jié)合選擇在乳蛋白中最常使用的氨基酸從乳房特異密碼子用法中產(chǎn)生的。
圖4a-c分別描繪了如實(shí)施例中所述的MSP-142構(gòu)建體GTC479，GTC564和GTC627。
圖5A欄是Northern檢測(cè)，其中構(gòu)建體GTC627含有依據(jù)本發(fā)明修飾的新MSP-142基因，GTC479是含有天然MSP-142基因的構(gòu)建體，而GTC469是陰性對(duì)照DNA。
圖5B欄是親和純化后洗脫組分的Western檢測(cè)。數(shù)字是收獲的級(jí)分。結(jié)果表明來自修飾MSP-142合成基因構(gòu)建體GTC679的級(jí)分與MSP-1多克隆抗體反應(yīng)而陰性對(duì)照GTC479則不反應(yīng)。
圖6描繪了實(shí)施例中所述的OT1[序列3]、OT2[序列4]、MSP-8[序列5]、MSP2[序列6]、MSP-1[序列7]的核酸序列。
圖7圖示質(zhì)粒BC574。
圖8圖示BC620。
圖9圖示BC670。
圖10圖示轉(zhuǎn)基因乳汁中的MSP的Westen印跡。
圖11圖示MSP42-2的核苷酸序列[序列8]。
圖12圖示BC718。
圖13圖示在轉(zhuǎn)基因乳汁中BC718的表達(dá)的Westen印跡。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本專利和此處引用的科學(xué)文獻(xiàn)建立了本技術(shù)領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可利用的知識(shí)。頒布的美國(guó)專利、允許的申請(qǐng)、公開的外國(guó)申請(qǐng)以及此處引用的文獻(xiàn)，通過參考文獻(xiàn)形式并于此處。解決這些文獻(xiàn)和本公開之間的任何沖突均以本發(fā)明為準(zhǔn)。
本發(fā)明提供了改進(jìn)的重組DNA成分以及增加瘧原蟲表面抗原MSP-1在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。在本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的優(yōu)選蛋白候選物是相對(duì)重組表達(dá)系統(tǒng)而言具有降低的AT含量和消除了mRNA不穩(wěn)定基序以及稀有密碼子的DNA編碼序列的MSP-1的C-末端衍生物。因而，第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了從序列2衍生的DNA序列。此衍生序列顯示于序列1。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中能夠以天然基因在相同條件下于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)水平的至少25％，優(yōu)選的是50％，更優(yōu)選的至少為100％或更高的水平表達(dá)MSP-1。
此處使用的術(shù)語“表達(dá)”是指導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)的mRNA轉(zhuǎn)錄?？赏ㄟ^本技術(shù)領(lǐng)域已知的一系列技術(shù)測(cè)定表達(dá)，包括使用對(duì)目的蛋白特異的抗體?！疤烊换颉被颉白匀换颉笔侵妇幋a野生型MSP-1的和作為修飾核酸來源的基因序列或其片段(包括天然出現(xiàn)的等位基因變異)?！捌珢?優(yōu)選)密碼子”是指修飾的MSP-1要在其中表達(dá)的細(xì)胞或組織類型例如乳房組織更常用的密碼子。并非所有在此描述的密碼子改變都是變成偏愛密碼子，只需置換的密碼子至少能被小鼠乳房組織識(shí)別。此處使用的術(shù)語“減少的AT含量”是指由于在不改變靶蛋白的氨基酸序列的前提下使用小鼠乳房組織識(shí)別的核苷酸或密碼子置換含A或T的核苷酸位點(diǎn)或含A和/或T的密碼子而比天然MSP-1基因具有較低的含A(腺嘌呤)T(胸腺嘧啶)堿基的核苷酸的總百分?jǐn)?shù)。
第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了制備修飾核酸的方法，包括降低編碼MSP-1的天然基因的總AT含量，消除所有mRNA不穩(wěn)定基序以及使用乳腺組織的偏愛密碼子置換所有稀有密碼子(均采用乳腺組織識(shí)別的、優(yōu)選地為偏愛的并且編碼與所置換的密碼子的相同的氨基酸的密碼子來置換天然基因中的特定密碼子)。描述重組DNA技術(shù)的一般原理的標(biāo)準(zhǔn)參考書包括Watson，J.D.等，基因的分子生物學(xué)(MolecularBiology of the Gene)卷I和卷II，the Benjamin/Cummings PublishingCompany，Inc.publisher，Menlo Park，CA(1987)Darnell，J.E.等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Molecular Cell Biology)，Scientific AmericanBooks，Inc.，Publisher，New York，NY(1986)；Old，R.W.等，基因操作原理基因工程入門(Principle of Gene ManipulationAnIntroduction to Genetic Engineering)，第二版，University ofCalifornia Press，publisher，Berkeley CA(1981)；Maniatis，T.等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring Harbor Laboratory)，publisher，冷泉港(Cold Spring Harbor)，NY(1989)和分子生物學(xué)通用流程(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等，Wiley Press，New York，NY(1992)。本發(fā)明的這一方面進(jìn)一步包括依據(jù)本發(fā)明方法制備的修飾核酸。
不局限于任何原理，以前的研究表明GM-CSF mRNA的3’非翻譯區(qū)的一段保守AU序列(AUUUA)介導(dǎo)選擇性mRNA降解(Shaw，G.和Kamen，R.細(xì)胞(Cell)46659-667)。過去的焦點(diǎn)在于基因非翻譯區(qū)的這些不穩(wěn)定基序的存在。本發(fā)明是第一個(gè)意識(shí)到消除MSP-1基因編碼區(qū)的不穩(wěn)定序列的益處。
第三個(gè)方面，本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明修飾MSP-1核酸和山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子及信號(hào)序列的載體，以及用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
第四個(gè)方面，本發(fā)明還提供了種系含有本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。本技術(shù)領(lǐng)域已知產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一般原理。參看例如Hoganet al.，小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring HarborLaboratory)，(1986)；Simons et al，Bio/Technology 6179-183，(1988)；Wall et al.，Biol.Reprod.32645-651，(1985)；Buhleret al.，Bio/Technology 8140-143(1990)；Ebert et al.，Bio/Technology 9835-838(1991)；Krimenfort et al.，Bio/Technology 9844-847(1991)；Wall et al.，細(xì)胞生物化學(xué)雜志(J.Cell.Biochem.)49113-120(1992)。將外源DNA序列導(dǎo)入哺乳動(dòng)物及其生殖細(xì)胞的技術(shù)最初是在小鼠中開發(fā)的。參看例如，Gordon et al.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad Sci.USA)777380-7384，(1980)；Gordon and Ruddle科學(xué)(Science)2141244-1246(1981)；Palmiter and Brinster，細(xì)胞(Cell)41343-345，1985；Brinster et al.，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)824438-4442(1985)and Hogan et al.(出處如上)。隨后將這些技術(shù)修飾為用于大型動(dòng)物包括牛和羊。直至最近，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠或家畜的最廣泛應(yīng)用的方法是將感興趣的上百個(gè)線性DNA分子以轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體的形式注射到受精卵的一個(gè)前核。將DNA注射到受精卵的細(xì)胞質(zhì)亦有廣泛應(yīng)用。最近，能夠注射到未受精卵的完整轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的克隆已獲得成功(KHS Campbell et al.，自然(Nature)380 64-66，(1996))。
乳腺表達(dá)系統(tǒng)具有高表達(dá)水平、低成本、正確加工和可及性的優(yōu)點(diǎn)。多名研究人員已經(jīng)在泌乳轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生了已知蛋白質(zhì)，諸如牛和人α-乳清蛋白。(Wright et al.，Bio/technology9830；834(1991)；Vilotte et al，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)，18643-48(1989)；Kochi et al.，Mol Reprod，And Devel.33160-164(1992)；Soulier et al.，F(xiàn)EBS Letters 297(1，2)13-18(1992))，并且該系統(tǒng)顯示可以產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)。
第五個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有依據(jù)本發(fā)明的修飾MSP-1基因的DNA疫苗。這種DNA疫苗可以不進(jìn)行膠囊化給藥，或可作為脂質(zhì)體的部分給藥，或作為病毒基因組的部分給藥。通常以足夠使修飾MSP-1基因表達(dá)并在接受DNA疫苗的動(dòng)物體包括人體誘發(fā)抗體反應(yīng)的量使用這種疫苗。隨后至少在第一次給藥后一星期之后可再次給藥以增強(qiáng)抗體反應(yīng)。優(yōu)選的給藥途徑包括經(jīng)粘膜以及腸胃外給藥。
實(shí)施例制造新的修飾MSP-142基因提供了編碼MSP-1C-末端片段的新的修飾核酸。圖1顯示了能夠在本發(fā)明哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的編碼MSP-1 42kD C-末端片段(MSP-142)的本發(fā)明新的修飾核酸。天然MSP-142基因(圖2)不能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)。對(duì)天然MSP-142基因的分析表明其多種特征與哺乳動(dòng)物基因有區(qū)別。首先，它有高達(dá)76％的AT含量。其次，在此1100bp的DNA片段(圖2)中，mRNA不穩(wěn)定基序AUUUA出現(xiàn)10次。為了針對(duì)這些區(qū)別，設(shè)計(jì)了新的MSP-142基因。向天然MSP-142基因的306個(gè)位點(diǎn)引入了沉默核苷酸置換將總AT含量降至49.7％。同樣經(jīng)過密碼子用法的改變消除了天然基因中的10個(gè)AUUUA mRNA不穩(wěn)定基序。為了改變密碼子用法，使用多種小鼠和山羊乳房特異蛋白質(zhì)制出了乳房組織特異性密碼子使用表圖3a。將該表用于指導(dǎo)如上所述修飾MSP-142基因的密碼子用法選擇。例如圖3a中的表中所示，在天然基因中，65％(25/38)的亮氨酸由TTA編碼，它在乳腺中是稀有密碼子。在修飾的MSP-142基因中，100％的亮氨酸由CTG編碼，而后者是乳腺中亮氨酸的優(yōu)選密碼子。
使用修飾的MSP-142基因構(gòu)建了表達(dá)載體，其是通過將山羊β-酪蛋白的前端26個(gè)氨基酸融合到修飾MSP-142基因的N-末端和將攜帶融合基因的SalI-Xho I片段亞克隆到表達(dá)載體pCDNA3的XhoI位點(diǎn)而進(jìn)行的。將His6標(biāo)記融合到MSP-142基因的3’末端使基因產(chǎn)物能夠親和純化。這樣制備了質(zhì)粒GTC627(圖4c)為了比較天然MSP-142基因構(gòu)建體和本發(fā)明修飾的MSP-142核酸，亦構(gòu)建了天然MSP-142基因的表達(dá)載體并將該基因加到哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物和注射到小鼠中形成轉(zhuǎn)基因小鼠，如下所述構(gòu)建天然MSP-142表達(dá)載體為了分泌截短的惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)，將編碼MSP-1 42kD C-末端部分(MSP-142)的野生型基因融合到編碼山羊β-酪蛋白的前15或前26個(gè)氨基酸的DNA序列中。這是通過首先用引物MSP1和MSP2(圖6)PCR擴(kuò)增MSP-1質(zhì)粒(來自Dr.David Kaslow，NIH)，然后將PCR產(chǎn)物克隆到TA載體(Invitrogen)獲得的。將PCR產(chǎn)物的BglII-XhoI片段與寡聚物OT1和OT2(圖6)接進(jìn)入表達(dá)載體pCDNA3。這樣產(chǎn)生了質(zhì)粒GTC564(圖4b)，它編碼15個(gè)氨基酸的β-酪蛋白信號(hào)肽和成熟山羊β-酪蛋白的前11個(gè)氨基酸，隨后是天然MSP-142基因。使用寡聚物MSP-8和MSP-2(圖6)通過PCR擴(kuò)增MSP-1質(zhì)粒，然后將產(chǎn)物克隆到TA載體。切下XhoI片段并克隆到表達(dá)載體pCDNA3的XhoI位點(diǎn)產(chǎn)生質(zhì)粒GTC479(圖4a)，它編碼融合到野生型MSP-142基因的15個(gè)氨基酸的山羊β-酪蛋白信號(hào)肽。在GTC564和GTC479中的MSP-142基因3’末端加上了組氨酸6(His6)標(biāo)記。
在COS-7細(xì)胞中未表達(dá)天然MSP-142基因通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染檢測(cè)測(cè)定了培養(yǎng)的COS-7細(xì)胞中天然MSP基因的表達(dá)。按照廠商手冊(cè)使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco-BRL)將GTC479和GTC564質(zhì)粒DNA導(dǎo)入COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染兩天后從COS細(xì)胞分離總細(xì)胞RNA。轉(zhuǎn)染兩天后通過將35S甲硫氨酸加入培養(yǎng)物中代謝標(biāo)記新合成的蛋白質(zhì)10個(gè)小時(shí)。
為了測(cè)定COS細(xì)胞中的MSP mRNA表達(dá)，用來自GTC479的32P標(biāo)記DNA片段探測(cè)Northern印跡。在GTC479或GTC564轉(zhuǎn)染體中未測(cè)到MSP RNA(未發(fā)表資料)。延長(zhǎng)的曝光揭示有殘余水平的降解的MSPmRNA。用抗MSP的多克隆抗體免疫沉淀35S標(biāo)記的培養(yǎng)物上清和裂解物。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示GTC479或GTC564轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解物或上清中沒有表達(dá)(未發(fā)表資料)。這些結(jié)果顯示天然MSP-1未在COS細(xì)胞中表達(dá)。
在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中沒有天然MSP-142基因的表達(dá)將編碼15個(gè)氨基酸的山羊β-酪蛋白信號(hào)肽，山羊β-酪蛋白的前11個(gè)氨基酸以及天然MSP-142基因的GTC479 SalI-XhoI片段克隆到載體BC350中表達(dá)的β-酪蛋白XhoI位點(diǎn)。這樣產(chǎn)生質(zhì)粒BC574(圖7)。將BC574的SalI-NotI片段注射到小鼠胚胎產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。建立了15個(gè)株系的轉(zhuǎn)基因小鼠。收集雌性建立者小鼠的乳汁并使用抗MSP多克隆抗體進(jìn)行Western檢測(cè)。檢測(cè)的7個(gè)小鼠乳汁中均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)MSP-142蛋白質(zhì)。為了進(jìn)一步確定在乳腺是否有MSP-142的mRNA表達(dá)，從第11天的泌乳轉(zhuǎn)基因小鼠提取總RNA并進(jìn)行Northern印跡檢測(cè)。檢測(cè)的任何一個(gè)BC574株系均未測(cè)到MSP-142mRNA。因而，MSP-142轉(zhuǎn)基因未在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺中表達(dá)?？偟膩碚f，這些實(shí)驗(yàn)提示天然寄生生物的MSP-142基因不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，其阻斷是mRNA豐度的水平的。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MSP的表達(dá)進(jìn)行了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià)本發(fā)明修飾的MSP-142基因在COS細(xì)胞中的表達(dá)。將GTC627和GTC479的DNA導(dǎo)入COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)分離總RNA進(jìn)行Northern檢測(cè)。用32P標(biāo)記GTC627的SalI-XhoI片段探測(cè)固定化RNA。觀察到GTC479和GTC627的顯著不同。如前面顯示，GTC479轉(zhuǎn)染細(xì)胞中未檢測(cè)到MSP-142mRNA，而在GTC627中表達(dá)了豐富的MSP-142mRNA(圖5，A欄)。GTC469用作陰性對(duì)照并且含有克隆到商品化克隆載體PU19的GTC564的插入片段。使用35S甲硫氨酸的代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)以及隨后的使用抗MSP的多克隆抗體的免疫沉淀(由NIH的D.Kaslow NIAID提供)顯示轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞合成了MSP-142蛋白質(zhì)(圖5，B欄)。此外，在轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞上清中檢測(cè)到MSP-142，表明MSP-142蛋白質(zhì)亦分泌出來。此外，使用Ni-NTA柱，從GTC627轉(zhuǎn)染的COS上清中親和純化了MSP-142。
這些結(jié)果證明寄生性MSP-142基因的修飾導(dǎo)致MSP的mRNA在COS細(xì)胞中表達(dá)。隨后，哺乳動(dòng)物細(xì)胞合成和分泌MSP-142產(chǎn)物。
亦可使用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法制備本實(shí)驗(yàn)中使用的多克隆抗體(抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(AntibodiesA Laboratory Manual)，Ed Harlowand David Lane，eds.冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold Spring HarborLaboratory)，publishers(1988))。MSP血清抗體的產(chǎn)生亦描述于Chang et al.，感染和免疫(Infection and Immunity)(1996)64253-261 and Chang et al.，(1992)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(ProcNatl.Acad.Sci.USA)866343-6347。
這些檢測(cè)表明與根本不表達(dá)的天然蛋白質(zhì)相比，本發(fā)明的修飾MSP-142核酸可以高水平表達(dá)。這些結(jié)果代表了降低基因中的AT％導(dǎo)致MSP基因在異源系統(tǒng)中表達(dá)的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，同時(shí)代表了從MSP編碼區(qū)消除AUUUA mRNA不穩(wěn)定基序?qū)е翸SP蛋白質(zhì)在COS細(xì)胞中表達(dá)的第一個(gè)證據(jù)。圖5A欄Northern的結(jié)果(即天然基因無RNA而本發(fā)明的修飾DNA序列有合理的水平的RNA)很可能解釋了蛋白質(zhì)產(chǎn)生的增加。
下面的實(shí)施例描述了MSP1-42作為天然未融合(并且未糖基化)蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的表達(dá)。
MSP轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建為了將MSP1-42與15個(gè)氨基酸的β-酪蛋白信號(hào)肽融合，將編碼15個(gè)氨基酸酪蛋白信號(hào)和結(jié)束于Cla I位點(diǎn)的MSP1-42的前5個(gè)氨基酸的寡聚物對(duì)MSP203和MSP204(MSP203ggccgctcgacgccaccatgaaggtcctcataattgcctgtctggtggctctggccattgcagccgtcactccctccgtcat，MSP204cgatgacggagggagtgacggctgcaatggccagagccaccagacaggcaattatgaggaccttcatggtggcgtcgagc)與編碼其余的MSP1-42基因的BC620的CLA I-Xho I片段(圖8)連接進(jìn)入表達(dá)載體pCDNA3的Xho I位點(diǎn)。然后將這個(gè)質(zhì)粒(GTC669)的Xho I片段克隆到乳汁特異性表達(dá)載體BC350的Xho I位點(diǎn)產(chǎn)生B670(圖9)。
MSP1-42在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的表達(dá)從質(zhì)粒BC670制備Sal I-Not I片段并微注射到小鼠胚胎產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。通過從尾巴活組織檢查提取小鼠DNA隨后使用寡聚物GTC17和MSP101(寡聚物的序列GTC17，GATTG ACAAG TAATA CGCTG TTTCCTC寡聚物MSP101，GGATTCAATAGATACGG)進(jìn)行PCR檢測(cè)確認(rèn)轉(zhuǎn)基因小鼠。在哺乳第7和9天收集雌性建立者轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁，并使用多克隆抗-MSP抗體和單克隆抗MSP抗體5.2(Dr.David Kaslow，NIH)通過western檢測(cè)確定MSP-1-42的表達(dá)水平。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中MSP1-42的表達(dá)水平是1-2毫克/毫升(圖10)。
構(gòu)建MSP1-42糖基化位點(diǎn)負(fù)突變體我們對(duì)乳汁產(chǎn)生的MSP檢測(cè)揭示轉(zhuǎn)基因MSP蛋白質(zhì)是N-糖基化的。為了消除MSP1-42基因中的N-糖基化位點(diǎn)，用谷氨酰胺(Q)取代了181和262位點(diǎn)的天冬酰胺(N)。通過設(shè)計(jì)與MSP1相應(yīng)區(qū)域退火的攜帶AAC到CAG突變的DNA寡聚物導(dǎo)入了置換。然后將這些寡聚物用作PCR引物產(chǎn)生編碼N至Q置換的DNA片段。
為了導(dǎo)入N262-Q突變，使用一對(duì)寡聚物MSPGYLYCO-3(CAGGGAATGCTGCAGATC AGC)和MSP42-2(AATTCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGATCGCAGAAAATAC CATG圖11)PCR擴(kuò)增含有合成的MSP1-42基因的質(zhì)粒GTC627。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1載體(Invitrogen)。這樣產(chǎn)生了質(zhì)粒GTC716。
為了導(dǎo)入N181-Q突變，使用寡聚物 MSPGLYCO-1(CTCCTTGTTCAGGAACT TGTAG GG和MSPGLCO-2(GTCCTGCAGTACACATATGAG圖4)PCR擴(kuò)增質(zhì)粒GTC627。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR2.1載體。這樣產(chǎn)生了質(zhì)粒GTC700。
通過下面三個(gè)步驟構(gòu)建了MSP雙糖基化突變體首先將BC670的Xho I-Bsm I片段和GTC716的BSm I-Xho I片段連接導(dǎo)入pCR2.1載體的Xho I位點(diǎn)。這樣產(chǎn)生了含有具N262-Q突變的MSP1-42基因的質(zhì)粒。然后將這個(gè)質(zhì)粒中的EcoN I-Nde I片段用GTC716質(zhì)粒的EcoN I-NdeI片段取代，引入第二個(gè)突變N181-Q。最后將這個(gè)質(zhì)粒的Xho I片段克隆到BC350產(chǎn)生BC718(圖12)。
非糖基化MSP1的轉(zhuǎn)基因表達(dá)BC718具有下列特征它攜帶處于β-酪蛋白啟動(dòng)子控制下的MSP1-42基因因而可在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物哺乳期乳腺中表達(dá)。此外，它編碼直接與MSP1-42融合的15個(gè)氨基酸的β-酪蛋白前導(dǎo)序列，這樣在N-末端沒有任何多余氨基酸的MSP1-42可以分泌到乳汁中。最后，由于N-Q置換，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中此構(gòu)建體產(chǎn)生的MSP不會(huì)被糖基化。總而言之，在乳汁中由BC718產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因MSP與寄生生物MSP1是相同的。
從質(zhì)粒BC718制備了SalI/XhoI片段并微注射到小鼠胚胎產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因小鼠。如前面所述鑒定轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。收集雌性建立者的乳汁，并使用抗體5.2進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。結(jié)果示于圖13，表明非糖基化MSP1以0.5至1毫克/毫升的濃度表達(dá)。
權(quán)利要求
1.序列1所示的修飾的MSP-1核酸序列。
2.制備修飾的MSP-1核酸的方法，包括降低編碼MSP-1天然基因的總AT含量，消除所有的mRNA不穩(wěn)定基序以及用小鼠乳腺偏愛密碼子置換所有稀有密碼子等步驟。
3.用權(quán)利要求2的方法制備的修飾的MSP-1核酸。
4.含有權(quán)利要求1的修飾的MSP-1核酸和山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子及信號(hào)序列的載體。
5.用權(quán)利要求4的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.含有權(quán)利要求4的載體的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。
7.含有權(quán)利要求1的修飾的MSP-1核酸的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物。
8.含有權(quán)利要求1的修飾的核酸的DNA疫苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了修飾的重組核酸序列(優(yōu)選的是DNA)以及增加瘧原蟲表面蛋白MSP－1的mRNA水平和蛋白質(zhì)表達(dá)的方法,已知該蛋白質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中難以表達(dá)。使用本發(fā)明重組技術(shù)表達(dá)的優(yōu)選的“困難”蛋白質(zhì)候選物是MSP－1蛋白質(zhì),它是由相對(duì)天然MSP－1基因含有降低的總AT含量或富AT區(qū)和/或mRNA不穩(wěn)定基序和/或稀有密碼子的DNA編碼序列表達(dá)的。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1276834SQ98810398
公開日2000年12月13日 申請(qǐng)日期1998年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月20日
發(fā)明者L·H·陳, H·米德 申請(qǐng)人:根茨美轉(zhuǎn)基因公司