釋，濃度范圍是1.56-300微克 /毫升，尼羅紅采用二氯甲烷溶解配置成500微摩爾溶液，向1.5毫升離心管中加入10微 升尼羅紅，避光使得二氯甲烷揮發(fā)干，向含有尼羅紅的離心管中加入500微升各濃度多肽 溶液，避光25 °C，250轉(zhuǎn)每分鐘搖床中振蕩過夜，采用485 nm激發(fā)，熒光光譜儀測定各濃度 下尼羅紅的熒光強(qiáng)度。圖2A展示了多肽序列2的關(guān)鍵成膠束濃度變化曲線。
[0032] 2.多肽在不同濃度下的膜靶向定位 多肽與環(huán)金屬銥配位化合物[(PPy)2Ir(H2O)2] (OTf)與多肽的反應(yīng)濃度的摩爾比為1 : 1，反應(yīng)在PBS(pH 7. 4)中進(jìn)行，37°C震蕩2小時或4°C過夜。參閱圖3 A和3B，在紫外光（365 nm)照射下，環(huán)金屬標(biāo)記的多肽可以產(chǎn)生綠色熒光。采用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液將環(huán)金屬銥標(biāo)記 的多肽稀釋至5微摩爾，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中使得細(xì)胞在37 °C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24小時，隨后吸除含多肽的培養(yǎng)液，加入采用37 °C預(yù)熱的含200納摩爾Lyso-Tracker Red的細(xì)胞培養(yǎng)液，37 °C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，隨后吸除染色液，采用培養(yǎng)液 將細(xì)胞洗兩遍后利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行共定位實(shí)驗(yàn)拍照，環(huán)金屬銥標(biāo)記多肽（Ex=405 nm), Lyso-Tracker Red (Ex=561 nm)，圖3A顯示在此濃度下銥標(biāo)記多肽定位于溶酶體中。 圖3A中，1代表是銥標(biāo)記多肽RLA (序列2)在細(xì)胞中分布情況，2代表是溶酶體的熒光探針 Lyso-Tracker Red在溶酶體中的定位，3代表1和2圖片的疊加，顯示銥標(biāo)記多肽RLA (序 列2)與Lyso-Tracker Red具有很好的突光定位效果。當(dāng)濃度為20微摩爾時，加入多肽 后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖片拍攝，圖3B顯示銥標(biāo)記多肽在此濃度下迅速穿透細(xì)胞 膜進(jìn)入胞漿中引發(fā)細(xì)胞死亡。在圖3B中，1代表銥標(biāo)記多肽RLA (序列2)在細(xì)胞中的綠色 熒光圖片，2代表銥標(biāo)記多肽RLA (序列2)的細(xì)胞明場圖片，3代表1和2圖片的疊加。
[0033] 實(shí)施例2 當(dāng)X1為Arg, X2為Leu, X3為Leu時，多肽序列（SEQ ID No. 5,亦可簡稱序列5)如下： HGG-(rllrllr)2-nh2。
[0034] 1、多肽的關(guān)鍵成膠束濃度實(shí)驗(yàn) 多肽的關(guān)鍵成膠束濃度實(shí)驗(yàn)中，多肽采用Milli Q水稀釋，濃度范圍是1.56-300微克 /毫升，尼羅紅采用二氯甲烷溶解配置成500微摩爾溶液，向1.5毫升離心管中加入10微 升尼羅紅，避光使得二氯甲烷揮發(fā)干，向含有尼羅紅的離心管中加入500微升各濃度多肽 溶液，避光25 °C，250轉(zhuǎn)每分鐘搖床中振蕩過夜，采用485 nm激發(fā)，熒光光譜儀測定各濃度 下尼羅紅的熒光強(qiáng)度。圖2B展示了多肽序列5的關(guān)鍵成膠束濃度濃度變化曲線。
[0035] 2、多肽在不同濃度下的膜靶向定位 多肽與環(huán)金屬銥配位化合物[(PPy)2Ir(H2O)2] (OTf)與多肽的反應(yīng)濃度的摩爾比為1 : 1，反應(yīng)在PBS(pH 7. 4)中進(jìn)行，37°C震蕩2小時或4°C過夜。參閱圖4A和4B，在紫外光（365 nm)照射下，環(huán)金屬標(biāo)記的多肽可以產(chǎn)生綠色熒光。采用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液將環(huán)金屬銥標(biāo)記 的多肽稀釋至5微摩爾，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中使得細(xì)胞在37 °C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24小時，隨后吸除含多肽的培養(yǎng)液，加入采用37 °C預(yù)熱的含200納摩爾Lyso-Tracker Red的細(xì)胞培養(yǎng)液，37 °C，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時，隨后吸除染色液，采用培養(yǎng)液 將細(xì)胞洗兩遍后利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行共定位實(shí)驗(yàn)拍照，環(huán)金屬銥標(biāo)記多肽（Ex=405 nm), Lyso-Tracker Red (Ex=561 nm)。圖4A顯示在此濃度下銥標(biāo)記多肽定位于溶酶體中。 圖4A中，1代表是銥標(biāo)記多肽RLL (序列5)在細(xì)胞中分布情況，2代表是溶酶體的熒光探針 Lyso-Tracker Red在溶酶體中的定位，3代表1和2圖片的疊加，顯示銥標(biāo)記多肽RLL (序 列5)與Lyso-Tracker Red具有很好的突光定位效果。當(dāng)濃度為20微摩爾時，加入多肽 后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖片拍攝，圖4B顯示銥標(biāo)記多肽在此濃度下與細(xì)胞膜發(fā)生 作用引發(fā)細(xì)胞死亡。在圖4B中，1代表銥標(biāo)記多肽RLL(序列5)在細(xì)胞中的綠色熒光圖片， 2代表銥標(biāo)記多肽RLL (序列5)的細(xì)胞明場圖片，3代表1和2圖片的疊加。
[0036] 另外，本案發(fā)明人還對序列1-6的細(xì)胞毒性進(jìn)行了測試，結(jié)果詳見表1。
[0037] 應(yīng)當(dāng)理解，上述較佳實(shí)施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，目的是為了 讓熟悉本領(lǐng)域的相關(guān)人員能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不以此限制本發(fā)明的保護(hù) 范圍。凡依據(jù)本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)所做的等效變化或修飾，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0038] 表1.陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽的細(xì)胞毒注IC5tl值
【主權(quán)項】
1. 一種陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽，其特征在于包含如下所示氨基酸序列： [X1X 2X3X1X2X3X丄-NH 2，其中NH2分布于所述多肽的C端，X1為帶正電荷的極性氨基酸，X2、X 3 為非極性疏水性氨基酸，并且Xp X2、X3均為L型氨基酸，η為正整數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽，其特征在于，所述帶正電 荷的極性氨基酸為Lys或Arg。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽，其特征在于具有SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 6中任一者所不氨基酸序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽，其特征在于在遇到生物 質(zhì)膜時，所述多肽能夠形成α-螺旋構(gòu)象。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽，其特征在于所述多肽的 細(xì)胞毒性隨η的增大而增強(qiáng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽，其特征在于，當(dāng)所述多肽 的濃度低于關(guān)鍵成膠束濃度時，細(xì)胞存活率不受影響而定位于溶酶體中，而當(dāng)所述多肽的 濃度高于關(guān)鍵成膠束濃度時，所述多肽自組裝形成微膠束并與細(xì)胞膜作用而產(chǎn)生強(qiáng)烈細(xì)胞 毒性。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽，其特征在于所述多肽主 要定位于細(xì)胞內(nèi)的生物膜結(jié)構(gòu)或亞細(xì)胞器，所述生物膜結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞膜，所述亞細(xì)胞器包 括線粒體或溶酶體。8. 權(quán)利要求1-7中任一項所述的陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽在制備癌細(xì)胞檢測 試劑、抗癌藥物或抗癌藥物前體、細(xì)胞內(nèi)示蹤試劑或細(xì)胞毒性試劑中的應(yīng)用。9. 一種胞內(nèi)示蹤試劑，其特征在于主要由權(quán)利要求1-7中任一項所述的陽離子雙親性 膜靶向α-螺旋多肽通過N端的一個以上組氨酸與環(huán)金屬銥配位化合物通過配位反應(yīng)而形 成，并具備綠色熒光，所述環(huán)金屬配合物的結(jié)構(gòu)式如下：其中，I^n為C~N二齒配體，Lstjlv為溶劑分子，M _包括三氟甲基磺酸根、六氟磷酸根或 四氟硼酸根，所述C~N二齒配體包括2-苯基吡啶，1-苯基異喹啉，2-苯基苯并噻吩，苯并喹 啉，4-甲基苯基吡啶，4, 6-二氟苯基吡啶，2-(苯并噻吩）批啶，2-苯基喹啉或2, 5-二苯基 惡唑。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的胞內(nèi)示蹤試劑，其特征在于所述環(huán)金屬配合物的分子式為 [(PPy)2Ir(H 2O)2] (OTf)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽及其應(yīng)用。所述多肽包含下式所示氨基酸序列：[X1X2X3X1X2X3X1]n-NH2，其中，NH2表示C端氨基化，X1為極性帶正電荷的氨基酸，X2、X3為非極性疏水性氨基酸，n為正整數(shù)，且其中所有氨基酸均為L型氨基酸。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括：提供了一系列陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽，其具有抗癌活性，不同類型的疏水氨基酸（L，I，F(xiàn)，A等）的膜作用效果有明顯不同，且在高于關(guān)鍵成膠束濃度時可以自組裝成微膠束產(chǎn)生猛烈地細(xì)胞殺傷作用，為抗癌藥物的開發(fā)提供了新的依據(jù)。
【IPC分類】G01N33/68, A61K38/10, C07K7/08, A61K49/00, A61P35/00
【公開號】CN104974227
【申請?zhí)枴緾N201410135659
【發(fā)明人】費(fèi)浩, 曹睿, 馬曉川, 賈俊麗
【申請人】中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2014年4月4日