專利名稱：植物根內(nèi)生防細(xì)菌的快速、高效篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。是一種為拮抗植物病原真菌的植物根內(nèi)生防 細(xì)菌快速、高效篩選方法。
背景技術(shù)：
全國各地每年都會(huì)因植物病害引起植株矮小、瘦弱、黃化等不同癥狀，嚴(yán)重 時(shí)全株死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其中有80%病害屬于真菌病害。在防治方面， 化學(xué)防治雖然見效快，但易造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染，對(duì)人們身體健康產(chǎn)生潛在 的威脅；同時(shí)化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，病原菌也易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性因而導(dǎo)致防治效 果下降。細(xì)菌存在范圍廣，種類多，數(shù)量大，繁殖快，它們中有的能產(chǎn)生拮抗性 物質(zhì)，抑制病原菌，并且促進(jìn)植物的生長，所以利用細(xì)菌防治植物病害，尤其是 土傳病害，具有很大的潛力。隨著人們生活水平的提高，對(duì)食品安全性要求也在 不斷地提高，篩選出可替代化學(xué)藥劑防治植物病害的生防制劑成為迫切需要。國內(nèi)外很多學(xué)者研究證明，有許多種拮抗性細(xì)菌具有防治植物病害尤其是土 傳病害的能力，常見的有以下一些屬芽孢桿菌屬05^7'〃M)、腸桿菌屬 (五她ra&"eter)、 歐文氏菌屬(Erw'w'cr)、黃桿菌屬(F/azoZwrcten'畫)、哈夫尼菌屬 (//a> 'a)、小單孢菌屬(Mkrowow少ora)、假單胞菌屬(Psew. tfomowas)、固氮菌屬 (JzotoZwcfer)、根瘤菌屬(7 /^oZv'w附)、沙雷氏菌屬(& "http://")、鏈霉菌屬(S^e/ /cw^a 力 和黃單胞菌屬(Xaw/Zwwow必)。有的生防細(xì)菌不僅具有防病作用，同時(shí)還可以提 高種子的發(fā)芽率，還有明顯的增產(chǎn)效應(yīng)。目前，生防細(xì)菌的篩選普遍采用的步驟是，首先將植物組織研磨采用稀 釋涂布平板法分離組織內(nèi)能培養(yǎng)的絕大多數(shù)細(xì)菌，取單個(gè)菌落在平板上不斷 劃線純化后，與病原真菌平板對(duì)峙培養(yǎng)進(jìn)行篩選。如果從土壤中分離，則先 稀釋土壤懸浮液采用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法分離土壤中適合該 培養(yǎng)基的所有細(xì)菌，純化后進(jìn)行平板一一對(duì)峙培養(yǎng)或點(diǎn)接法培養(yǎng)進(jìn)行篩選。 工作量較大，重復(fù)工作較多，試驗(yàn)過程中需要的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿量大，篩選
到有生防效果的細(xì)菌概率較小，即耗時(shí)耗材。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是高效篩選防治植物真菌病害尤其是土傳病害的植物根內(nèi)生 防細(xì)菌，以達(dá)到縮短生防細(xì)菌的篩選階段，加快生防細(xì)菌的開發(fā)和應(yīng)用，使農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)實(shí)踐中植物病害得到很好的控制。本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是對(duì)已有的傳統(tǒng)分離、 篩選方法，進(jìn)行了改進(jìn)，采用改進(jìn)的TY培養(yǎng)基，稀釋平板法分離細(xì)菌，在另一 Ch+TY平板上均勻地涂上病原真菌懸浮液，然后接種菌落形狀、大小和顏色不 同的IO個(gè)細(xì)菌菌落進(jìn)行培養(yǎng)，觀察真菌周圍是否有抑菌帶出現(xiàn)，有抑菌帶出現(xiàn) 的即為目標(biāo)細(xì)菌。改目前的先稀釋平板法分離然后多次重復(fù)一一對(duì)峙培養(yǎng)篩選為 病原真菌涂布平板十對(duì)一培養(yǎng)法篩選。使生防細(xì)菌對(duì)病原真菌的拮抗能力明顯增 強(qiáng)，并且時(shí)間短，根內(nèi)生防細(xì)菌的篩選較傳統(tǒng)篩選法節(jié)省15d左右。該方法耗材 少，工作量小，僅用傳統(tǒng)方法的四分之一的材料，五分之一的工作量，篩選到的 細(xì)菌田間應(yīng)用防治效果明顯提高。具體方法如下1.細(xì)菌分離TY培養(yǎng)基的配制(適合多數(shù)細(xì)菌生長)Lactalbumin hydrolysate 2gYeast Extract 0.2gCaCl2 0.04gBacto-Agar 2.4gDistilled H20 200ml高壓滅菌 15min分離步驟1) 取約0.1g干植物根，至于表面用酒精消毒的研缽中；2) 加入lmlMgS04緩沖液，將根樣研磨成勻漿；3) 三支試管分別裝入0.9ml MgS04緩沖液；4) 準(zhǔn)備三個(gè)TY平板，培養(yǎng)皿背面標(biāo)好日期和稀釋度10—2、 l(T3、 10、5) 取0.1ml研磨的勻漿，置于第一支試管中；換一另支槍頭，混勻，從中取 0.02ml置于TY平板上，用此槍頭再取0.1ml置于第二支試管中；再換一 另支槍頭，混勻，從中取0.02ml置于另一TY平板上，依次作三個(gè)平板;6) 將三角玻璃棒浸入酒精中稍許，于酒精燈上燃燒，重復(fù)兩次；7) 用酒精消毒的三角玻璃棒涂勻TY平板，先涂l(T4，再涂l(X3，最后涂 該過程三角玻璃棒不用反復(fù)消毒；8) 將所有的平板于28'C細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.生防細(xì)菌初篩Ch+TY培養(yǎng)基的配制(適合多數(shù)真菌和細(xì)菌生長)Nutrient agar 4gYeast Extract 0.2gBacto-Agar 2g Lactalbumin hydrol.ysate O.lgDistilled H20 200ml高壓滅菌 15min 初篩步驟1) 用MgS04緩沖液將病原真菌配制成懸浮液，濃度為1(^個(gè)孢子/ml。2) 取0.02ml病原真菌懸浮液均勻地涂在Ch+TY平板上；3) l(T2的平板第二天就有菌落出現(xiàn)，用己滅菌的接菌棒挑出，接種形狀、 大小和顏色不同的10個(gè)細(xì)菌菌落于另一 Ch+TY平板上，但個(gè)別生長特快 的細(xì)菌只能一個(gè)Ch+TY平板上接種一個(gè)細(xì)菌菌落；4) 于25。C真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3. 純化培養(yǎng)2-3天，發(fā)現(xiàn)有的細(xì)菌周圍出現(xiàn)抑菌圈(不長真菌)或菌絲長得較短、 產(chǎn)生較少孢子或沒有孢子產(chǎn)生，即為目標(biāo)細(xì)菌。將其用己滅過菌的接菌棒挑出， 于另一 Ch+TY平板上劃線純化，并且劃8-10條線，換另一個(gè)無菌棒，以上一條 線為起點(diǎn)繼續(xù)劃線，于2St:細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 一天即可觀察，如果發(fā)現(xiàn)仍有 形狀、大小和顏色不同的細(xì)菌菌落，則需分別挑取繼續(xù)純化，直至每皿呈現(xiàn)形狀、 大小和顏色均相同的菌落。4. 復(fù)篩 將已純化的細(xì)菌與病原真菌于Ch+TY平板上劃平行線對(duì)峙培養(yǎng)，或于 Ch+TY平板中心點(diǎn)接入病原真菌，真菌周圍約等距離四點(diǎn)接入細(xì)菌。于25。C真 菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3.天可測定抑菌帶寬，計(jì)算抑菌率。5.生防菌保存將生防細(xì)菌接入直徑為4cm的Ch+TY培養(yǎng)皿中心，或試管斜面劃蛇形線， 28。C培養(yǎng)一天后，用封口膜封好，4t保存，備用。所用儀器設(shè)備DHP-9162A恒溫培養(yǎng)相(天津泰斯特)、DL-CJ-IN超級(jí)潔 凈工作臺(tái)(北京東聯(lián))、Y60368微量移液器(上海雷勃)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明是中國科學(xué)院重大創(chuàng)新工程項(xiàng)目"東北地區(qū)農(nóng)業(yè)水土資源優(yōu)化調(diào)控 機(jī)制與技術(shù)體系研究"專題作物病、蟲、草害生物生態(tài)控制關(guān)鍵技術(shù)研究(編 號(hào)KZCX1-SW-19-4-03)和黑龍江省"十五"重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目"主要農(nóng)作物病 蟲害可持續(xù)控制技術(shù)研究"專題大豆根腐病生物防治(編號(hào)GB01B201)中的 主要內(nèi)容。我們于2002年1月至2006年12月在中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生 態(tài)研究所按以上步驟進(jìn)行了生防細(xì)菌的篩選和中式生產(chǎn)，田間防治大豆根腐病效 果非常好，解決了生產(chǎn)實(shí)踐中大豆根腐病生物防治的難題。既獲得了經(jīng)濟(jì)效益，又獲得了生態(tài)效益。本發(fā)明的使用材料較普遍，價(jià)格便宜，成本低，所需時(shí)間短，篩選的細(xì)菌生 防效果好，達(dá)到了高效的目的。廣泛應(yīng)用防治由鐮孢菌屬/^犯rh^引起的多種 植物根部腐爛病害。本發(fā)明將縮短生防細(xì)菌的分離和篩選所需時(shí)間，進(jìn)一步保證 細(xì)菌的生防效果，加快生防細(xì)菌的開發(fā)和應(yīng)用，促進(jìn)我國生物防治的發(fā)展。
權(quán)利要求
1.一種植物根內(nèi)生防細(xì)菌的高效篩選方法，其特征在于采用改進(jìn)的TY培養(yǎng)基，稀釋平板法分離細(xì)菌，在另一Ch+TY平板上均勻地涂上病原真菌懸浮液，然后接種菌落形狀、大小和顏色不同的10個(gè)細(xì)菌菌落進(jìn)行培養(yǎng)，觀察真菌周圍是否有抑菌帶出現(xiàn)，有抑菌帶出現(xiàn)的即為目標(biāo)細(xì)菌；其方法及具體步驟如下a.細(xì)菌分離取約0.1g植物干根，至于表面用酒精消毒的研缽中，加入MgSO4緩沖液，將根樣研磨成勻漿，準(zhǔn)備三支試管分別裝入0.9ml MgSO4緩沖液并配制成10-2、10-3、10-4的稀釋液和三個(gè)TY平板，培養(yǎng)皿背面標(biāo)好日期和稀釋度10-2、10-3、10-4，分別從三支試管中取稀釋液置于一TY平板上，依次作三個(gè)平板，將三角玻璃棒浸入酒精中稍許，于酒精燈上燃燒，重復(fù)兩次，用酒精消毒的三角玻璃棒涂勻TY平板，先涂10-4，再涂10-3，最后涂10-2，該過程三角玻璃棒不用反復(fù)消毒，將所有的平板于28℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；b.生防細(xì)菌初篩配制病原真菌懸浮液，取病原真菌懸浮液均勻地涂在Ch+TY平板上，用已滅菌的接菌棒挑出每個(gè)培養(yǎng)皿形狀、大小和顏色不同的10個(gè)細(xì)菌菌落，接種于已涂真菌孢子懸浮液的Ch+TY平板上，但個(gè)別生長特快的細(xì)菌只能一個(gè)Ch+TY平板上接種一個(gè)細(xì)菌菌落，于25℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3天，發(fā)現(xiàn)有的細(xì)菌周圍出現(xiàn)抑菌帶(不長真菌)或菌絲長得較短、產(chǎn)生較少孢子或沒有孢子產(chǎn)生，即為目標(biāo)細(xì)菌；c.純化用已滅過菌的接菌棒挑出目標(biāo)細(xì)菌，于另一Ch+TY平板上劃線純化，并且劃8-10條線，換另一個(gè)無菌棒，以上一條線為起點(diǎn)繼續(xù)劃線，于28℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一天即可觀察，如果發(fā)現(xiàn)仍有形狀、大小和顏色不同的細(xì)菌菌落，則需分別挑取繼續(xù)純化，直至每皿呈現(xiàn)形狀、大小和顏色均相同的菌落；d.復(fù)篩將已純化的細(xì)菌與病原真菌于Ch+TY平板上劃平行線對(duì)峙培養(yǎng)，或于Ch+TY平板中心點(diǎn)接入病原真菌，真菌周圍約等距離四點(diǎn)接入細(xì)菌，于25℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天可測定抑菌帶寬，計(jì)算抑菌率；e.生防菌保存將生防細(xì)菌接入直徑為4cm的Ch+TY培養(yǎng)皿中心，或試管斜面劃蛇形線，28℃培養(yǎng)一天后，用封口膜封好，4℃保存，備用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，是一種快速篩選植物真菌病害尤其是土傳病害生防細(xì)菌的方法。改目前的先稀釋平板法分離然后多次重復(fù)一一對(duì)峙培養(yǎng)篩選為病原真菌涂布平板十對(duì)一培養(yǎng)法篩選，明顯提高了生防細(xì)菌篩選的效率，并且生防效果增強(qiáng)。本發(fā)明的使用材料與傳統(tǒng)方法基本相同，價(jià)格便宜，方法快捷。廣泛應(yīng)用于多種植物真菌病害生防細(xì)菌篩選，適用于從不同植物組織內(nèi)部及其器官內(nèi)分離篩選生防細(xì)菌。本發(fā)明將縮短生防細(xì)菌的分離和篩選所需時(shí)間，加快生防細(xì)菌的開發(fā)和應(yīng)用，促進(jìn)我國生物防治的發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101148647SQ20071005605
公開日2008年3月26日 申請(qǐng)日期2007年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日
發(fā)明者李春杰, 許艷麗, 馬光波 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所