專利名稱：高靈敏一次性多通道電化學(xué)免疫傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種高靈敏一次性多通道電化學(xué)免疫傳感器。它通過(guò)葡萄糖氧化酶功能 化納米復(fù)合物探針的信號(hào)放大與特異性識(shí)別，結(jié)合由絲網(wǎng)印刷電極陣列制備的一次性多通 道電化學(xué)免疫傳感器，進(jìn)行高靈敏電化學(xué)免疫分析。背景技術(shù)：
免疫分析作為一種高選擇性和高靈敏度的分析方法，在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品 安全等領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。免疫分析分為均相和異相免疫分析，后者因?yàn)槟塬@得 更高的靈敏度而被廣泛應(yīng)用。與基于放射分析，熒光，化學(xué)發(fā)光，電化學(xué)發(fā)光，表面等離子共 振等分析技術(shù)的免疫分析方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法相比，電化學(xué)免疫分析具有儀器 便宜，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。腫瘤標(biāo)志物的測(cè)定在腫瘤的診斷和早期篩查中具有 重要的意義。各種電化學(xué)免疫傳感器，尤其是安培免疫傳感器在腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)中得到 廣泛的研究和應(yīng)用。然而，在腫瘤篩查中，越來(lái)越需要高靈敏的分析方法來(lái)提高對(duì)低豐度蛋 白的準(zhǔn)確檢測(cè)。在傳統(tǒng)的電化學(xué)免疫分析方法中，大多使用單酶標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)和 檢測(cè)，分析靈敏度提高有限。在臨床診斷中，許多腫瘤標(biāo)志物并非只與某一種疾病相關(guān)，不同的腫瘤或同種腫 瘤的不同組織可能有共同的腫瘤標(biāo)志物，且一種腫瘤也往往都有多種相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。 然而，傳統(tǒng)的電化學(xué)免疫分析方法大多只能夠?qū)谓M份進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)分析流程只測(cè)定其 中一種組分含量。該分析模式所需時(shí)間長(zhǎng)，試劑消耗多，且工作量大，檢測(cè)效率較低。同時(shí)檢 測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物具有檢測(cè)時(shí)間較短，步驟較簡(jiǎn)化，樣品量較小，檢測(cè)效率較高，花費(fèi)少等 特點(diǎn)，因而在疾病診斷和腫瘤篩查中具有重要意義?；陔姌O陣列的電化學(xué)免疫傳感器近 年來(lái)在多組分免疫分析領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注。此類免疫傳感陣列通常共用一個(gè)參比電極 和一個(gè)對(duì)電極，而多個(gè)工作電極形成陣列，在不同的工作電極上測(cè)定不同的組分。然而，這 些電極陣列多采用光刻蝕等工藝制備，價(jià)格較為昂貴，且通常的電化學(xué)檢測(cè)方法建立在辣 根過(guò)氧化酶催化過(guò)氧化還原，易受到檢測(cè)溶液中溶解氧的干擾，需采用通氮?dú)獾确椒ǔ酰?操作十分不便，也不利于檢測(cè)系統(tǒng)的進(jìn)一步微型化。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以絲網(wǎng)印刷電極陣列制備多通道電化學(xué)傳感器，利用葡萄糖氧 化酶功能化納米復(fù)合物探針進(jìn)行雙電化學(xué)信號(hào)放大，建立一種可在溶解氧存在條件下的高 靈敏多通道電化學(xué)免疫檢測(cè)方法。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)在印刷電極陣列上層層組裝普魯士藍(lán)復(fù)合物、納米金和不同的捕獲抗體制得一次 性多通道免疫傳感器。通過(guò)“一鍋法”將高比例的葡萄糖氧化酶和二抗組裝在負(fù)載金納米 粒子的碳納米管上制備成納米復(fù)合物探針。在多通道免疫傳感器上進(jìn)行兩步夾心溫育后， 傳感器表面可結(jié)合與不同待測(cè)抗原含量相關(guān)的葡萄糖氧化酶功能化納米復(fù)合物。滴加檢測(cè)溶液后，被捕獲的葡萄糖氧化酶可催化溶解氧氧化葡萄糖產(chǎn)生過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫進(jìn)一步 在固定的普魯士藍(lán)媒介體作用下在電極表面還原，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，通過(guò)差分脈沖伏安法 進(jìn)行定量測(cè)定。上述的葡萄糖氧化酶功能化納米復(fù)合物是在一定條件和用量下，通過(guò)層層組裝技 術(shù)制得；多通道免疫傳感器也是在絲網(wǎng)印刷電極陣列上先后固定普魯士藍(lán)復(fù)合物和金納米 粒子，并進(jìn)一步組裝捕獲抗體制成。檢測(cè)溶液為含IOmM葡萄糖的0. 05M磷酸鹽溶液(含0. IM KCl支持電解質(zhì))；夾 心免疫每一步都用含0. 05%吐溫-20的pH 7. 0磷酸鹽沖洗液洗去多余組分；固定捕獲抗 體后用含0. 05%吐溫-20的BSA封閉液封閉非特異性位點(diǎn)?；谄咸烟茄趸腹δ芑{米復(fù)合物雙信號(hào)放大的超高靈敏一次性多通道電化 學(xué)免疫傳感器，其具體分析步驟如下(1)通過(guò)層層組裝的方法，利用聚電解質(zhì)PDDA在羧基化碳納米管上負(fù)載一層金納 米粒子，進(jìn)而一步組裝高比例的葡萄糖氧化酶和二抗制備成用作示蹤標(biāo)記物的納米復(fù)合物 探針(圖1)。(2)利用微量移液器準(zhǔn)確移取一定量的普魯士藍(lán)復(fù)合物修飾于工作電極表面，再 移取一定量的金納米粒子進(jìn)行組裝，最后用金納米粒子在不同的工作電極表面固定不同的 捕獲抗體制成多通道免疫傳感器(圖2)。(3)用沖洗液洗去免疫傳感器表面多余的捕獲抗體，封閉液封堵非特異性位點(diǎn)后 待用。(4)在免疫傳感器表面滴加樣品進(jìn)行溫育，結(jié)合待測(cè)抗原后進(jìn)一步?jīng)_洗液洗去樣 品并滴加納米復(fù)合物探針，繼續(xù)溫育形成夾心免疫復(fù)合物。(5)在免疫傳感器表面滴加檢測(cè)溶液，通過(guò)夾心免疫分析模式，用差分脈沖伏安法 進(jìn)行多通道電化學(xué)檢測(cè)。(6)從工作曲線求出樣品中不同蛋白質(zhì)(抗原)的濃度?；谄咸烟茄趸腹δ芑{米復(fù)合物雙信號(hào)放大的高靈敏一次性多通道電化學(xué) 免疫檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)成本多通道檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)原理如圖3所示，在多通道電化學(xué)免疫傳感器上，通過(guò) 兩步夾心免疫反應(yīng)，結(jié)合葡萄糖氧化酶功能化納米復(fù)合物探針，然后滴加檢測(cè)溶液于傳感 器表面，對(duì)應(yīng)工作電極上捕獲的葡萄糖氧化酶催化溶解氧氧化葡萄糖產(chǎn)生過(guò)氧化氫，由于 高比例的酶/ 二抗的的存在，以及酶的催化作用，產(chǎn)生了雙信號(hào)放大。過(guò)氧化氫在工作電極 上固定的普魯士藍(lán)媒介體作用下還原產(chǎn)生電流，通過(guò)差分脈沖伏安法檢測(cè)該電流即可實(shí)現(xiàn) 高靈敏定量分析。本檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定多種腫瘤標(biāo)志物的原理當(dāng)待測(cè)樣品中含有幾種蛋白質(zhì)(腫瘤標(biāo)志物)時(shí)，這些待測(cè)腫瘤標(biāo)志物(抗原) 在溫育過(guò)程中與傳感器表面對(duì)應(yīng)的捕獲抗體發(fā)生抗原-抗體特異性免疫結(jié)合，進(jìn)一步與納 米復(fù)合物探針進(jìn)行溫育，在傳感器上形成相應(yīng)的雙抗體夾心復(fù)合物。滴加含有葡萄糖的檢 測(cè)溶液，免疫復(fù)合物上結(jié)合的葡萄糖氧化酶可催化氧氣氧化葡萄糖產(chǎn)生過(guò)氧化氫，而固定 在傳感器上的普魯士藍(lán)媒介體催化過(guò)氧化氫的電化學(xué)還原產(chǎn)生電流信號(hào)，該信號(hào)與待測(cè)樣 品中相應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物濃度成正相關(guān)，通過(guò)工作曲線即可同時(shí)得到幾種待測(cè)腫瘤標(biāo)志物的濃度。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點(diǎn)本發(fā)明結(jié)合多通道電化學(xué)檢測(cè)手段，利用制備的納米復(fù)合物探針作為示蹤標(biāo)記物 進(jìn)行電化學(xué)信號(hào)放大，通過(guò)一次性多通道電化學(xué)免疫傳感器建立了一種高靈敏的多通道電 化學(xué)免疫檢測(cè)方法。相對(duì)現(xiàn)有于檢測(cè)系統(tǒng)，具有以下特點(diǎn)(1)通過(guò)電化學(xué)手段進(jìn)行檢測(cè)，不需要昂貴儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單。(2)整個(gè)電化學(xué)檢測(cè)建立在以絲網(wǎng)印刷電極陣列為基底構(gòu)建的一次性多通道電化 學(xué)免疫傳感器上，可一次進(jìn)行多個(gè)腫瘤標(biāo)志物的同時(shí)測(cè)定，檢測(cè)通量高，成本低廉。(3)設(shè)計(jì)了一種新穎的納米復(fù)合物探針，作為夾心免疫分析的示蹤標(biāo)記物可實(shí)現(xiàn) 雙信號(hào)放大，大大提高了檢測(cè)靈敏度，適合于低豐度蛋白質(zhì)(腫瘤標(biāo)志物)的檢測(cè)。(4)將普魯士藍(lán)電子媒介體固定在傳感器表面，可消除工作電極之間的交叉干擾。(5)利用葡萄糖氧化酶作為示蹤標(biāo)記酶，可以有效地排除傳統(tǒng)的辣根過(guò)氧化酶作 為示蹤標(biāo)記酶檢測(cè)體系中存在的溶解氧的干擾，檢測(cè)過(guò)程無(wú)需除氧，操作方便，有利于檢測(cè) 系統(tǒng)的進(jìn)一步微型化。四

圖1.葡萄糖氧化酶功能化納米探針復(fù)合物的制備示意2.免疫傳感器的制備及夾心免疫分析過(guò)程示意3.傳感器陣列上多通道免疫分析示意圖(a)尼龍片(b)銀墨(c)石墨輔助電極(d)Ag/AgCl參比電極(e)工作電極1(f) 工作電極2(g)絕緣層五具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 結(jié)合附圖1，葡萄糖氧化酶功能化納米探針的制備將多壁碳納米管在3 m2S04/HN03中超聲處理四小時(shí)，水洗至中性，烘干得羧基 化碳納米管。接著，將0. 75mg預(yù)處理過(guò)的碳納米管分散于1. 5mL含有0. 5MNaCl的0. 20% 聚電解質(zhì)PDDA中，超聲30分鐘，高速離心棄去多余的PDDA，水洗三次得到PDDA功能化碳納 米管。將該P(yáng)DDA功能化碳納米管分散于9. OmL 13-nm金膠納米粒子中，攪拌反應(yīng)20分鐘， 離心，水洗三次得到淺紫色負(fù)載金納米粒子的碳納米管復(fù)合物。接下來(lái)，將該復(fù)合物分散于 2. 5mL 50mM pH 9. OTris-HCl 溶液中，加入 1. 9mL 2mg/mL 葡萄糖氧化酶和 75 μ L 0. 5mg/mL 二抗，均勻攪拌反應(yīng)3小時(shí)，3500rpm離心15分鐘，棄去上清液，用pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液 洗滌，離心三次后將其分散于500 μ L含有0. 2 % BSA的沖洗液中保存，即得所需葡萄糖氧化 酶功能化納米復(fù)合物探針。使用前用沖洗液5倍稀釋。實(shí)施例2 結(jié)合附圖2，一次性多通道免疫傳感器的制備在室溫、不斷攪拌情況下，向16mL含有6. 25mM FeCl2,0. 4 %聚電解質(zhì)PDDA和 0. 15%殼聚糖的溶液中，緩緩滴加4mL 25mM K3Fet(CN)6]溶液，溶液逐漸變?yōu)樯钏{(lán)色，從而 生成所需的普魯士藍(lán)復(fù)合物。將絲網(wǎng)印刷電極陣列用0. lmol/L的稀硫酸于1. 3V恒電位預(yù) 氧化處理120s，洗凈晾干后于工作電極上滴加1 μ L的普魯士藍(lán)復(fù)合物，室溫放置晾干后室 溫吸附13-nm金納米粒子6小時(shí)，先后用沖洗液，pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液洗凈，晾干。在不同的普魯士藍(lán)復(fù)合物/金納米粒子修飾的工作電極表面，分別滴加0. 5 μ L 0. 5mg/mL不同的 捕獲抗體，4°C 100%濕度條件下吸附過(guò)夜，用沖洗液洗凈，晾干后滴加封閉液封閉60min， 沖液后晾干即得所需一次性多通道免疫傳感器。實(shí)施例3 結(jié)合附圖3，多通道免疫分析方法(1)在制成的多通道免疫傳感器上，滴加10 μ L不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)血清， 室溫溫育40min，用沖洗液洗凈；(2)滴加10 μ L 5倍稀釋的納米復(fù)合物探針溫育反應(yīng)40min，用沖洗液洗凈；(3)滴加含有IOmM葡萄糖的檢測(cè)溶液，于0. 30V至_0. 20V電位范圍進(jìn)行差分脈沖 伏安測(cè)定，脈沖振幅為50mV，脈沖寬度為50ms。根據(jù)記錄的電化學(xué)信號(hào)，獲得不同待測(cè)組分 的工作曲線，并對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行多通道同時(shí)測(cè)定。(4)該多通道免疫傳感器為一次性使用。實(shí)施例4 以兩種重要的腫瘤標(biāo)記物癌胚胎蛋白(CEA)和甲胎蛋白(AFP)為例， 說(shuō)明該多通道免疫傳感器的應(yīng)用所用葡萄糖氧化酶和二抗鼠單克隆抗癌胚胎蛋白(anti-CEA)和鼠單克隆抗甲 胎蛋白(anti-AFP)抗體分別組裝到負(fù)載金納米粒子的碳納米管上，以BSA封閉殘余活性位 點(diǎn)，制成兩種納米復(fù)合物探針，作為免疫分析的示蹤抗體。將鼠單克隆anti-CEA捕獲抗體 固定在傳感器陣列的工作電極1上，將鼠單克隆anti-AFP捕獲抗體固定在傳感器陣列的工 作電極2上，與CEA和AFP標(biāo)準(zhǔn)抗原混合物或血清樣品溫育40分鐘，進(jìn)一步與含anti-CEA 和anti-AFP 二抗的納米復(fù)合物探針混合溶液溫育40分鐘。最后滴加含IOmM葡萄糖的檢 測(cè)液，進(jìn)行差分脈沖伏安測(cè)定，收集所得電化學(xué)信號(hào)。先后檢測(cè)一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的信號(hào)，分 別得到CEA和AFP的工作曲線，再利用該工作曲線和檢測(cè)樣品所得的電化學(xué)信號(hào)，得到臨床 血樣中兩種腫瘤標(biāo)志物的濃度。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種高靈敏一次性多通道電化學(xué)免疫傳感器和一種新穎的葡萄糖氧化 酶功能化納米復(fù)合物探針。納米復(fù)合物探針由葡萄糖氧化酶和二抗在金納米粒子負(fù)載的碳 納米管上組裝而制得。多通道電化學(xué)免疫傳感器通過(guò)普魯士藍(lán)復(fù)合物、納米金和捕獲抗體 在一次性絲網(wǎng)印刷電極陣列上層層組裝而制成。納米復(fù)合物探針上的高比例葡萄糖氧化酶 與酶催化反應(yīng)可雙重放大夾心免疫分析的檢測(cè)信號(hào)。普魯士藍(lán)作為有效的電子傳遞媒介體 催化還原酶催化產(chǎn)物過(guò)氧化氫，產(chǎn)生電流信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于所述的多通道電化學(xué)免疫傳感器在一 次性絲網(wǎng)印刷陣列上制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于所述的一次性多通道電化學(xué)免疫傳感 器通過(guò)普魯士藍(lán)復(fù)合物、金膠納米粒子和單克隆捕獲抗體的層層組裝制得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于所用的葡萄糖氧化酶功能化納米復(fù)合 物探針通過(guò)在負(fù)載金納米粒子的碳納米管上組裝高比例葡萄糖氧化酶和二抗制得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于檢測(cè)溶液為含IOmM葡萄糖的0.05M磷 酸鹽緩沖液(含0. IM KCl為支持電解質(zhì))，pH 6. 5 ；沖洗液為含0. 05%吐溫-20的0. 05M 磷酸鹽緩沖液，PH 7. 0 ；封閉液為含0. 05%吐溫-20的2%牛血清白蛋白(BSA)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于所述的葡萄糖氧化酶功能化納米復(fù)合 物探針在普魯士藍(lán)電子傳遞媒介體作用下，放大檢測(cè)信號(hào)，避免了檢測(cè)過(guò)程中溶解氧的干 擾。
7.一種基于葡萄糖氧化酶功能化納米復(fù)合物雙信號(hào)放大的高靈敏一次性多通道電化 學(xué)免疫傳感器，其具體分析步驟如下(1)在免疫傳感器表面滴加樣品進(jìn)行溫育；(2)沖洗后，進(jìn)一步滴加納米復(fù)合物探針，溫育后再?zèng)_洗。(3)滴加檢測(cè)溶液，通過(guò)夾心免疫分析模式，用差分脈沖伏安法進(jìn)行多通道電化學(xué)檢測(cè)。(4)從工作曲線求出樣品中不同蛋白質(zhì)(抗原)的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高靈敏一次性多通道電化學(xué)免疫傳感器。在一次性印刷電極陣列上層層組裝普魯士藍(lán)復(fù)合物、納米金和捕獲抗體制得多通道免疫傳感器。在負(fù)載金納米粒子的碳納米管上組裝高比例的酶和二抗，設(shè)計(jì)了一種新穎的葡萄糖氧化酶功能化納米復(fù)合物探針，用于夾心免疫分析。將納米復(fù)合物探針與多通道免疫傳感器結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了雙重信號(hào)放大和蛋白質(zhì)的高靈敏免疫檢測(cè)。普魯士藍(lán)作為有效的電子傳遞媒介體催化還原葡萄糖氧化酶催化氧氣氧化葡萄糖產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，獲得電流信號(hào)。該方法避免了檢測(cè)溶液中溶解氧的干擾，安培檢測(cè)過(guò)程不需除氧，具有檢測(cè)濃度范圍寬、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102053161SQ20091023341
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者嚴(yán)楓, 賴國(guó)松, 鐘丹秋, 鞠熀先 申請(qǐng)人:南京大學(xué), 南京熊貓儀器儀表有限公司, 江蘇省腫瘤醫(yī)院