用于無菌性測(cè)試的盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于使細(xì)胞生長(zhǎng)的裝置，其稱為盒。細(xì)胞培育裝置包括殼體，殼體包含：具有透光窗的蓋；流體分配通道；在流體方面連接到流體分配通道上的樣本注射端口；容納多孔介質(zhì)墊的底座；以及在流體方面連接到介質(zhì)墊上的介質(zhì)注射端口。蓋匹配到底座上而形成無菌密封；流體分配通道設(shè)置在可通過光學(xué)窗觀察到的介質(zhì)墊上；以及引入流體分配通道中的樣本流體例如經(jīng)由多個(gè)通道而均勻地分配到介質(zhì)墊。本發(fā)明還提供套件，其包括本發(fā)明的盒和管道組。
【專利說明】用于無菌性測(cè)試的盒
[0001]與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求2011年9月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/556, 390以及2012年4月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)N0.61/624，499，它們中的各個(gè)通過引用而結(jié)合在本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及細(xì)胞生長(zhǎng)和檢測(cè)的領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0003]在許多行業(yè)中，特別是在食品、飲料、醫(yī)療保健、電子和制藥行業(yè)中，快速地分析樣本被微生物(諸如細(xì)菌、酵母或霉菌)污染的程度是重要的。
[0004]—種稱為微生物計(jì)數(shù)或菌落計(jì)算的微生物培育技術(shù)對(duì)樣本中的微生物細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行量化?；诂F(xiàn)場(chǎng)微生物復(fù)制的微生物計(jì)數(shù)方法大體為樣本中的各個(gè)可培育的微生物細(xì)胞或細(xì)胞群產(chǎn)生一個(gè)可通過視覺檢測(cè)的“菌落”，這稱為菌落形成單元或CFU。因而，計(jì)算可見菌落允許微生物學(xué)家精確地確定樣本中的微生物CFU的數(shù)量。為了執(zhí)行微生物計(jì)數(shù)，細(xì)菌細(xì)胞可散布在佩特里(Petri)培養(yǎng)皿(“瓊脂板”)中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂的表面上且在容許現(xiàn)場(chǎng)細(xì)菌復(fù)制的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。微生物計(jì)數(shù)是簡(jiǎn)單的、非常敏感的、廉價(jià)的且是定量的，但是典型地也是慢的。所需的長(zhǎng)時(shí)間導(dǎo)致醫(yī)療保健和制造的成本增加。
[0005]需要另外的培育裝置和方法來進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供用于使生長(zhǎng)細(xì)胞的裝置，其稱為盒(cassette)。一方面，本發(fā)明的特征在于細(xì)胞培育裝置，其包括殼體，殼體包含:具有透光窗的蓋(蓋可為可移除或可為不可移除的)；流體分配通道，例如，其為單個(gè)通道或連接到多個(gè)通道上；樣本注射端口，其在流體方面連接到流體分配通道；容納多孔介質(zhì)墊的底座；以及介質(zhì)注射端口，其在流體方面連接到介質(zhì)墊。蓋匹配到底座上而形成無菌密封；流體分配通道設(shè)置在可通過光學(xué)窗觀察到的介質(zhì)墊上；并且引入到流體分配通道中的樣本流體例如經(jīng)由多個(gè)通道而均勻地分配到介質(zhì)墊。在某些實(shí)施例中，裝置進(jìn)一步包括設(shè)置在介質(zhì)墊上的隔膜，其中，樣本流體中的細(xì)胞保留在隔膜上，并且可通過光學(xué)窗觀察到。備選地，介質(zhì)墊可具有足夠的孔隙率，以用作隔膜。蓋和隔膜之間的空間可進(jìn)行加壓。在其它實(shí)施例中，盒進(jìn)一步包括排泄端口。還可包括氧清除劑，其足以使裝置的內(nèi)部無氧。在某些實(shí)施例中，盒進(jìn)一步包括用于氧清除劑的促動(dòng)器，例如，通過翻轉(zhuǎn)蓋或通過拉片或推桿來啟動(dòng)促動(dòng)器，通過位于盒的頂部上的隔膜而接近拉片或推桿。本發(fā)明的盒可包括釋壓閥，并且/或者底座可進(jìn)一步包括通道，在引入流體時(shí)，通道釋放介質(zhì)墊中的壓力。盒還可包括介質(zhì)分配通道，介質(zhì)分配通道連接到介質(zhì)注射端口上且可選地圍繞介質(zhì)墊的周緣具有多個(gè)出口，其中，經(jīng)由介質(zhì)注射端口引入的介質(zhì)經(jīng)由介質(zhì)分配通道而均勻地分配到介質(zhì)墊。介質(zhì)分配通道可完全或部分地由底座中的插件形成，例如，圖中描繪的流體環(huán)。盒還可包括氧指示器。在某些實(shí)施例中，流體分配通道包括例如連接到多個(gè)通道上的螺旋導(dǎo)槽。當(dāng)流體分配通道為單個(gè)通道時(shí)，其可圍繞介質(zhì)墊包括傾斜周向區(qū)域。盒還可包括設(shè)置在流體分配通道的頂部上的覆蓋物。覆蓋物可確定流體流的形狀，以通過單個(gè)通道而實(shí)現(xiàn)向介質(zhì)墊的均勻分配。盒還可進(jìn)一步包括通氣端口，其用于在引入液體時(shí)對(duì)盒的內(nèi)部進(jìn)行通氣。通氣端口可為自密封的，例如，直到連接到本發(fā)明的管道組上。
[0007]在相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于用于檢測(cè)細(xì)胞的套件，其包括本發(fā)明的盒，以及管道組，管道組包括具有連接器的管道，連接器具有針且匹配到樣本注射端口、介質(zhì)注射端口、通氣端口或排泄端口上。連接器可進(jìn)一步包括隔片，針穿過隔片，并且連接器可匹配到樣本注射端口、介質(zhì)注射端口、通氣端口或排泄端口上，并且當(dāng)針和管道被移除時(shí)，與隔片一起密封端口。套件可進(jìn)一步包括第二管道組和可選的第三管道組，它們具有連接器，連接器具有針，其中，管道組的連接器匹配到樣本注射端口、介質(zhì)注射端口、通氣端口和排泄端口中的一個(gè)上。第一管道組、第二管道組和可選的第三管道組的管道可共享公共入口或出口。連接器可包括夾具，夾具搭扣到盒中。管道組可進(jìn)一步包括多個(gè)單獨(dú)的管道，用于進(jìn)行下者中的至少兩個(gè):樣本引入、介質(zhì)引入、排泄和通氣。連接器可包括用于各個(gè)管道的針。當(dāng)一個(gè)管道用于通氣時(shí)，該管道可包括過濾器(例如，以防止細(xì)菌或流體的釋放)和/或釋壓閥。
[0008]本發(fā)明的盒和套件可在用于細(xì)胞的生長(zhǎng)、化驗(yàn)或維持(maintaine)的任何方法中使用，包括計(jì)數(shù)、檢測(cè)、診斷或治療反應(yīng)。
[0009]根據(jù)以下描述和權(quán)利要求，其它特征和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1A和IC是盒的分解視圖。圖1B是盒的橫截面。圖1D是盒的底座的橫截面，其示出介質(zhì)注射端口、排泄端口、介質(zhì)墊和介質(zhì)分配通道。圖1E是移除了蓋的盒的視圖，其顯示用于氧清除劑的托盤。如在插圖中顯示的那樣，底座包括兩個(gè)止動(dòng)件。第一止動(dòng)件允許蓋密封盒，而不促動(dòng)氧清除劑。通過將蓋翻轉(zhuǎn)到第二止動(dòng)件，蓋上的突出部刺穿氧清除劑上的密封件。圖1F是備選蓋實(shí)施例的圖。
[0011]圖2A是盒的一個(gè)實(shí)施例的分解視圖。圖2B是盒的橫截面。圖2C是用于有氧和無氧用途的盒的圖。
[0012]圖3A是盒的一個(gè)實(shí)施例的分解視圖。圖3B是有氧盒的橫截面。圖3C是無氧盒的橫截面。圖3D是用于有氧和無氧用途的盒的圖。
[0013]圖4A是盒的一個(gè)實(shí)施例的分解圖。圖4B是無氧盒的橫截面。
[0014]圖5A-5B是盒的俯視圖，盒包括具有螺旋導(dǎo)槽的流體分配通道，螺旋導(dǎo)槽具有兩個(gè)螺旋線。
[0015]圖5C是盒的俯視圖，盒包括外部導(dǎo)槽和具有多個(gè)通道的內(nèi)部導(dǎo)槽。
[0016]圖是盒的俯視圖，盒包括外部導(dǎo)槽和具有單個(gè)通道的內(nèi)部導(dǎo)槽。
[0017]圖6A是具有多個(gè)通道的流體分配通道的圖，其中覆蓋物就位。圖6B是移除了覆蓋物的流體分配通道的圖。圖6C是覆蓋物的圖。
[0018]圖7A是具有單個(gè)通道的流體分配通道的圖，其中覆蓋物就位。圖7B是移除了覆蓋物的流體分配通道的圖。圖7C是覆蓋物的圖。
[0019]圖8是盒底座的圖。
[0020]圖9A是本發(fā)明的管道組的示意性描繪。管道組具有匹配到盒上的三個(gè)連接器，以及用于在樣本或介質(zhì)輸送或廢料移除中使用的安全鎧裝針。圖9B是管道組的示意性描繪，管道組的隔片在使用之后保留在盒中。在這個(gè)示例中，連接器包括凹槽，凹槽搭扣到包圍盒上的端口的對(duì)應(yīng)的特征上。
[0021]圖1OA是本發(fā)明的管道組的示意性描繪。管道組具有終止在匹配到盒上的帶鍵針夾具中的三個(gè)連接器(例如分支)，以及用于在樣本或介質(zhì)輸送或廢料移除中使用的安全鎧裝針(未顯示)。每個(gè)盒存在兩個(gè)流體管線。圖1OB是安裝在盒中的管道組的示意性描繪。帶鍵針夾具規(guī)定管道組僅可以預(yù)先限定的定向插入。
[0022]圖1lA是本發(fā)明的管道組的示意性描繪。管道組具有終止在匹配到盒上的帶鍵針夾具中的三個(gè)連接器(例如分支)，以及用于在樣本或介質(zhì)輸送或廢料移除中使用的安全鎧裝針(未顯示)。每個(gè)盒存在三個(gè)流體管線。顯示的通氣管線連結(jié)到公共閥和過濾器上，但是管道組可對(duì)各個(gè)盒采用單獨(dú)的通氣管線。圖1lB是安裝在盒中的管道組的示意性描繪。帶鍵針夾具規(guī)定管道組僅可以預(yù)先限定的定向插入。
[0023]圖12示出包裝好的測(cè)試套件的一個(gè)可行變型，其中，透氣的接近面板被移除。
[0024]圖13是一系列顯微照片，其顯示本發(fā)明的盒中的細(xì)菌的生長(zhǎng)。
[0025]圖未必按比例繪制。

【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明的特征在于捕捉和培育細(xì)胞(例如，微生物或包含微生物的細(xì)胞)的裝置和使用這些裝置的方法。一個(gè)示例是包含營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)的盒，其可用于自動(dòng)快速計(jì)數(shù)系統(tǒng)中，諸如Growth Direct ?系統(tǒng)(馬薩諸塞的貝德福德的Rapid Micro B1systems公司),例如，如美國(guó)公開N0.2003/0082516中描述的那樣，該公開通過引用而結(jié)合在本文中。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供完全包含的閉環(huán)無菌性測(cè)試，這允許終端使用者通過隔膜(例如，
0.45 μ m)過濾樣本,添加營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)來支持生長(zhǎng)和例如在Growth Direct "*系統(tǒng)上對(duì)盒成像，而不使樣本或其它內(nèi)部構(gòu)件暴露于可能的外部污染。盒可用于有氧或無氧條件下。多個(gè)盒可在套件中包裝在一起，例如，至少一個(gè)盒將構(gòu)造成進(jìn)行有氧測(cè)試，并且一個(gè)構(gòu)造成進(jìn)行無氧測(cè)試。本發(fā)明還提供管道組來允許引入樣本、營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)和/或排出過量流體。管道組還可允許在多個(gè)盒中均勻地分配樣本。
[0027]盒
大體上，本發(fā)明的盒將包括:具有透光窗的蓋；流體分配通道；在流體方面連接到流體分配通道的樣本注射端口 ；容納多孔介質(zhì)墊的底座；以及在流體方面連接到介質(zhì)墊的介質(zhì)注射端口。樣本注射端口典型地位于蓋的側(cè)部上，但是還可位于頂部上。在某些實(shí)施例中，蓋由透光材料制成。備選地，透光窗容納在光學(xué)框架內(nèi)。
[0028] 在某些實(shí)施例中，流體分配通道包括多個(gè)通道。這種盒的多個(gè)視圖顯示在圖1A-1F中。圖顯示具有透光窗的蓋、容納介質(zhì)墊的底座、樣本注射端口、介質(zhì)注射端口和流體分配通道，流體分配通道包括穩(wěn)定通道，以及用于將樣本分配到介質(zhì)墊的多個(gè)通道。還顯示了排泄端口和隔膜，隔膜可為可移除的或可為不可移除的。典型地，蓋匹配到底座上而形成無菌密封，該無菌密封可為氣密性的或可為不是氣密性的。隔膜定位在介質(zhì)墊上，以便可通過光學(xué)窗觀察到。圖1F顯示蓋，其由透光材料制成或具有容納在光學(xué)框架內(nèi)的透光窗。樣本注射端口位于蓋的頂部上，但是還可位于側(cè)部上。
[0029]圖2A-2C中顯示的備選盒的多個(gè)視圖。圖顯示具有透光窗的蓋、容納介質(zhì)墊的底座、樣本注射端口、介質(zhì)注射端口和流體分配通道，流體分配通道包括穩(wěn)定通道，以及用于將樣本分配到介質(zhì)墊的多個(gè)通道。還顯示了排泄端口和隔膜，隔膜可為可移除的或可為不可移除的。典型地，蓋匹配到底座上而形成無菌密封，無菌密封可為氣密性的或可為不是氣密性的。隔膜定位在介質(zhì)墊上，以便可通過光學(xué)窗觀察到。圖2C顯示蓋，其具有容納在光學(xué)框架內(nèi)的透光窗。備選地，蓋由透光材料制成。樣本注射端口位于蓋的側(cè)部上，但是還可位于頂部上。這個(gè)盒的特征在于蓋中的釋壓閥。
[0030]圖3A-3D中顯示了另一個(gè)盒的多個(gè)視圖。圖顯示具有透光窗的蓋、容納介質(zhì)墊的底座、樣本注射端口、介質(zhì)注射端口和流體分配通道，流體分配通道包括穩(wěn)定通道和用于將樣本分配到介質(zhì)墊的多個(gè)通道。還顯示了排泄端口和隔膜，隔膜可為可移除的或可為不可移除的。典型地，蓋匹配到底座上而形成無菌密封，無菌密封可為氣密性的或可為不是氣密性的。隔膜定位在介質(zhì)墊上，以便可通過光學(xué)窗觀察到。圖3B和3C顯示這個(gè)盒的有氧和無氧版本。圖3D顯示蓋，其具有容納在光學(xué)框架內(nèi)的透光窗。備選地，蓋由透光材料制成。樣本注射端口位于蓋的側(cè)部上，但是還可位于頂部上。蓋還包括通氣端口(圖3D)。
[0031 ] 本發(fā)明的盒可包括流體分配通道，流體分配通道通過單個(gè)通道將流體輸送到介質(zhì)墊上。這種盒顯示在圖4A-4B中。圖顯示具有透光窗的蓋、容納介質(zhì)墊的底座、樣本注射端口、介質(zhì)注射端口和流體分配通道，流體分配通道包括用于將樣本分配到介質(zhì)墊的穩(wěn)定通道。還顯示了排泄端口和隔膜，隔膜可為可移除的或可為不可移除的。典型地，蓋匹配到底座上而形成無菌密封，無菌密封可為氣密性的或可為不是氣密性的。隔膜定位在介質(zhì)墊上，以便可通過光學(xué)窗觀察到。樣本注射端口位于蓋的側(cè)部上，但是還可位于頂部上。蓋還包括通氣端口。
[0032]流體分配通道可包括或可不包括螺旋導(dǎo)槽。螺旋導(dǎo)槽設(shè)計(jì)成平息過量湍流，并且例如經(jīng)由多個(gè)通道將樣本均勻地分配到介質(zhì)墊或定位在介質(zhì)墊的頂部上的隔膜。如顯示在圖5A-5C中，導(dǎo)槽典型地包括圍繞裝置的兩個(gè)環(huán)路，但是可采用三個(gè)或更多個(gè)環(huán)路。當(dāng)存在時(shí)，導(dǎo)槽可經(jīng)由單個(gè)通道或多個(gè)通道(圖5A-5D)將流體提供給介質(zhì)墊。圖顯示采用單個(gè)流體分配通道的備選盒。如圖5D中顯示,盒包括沿周向包圍介質(zhì)墊的傾斜表面。流體圍繞表面流動(dòng)且流到介質(zhì)墊上。在具有通往介質(zhì)墊的多個(gè)通道的盒中，還可在傾斜周向表面上或傾斜周向表面中形成多個(gè)通道。盒可包括或可不包括覆蓋流體分配通道的構(gòu)件，流體分配通道具有或不具有螺旋導(dǎo)槽或多個(gè)通道，例如，圖1A-4B。用于多個(gè)通道的示例性覆蓋物顯示在圖6A-6C中。圖6A顯示具有多個(gè)通道的流體分配通道，其中覆蓋物就位。圖6B顯示具有多個(gè)通道的流體分配通道。圖6C顯示用于多個(gè)通道的覆蓋物。用于單個(gè)流體分配通道的示例性覆蓋物顯示在圖7A-7C中。圖7A顯示具有單個(gè)通道的流體分配通道，其中覆蓋物就位。圖7B顯示單個(gè)流體分配通道。圖7C顯示用于單個(gè)通道的覆蓋物。這個(gè)覆蓋物包括流體操縱器，其隨著流體分配通道進(jìn)入傾斜周向區(qū)域而減小流體分配通道的柱高度。流體操縱器還可使流體沿著通往介質(zhì)墊的表面散開。盒還可包括定位在流體分配通道上面的防濺罩，其中，樣本輸送到介質(zhì)墊。防濺罩可形成覆蓋物的端口或?yàn)閱为?dú)的構(gòu)件。介質(zhì)墊和隔膜(如果存在的話)的邊緣典型地被流體分配通道或覆蓋物或防濺罩覆蓋，以防止邊緣被成像。
[0033]介質(zhì)墊設(shè)計(jì)成容納用于細(xì)胞的生長(zhǎng)或維持的介質(zhì)。在某些實(shí)施例中，介質(zhì)墊的大小設(shè)置成容納足夠的介質(zhì)，以便細(xì)胞生長(zhǎng)一個(gè)星期、兩個(gè)星期或更長(zhǎng)時(shí)間。介質(zhì)經(jīng)由介質(zhì)注射端口輸送到墊。介質(zhì)注射端口典型地位于底座的側(cè)部或底部上。盒還可包括連接到介質(zhì)注射端口上的介質(zhì)分配通道。介質(zhì)分配通道可圍繞介質(zhì)墊的周緣具有多個(gè)出口，以將介質(zhì)均勻地分配到介質(zhì)墊。具有介質(zhì)墊的示例性底座顯示在圖8中。
[0034]當(dāng)介質(zhì)引入盒中時(shí)，介質(zhì)為液體，并且介質(zhì)可在墊中保持為液體或在墊內(nèi)呈凝膠或以別的方式凝固。示例包括LB液體培養(yǎng)基或沙保(Sabouraud)葡萄糖瓊脂(SDA)、R2A瓊脂、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)、平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)、Schaedler血瓊脂或沒有瓊脂凝固劑的類似介質(zhì)。隔膜可置于介質(zhì)墊上，例如，置于流體分配通道和墊之間。隔膜具有足以保留關(guān)注的細(xì)胞同時(shí)使流體穿過的孔?？状笮〉氖纠秊?.45μπι和0.22μπι。隔膜可與介質(zhì)墊分開或與介質(zhì)墊成整體。備選地，介質(zhì)墊的表面可經(jīng)過制造或處理，以產(chǎn)生隔膜。
[0035]盒可包括或可不包括氧清除劑，氧清除劑使盒無氧(例如，圖1Ε、2Α和3Α)。氧清除劑典型地在盒內(nèi)存儲(chǔ)在密封托盤或隔室中，其在盒內(nèi)部的確切位置不是關(guān)鍵的。一旦樣本和介質(zhì)已經(jīng)輸送到盒，然后就可破壞密封。用于破壞密封的各種方法在本領(lǐng)域是已知的。在一個(gè)實(shí)施例中，密封的隔室位于蓋(或底座)上的突出部附近。蓋可翻轉(zhuǎn)，以使突出部刺破清除劑上的密封件(圖1Ε)。還可通過拉片進(jìn)行促動(dòng)，通過位于盒的外側(cè)上的隔膜或隔片(圖2Α和3Α)來接近拉片。示例性氧清除劑包括氧化鐵、葡糖氧化酶或類似的試劑。盒還可包括內(nèi)部氧含量的指示器，其位于盒的內(nèi)部中。適當(dāng)?shù)闹甘酒髟诒绢I(lǐng)域中是已知的。
[0036]盒的入口和出口端口優(yōu)選為自密封的，例如，橡膠隔片或其它自關(guān)閉閥。如下面論述的那樣，盒可設(shè)置成不具有自密封部分，自密封部分在使用之前進(jìn)行安裝。除了樣本注射端口和介質(zhì)注射端口之外，盒可包括例如位于底座的底部或側(cè)部上的排泄端口。盒可包括或可不包括用以控制盒內(nèi)部的最大壓力的釋壓閥。蓋和隔膜之間的空間也可進(jìn)行加壓，例如，以防止過量介質(zhì)匯聚在墊的頂部上或通過隔膜泄露。底座還可包括通道或其它區(qū)域，以允許在對(duì)墊引入介質(zhì)期間釋放壓力。
[0037]優(yōu)選地，盒能夠在載體中堆疊，例如，載體設(shè)計(jì)成將一組盒轉(zhuǎn)移和引入到自動(dòng)成像儀器。盒的這種自動(dòng)搬運(yùn)可包括運(yùn)輸、在盒和載體之間的對(duì)接、用于自動(dòng)搬運(yùn)的定位，以及機(jī)械手轉(zhuǎn)移的能力。盒還可設(shè)計(jì)成允許可重復(fù)的機(jī)械定位，即，反復(fù)地能夠使同一盒返回到同一位置，以進(jìn)行自動(dòng)成像。
[0038]盒還可包括有利于多個(gè)像對(duì)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)特征。成像基準(zhǔn)標(biāo)記包括在熒光塑料或介質(zhì)上的貫通孔口。成像基準(zhǔn)標(biāo)記還包括在盒上的印刷的或壓印的熒光材料。其它基準(zhǔn)標(biāo)記在本領(lǐng)域是已知的。
[0039]在本領(lǐng)域中已知用于制造盒的各種構(gòu)件的材料。這樣的材料包括塑料、聚合物、金屬、玻璃和陶瓷。在各種實(shí)施例中，盒有利于例如通過采用具有與這種檢測(cè)相當(dāng)?shù)臒晒鈱傩缘牟牧蠈?duì)包含少于500個(gè)細(xì)胞的自發(fā)熒光微生物微菌落的自動(dòng)成像。示例性材料是黑K-Resin?(苯乙烯-丁二烯-共聚物；Chevron Phillips公司)。盒還可采用具有與自發(fā)熒光微生物微菌落的檢測(cè)相當(dāng)?shù)臒晒鈱傩缘耐该魃w。蓋的示例性材料為Zeonor?1060R(聚環(huán)烯樹脂；Zeon Chemicals LP公司)。還可采用玻璃。還可采用多孔隔膜，其具有與自發(fā)熒光微生物微菌落的檢測(cè)相當(dāng)?shù)臒晒鈱傩?。隔膜可由包括下者的材料制?纖維素、醋酸纖維素、聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯對(duì)苯二甲酯、聚烯烴、乙烯-醋酸乙烯酯、聚丙烯、聚砜、聚四氟乙烯、尼龍和硅酮共聚物。隔膜的選擇部分地取決于要培育的細(xì)胞的類型(例如，附連到表面上(取決于錨定(anchorage))而生長(zhǎng)的微生物、在懸浮液中生長(zhǎng)的微生物(獨(dú)立于錨定)或附連到表面上或在懸浮液中生長(zhǎng)的微生物)、滲透度和流體和氣體的轉(zhuǎn)移速率。示例性隔膜為黑混合纖維素酯隔膜(Sartorius AG公司)。盒的將不成像的部分可由任何適當(dāng)?shù)牟牧现瞥?，例如，丙烯?丁二烯-苯乙烯或丙烯腈苯乙烯。示例性介質(zhì)墊由燒結(jié)聚乙烯(Porex公司)形成，燒結(jié)聚乙烯可提供預(yù)先限定的孔大小和孔空間。
[0040]管道組
本發(fā)明還提供管道組，其允許與盒進(jìn)行無菌連接。管道組包括至少一個(gè)連接器，其與本發(fā)明的盒的入口或出口端口匹配。可使管道的另一端開口，例如，以進(jìn)行排泄或滑到噴嘴或其它流體源或槽。備選地，另一端可包含連接器，例如魯爾(Luer)鎖、針或類似的配件。管道組可設(shè)計(jì)成將流體從一個(gè)源輸送到多個(gè)盒或入口或從多個(gè)盒或出口移除流體。各個(gè)管道組可由單獨(dú)的泵促動(dòng)，例如，蠕動(dòng)泵，或多個(gè)管道組可由單個(gè)泵促動(dòng)。
[0041 ] 在一個(gè)實(shí)施例中，與盒匹配的連接器包括針，針被防護(hù)件包圍，使得針的尖部相對(duì)于防護(hù)件的邊緣向后間隔開。防護(hù)件匹配到盒上的端口上，并且針提供流體連接，以輸送或移除流體。在圖9A-9B中顯示的具體實(shí)施例中，連接器包括包圍針的隔片。連接器匹配到盒上的端口上和鎖定就位。一旦完成流體輸送或移除，就可移除針和管道，而使隔片就位，從而密封盒(圖9B)。
[0042]在圖10A-10B中顯示的另一個(gè)實(shí)施例中，連接器包括兩個(gè)單獨(dú)的流體管線，即，管道，其各自具有其自己的針，并且構(gòu)造成防止不恰當(dāng)?shù)匕惭b到盒中。在這個(gè)構(gòu)造中，連接器搭扣就位，從而對(duì)使用者提供關(guān)于已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了恰當(dāng)?shù)牟迦氲恼答?圖10B)。流體管線的數(shù)量可如特定用途所需要的那樣增加。圖11A-11B顯示管道組的示例，其包括三個(gè)流體管線，管線中的一個(gè)提供釋壓。釋壓管線可包括釋壓閥和過濾器，如顯示的那樣。一旦完成流體輸送或移除，就可通過輕輕地?cái)D壓連接器同時(shí)將其拉離盒來移除針和管道。
[0043]可通過與針進(jìn)行額外的連接來另外接近盒。連接器可通過任何適當(dāng)?shù)臋C(jī)構(gòu)與盒匹配，例如，螺紋、魯爾鎖、摩擦配合和搭扣配合。一個(gè)或多個(gè)管道組(例如，各自用于樣本和介質(zhì)輸送和廢料移除)還可在套件中與一個(gè)或多個(gè)盒包裝在一起。
[0044]管道組的管道可由任何適當(dāng)?shù)牟牧现瞥?，諸如聚乙烯、聚四氟乙烯和Tygon?柔性管道。連接器和針可由金屬(例如不銹鋼)、塑料、陶瓷或其組合制成。
[0045]使用方法
本發(fā)明的盒和管道組可用于細(xì)胞的生長(zhǎng)或維持，包括檢測(cè)、計(jì)數(shù)、診斷和治療反應(yīng)。示例性使用領(lǐng)域包括測(cè)試液體、空氣或表面樣本的微生物負(fù)載；測(cè)試工業(yè)樣本、無菌制藥產(chǎn)品樣本、非無菌制藥產(chǎn)品樣本的微生物負(fù)載；以及測(cè)試樣本的無氧微生物負(fù)載?？山Y(jié)合本文描述的盒來采樣任何可培育的細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、藍(lán)藻細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或其它真核細(xì)胞。盒可用于有氧和無氧測(cè)試。盒可包裝在無菌套件中或通過最終使用者來滅菌(圖12)。盒將典型地用于使用層流罩或隔離室的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中。
[0046]在典型的實(shí)驗(yàn)中，盒被滅菌，或盒設(shè)置成預(yù)先滅菌的。漂洗前流體、樣本介質(zhì)流體和漂洗后流體通過樣本注射端口引入。在進(jìn)入盒之后，流體將行進(jìn)通過流體分配通道，流體分配通道可包括螺旋的穩(wěn)定通道，以在流體傳送穿過隔膜的面之前平息過量的湍流。穿過隔膜的面將這些流體引入密封室中可導(dǎo)致陷在盒中的殘余空氣在流體柱上升時(shí)壓縮，導(dǎo)致對(duì)光學(xué)窗的下側(cè)形成保護(hù)性阻隔。在完成采樣和漂洗步驟之后，額外的空氣可泵送到盒中，以確保所有流體被迫通過隔膜和/或介質(zhì)墊。這可導(dǎo)致隔膜上方的室被加壓。
[0047]營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)然后經(jīng)由介質(zhì)注射端口泵送到介質(zhì)墊中。介質(zhì)被介質(zhì)墊吸收，并且提供食品源達(dá)規(guī)定的時(shí)間段，例如，至少7或14天。可使用例如具有0.45 μ m孔大小的隔膜以及蓋和隔膜之間的室的加壓來阻止過量的營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)傳送通過隔膜。
[0048]當(dāng)存在排泄端口時(shí)，過量的樣本或介質(zhì)流體可經(jīng)由排泄端口從盒移除。備選地，過量的樣本流體可經(jīng)由介質(zhì)注射端口移除。預(yù)先設(shè)定量的介質(zhì)還可經(jīng)由介質(zhì)注射端口輸送，在盒內(nèi)部移置的氣體通過樣本注射端口、通氣端口或釋壓閥進(jìn)行通氣。其它構(gòu)造是可行的。
[0049]盒優(yōu)選能夠處理大量流體，例如，2升樣本和2升漂洗溶液。流體的確切量將取決于樣本。
[0050]盒可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▉頊缇?。例如通過環(huán)氧乙烷進(jìn)行的氣體滅菌可通過下者來執(zhí)行:用氣體對(duì)盒加壓，保留氣體達(dá)預(yù)先確定的時(shí)間量，以及在高真空下排空氣體。
[0051]在一個(gè)實(shí)施例中，在完成過濾過程和營(yíng)養(yǎng)物轉(zhuǎn)移之后，盒置于處于預(yù)先限定的溫度的培養(yǎng)器中(例如，在Growth Direct?系統(tǒng)內(nèi))且進(jìn)行存儲(chǔ)，同時(shí)等待成像。在預(yù)先限定的時(shí)間間隔下，盒被自動(dòng)取出且發(fā)送通過成像站，在成像站中，它經(jīng)歷特定波長(zhǎng)的高強(qiáng)度的激勵(lì)光。作為響應(yīng)，存在于隔膜上的任何微生物生長(zhǎng)將自然地發(fā)熒光。借助于光學(xué)濾波器和CCD攝像機(jī)捕捉熒光像，并且記錄發(fā)熒光對(duì)象。隨著時(shí)間的推移，捕捉后續(xù)的像，并且測(cè)量和監(jiān)測(cè)這些發(fā)熒光對(duì)象，以測(cè)量生長(zhǎng)。滿足生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)的那些被看作菌落。其它發(fā)熒光對(duì)象被特征化為碎屑。
[0052]現(xiàn)在將關(guān)于某些優(yōu)選的實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明。
[0053]本發(fā)明的盒容納0.45微米黑混合纖維素酯過濾隔膜，其由燒結(jié)聚乙烯珠制成的介質(zhì)墊支承。包含混合微生物的樣本經(jīng)由螺動(dòng)泵被泵送通過Tygon? S-50-HL管道而進(jìn)入盒的樣本注射端口中。在樣本添加期間，在介質(zhì)注射端口上的管道被密封，并且在排泄端口上的管道打開。在后面的樣本添加過程中泵送Fluid D(蛋白胨-吐溫80沖洗流體)，之后是添加空氣來迫使所有流體通過隔膜，并且將上部室加壓到1psi。然后利用夾具密封樣本注射端口，并且介質(zhì)注射端口被打開。液態(tài)Schaedler血介質(zhì)經(jīng)由介質(zhì)注射端口添加，并且泵送到隔膜下方的介質(zhì)墊中，以用生長(zhǎng)介質(zhì)更換Fluid D漂洗液。
[0054]然后從所有端口移除管道，并且利用封口膜(Parafilm)密封端口。盒在32.5°C下進(jìn)行培養(yǎng)。在不同時(shí)間間隔手動(dòng)地將盒置于成像器中(在像之間進(jìn)行培養(yǎng))。大約600瓦/厘米2的處于460-500nm的激勵(lì)光由藍(lán)LED提供，藍(lán)LED經(jīng)過光學(xué)帶通濾波器調(diào)節(jié)。505-550nm的帶通濾波器允許發(fā)射的光被CXD攝像機(jī)捕捉。
[0055]為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，在將盒置于成像器之前移除蓋，并且在繼續(xù)培養(yǎng)之前更換蓋。成像器在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)捕捉九個(gè)平鋪像，并且這些像接合在一起，以顯示完整的盒。盒的對(duì)準(zhǔn)通過眼睛和手動(dòng)進(jìn)行。
[0056]圖13中的時(shí)間序列顯示盒中生長(zhǎng)的微生物菌落的熒光像。雖然開始時(shí)存在碎屑顆粒，但是生長(zhǎng)的微生物的熒光隨著時(shí)間的推移而增加。可使用軟件算法而將生長(zhǎng)的熒光點(diǎn)檢測(cè)為生長(zhǎng)的菌落，并且可在它們還小時(shí)進(jìn)行識(shí)別，這部分地由于非放大成像系統(tǒng)的分辨率的原因。圖13中的最后的面板顯示在培養(yǎng)時(shí)期結(jié)束時(shí)用數(shù)碼攝像機(jī)在常規(guī)照明下獲得的盒的像。如通過比較最后兩個(gè)面板可看到的那樣，在熒光菌落和常規(guī)像之間的一對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
[0057]其它實(shí)施例
上面的說明書中提到的所有公開、專利和專利申請(qǐng)通過引用而結(jié)合在本文中。在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)的各種修改和變型對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。雖然結(jié)合具體實(shí)施例來描述本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)當(dāng)不恰當(dāng)?shù)叵抻谶@樣的具體實(shí)施例。實(shí)際上，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的用于執(zhí)行本發(fā)明的描述的模式的各種修改意圖處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0058]其它實(shí)施例在權(quán)利要求中。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞培育裝置，其包括殼體，所述殼體包含: i)蓋，其具有透光窗； ii)流體分配通道； iii)在流體方面連接到所述流體分配通道上的樣本注射端口； iv)包括多孔介質(zhì)墊的底座；以及 V)在流體方面連接到所述 介質(zhì)墊上的介質(zhì)注射端口， 其中，所述蓋匹配到所述底座上而形成無菌密封；所述流體分配通道設(shè)置在可通過所述光學(xué)窗觀察到的所述介質(zhì)墊上；并且引入所述流體分配通道中的樣本流體均勻地分配到所述介質(zhì)墊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包括設(shè)置在所述介質(zhì)墊上的隔膜，其中，處于所述樣本流體中的細(xì)胞保留在所述隔膜上且可通過所述光學(xué)窗觀察到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其特征在于，所述蓋和隔膜之間的空間可進(jìn)行加壓。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包括排泄端口。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包括氧清除劑，其足以使所述裝置的內(nèi)部無氧。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包括用于所述氧清除劑的促動(dòng)器。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的裝置，其特征在于，通過翻轉(zhuǎn)所述蓋或通過拉片來啟動(dòng)所述促動(dòng)器。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，進(jìn)一步包括釋壓閥。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述底座進(jìn)一步包括通道，當(dāng)引入流體時(shí)，所述通道釋放所述介質(zhì)墊中的壓力。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述蓋是可移除的。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包括介質(zhì)分配通道，所述介質(zhì)分配通道連接到所述介質(zhì)注射端口上且圍繞所述介質(zhì)墊的周緣具有多個(gè)出口，其中，經(jīng)由所述介質(zhì)注射端口引入的介質(zhì)經(jīng)由所述介質(zhì)分配通道而均勻地分配到所述介質(zhì)墊。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包括氧指示器。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述流體分配通道包括螺旋導(dǎo)槽。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述流體分配通道包括多個(gè)通道，并且引入所述流體分配通道中的樣本流體經(jīng)由所述多個(gè)通道而均勻地分配到所述介質(zhì)墊。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至13中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，所述流體分配通道為單個(gè)通道。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的裝置，其特征在于，所述流體分配通道圍繞所述介質(zhì)墊而包括傾斜周向區(qū)域。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包括設(shè)置在所述流體分配通道的頂部上的覆蓋物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的裝置，其特征在于，所述覆蓋物確定流體流的形狀，以通過單個(gè)通道實(shí)現(xiàn)向所述介質(zhì)墊的均勻分配。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，其特征在于，進(jìn)一步包括通氣端口，其用于在引入液體時(shí)對(duì)所述盒的內(nèi)部進(jìn)行通氣。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的裝置，其特征在于，所述通氣端口是自密封的。
21.一種用于檢測(cè)細(xì)胞的套件，其包括根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項(xiàng)所述的裝置，以及管道組，所述管道組包括具有連接器的管道，所述連接器具有針，并且匹配到所述樣本注射端口、介質(zhì)注射端口、通氣端口或排泄端口上。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的套件，其特征在于，所述連接器進(jìn)一步包括隔片，所述針穿過所述隔片。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的套件，其特征在于，所述連接器匹配到所述樣本注射端口、介質(zhì)注射端口、通氣端口或排泄端口上，并且當(dāng)所述針和管道被移除時(shí)，與所述隔片一起密封所述端口。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中的任一項(xiàng)所述的套件，其特征在于，進(jìn)一步包括第二管道組和可選的第三管道組，它們各自包括具有連接器的管道，所述連接器具有針，其中，所述管道組的連接器匹配到所述樣本注射端口、介質(zhì)注射端口、通氣端口和排泄端口中的一個(gè)上。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的套件，其特征在于，所述第一管道組、第二管道組和可選的第三管道組的管道共享公共入口或出口。
26.根據(jù)權(quán)利要求21至25中的任一項(xiàng)所述的套件，其特征在于，所述連接器包括夾具，所述夾具搭扣到所述盒中。
27.根據(jù)權(quán)利要求21至26中的任一項(xiàng)所述的套件，其特征在于，所述管道組進(jìn)一步包括多個(gè)單獨(dú)的管道，用于進(jìn)行下者中的至少兩個(gè):樣本引入、介質(zhì)引入、排泄和通氣。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的套件，其特征在于，所述連接器包括用于各個(gè)管道的針。
29.根據(jù)權(quán)利要求27至28中的任一項(xiàng)所述的套件，其特征在于，所述管道中的一個(gè)用于通氣。
30.根據(jù)權(quán)利要求27至29中的任一項(xiàng)所述的套件，其特征在于，用于通氣的管道包括過濾器。
31.根據(jù)權(quán)利要求27至30中的任一項(xiàng)所述的套件，其特征在于，用于通氣的管道包括釋壓閥。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK104185677SQ201280054238
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月7日
【發(fā)明者】R.C.阿維勒斯, D.T.米朝德, D.J.布朗內(nèi) 申請(qǐng)人:快速微型生物系統(tǒng)公司