專利名稱：羥烷基淀粉－變應(yīng)原偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有羥烷基淀粉(HAS)與變應(yīng)原的偶聯(lián)物的化合物，其中HAS與變應(yīng)原直接共價連接或者通過接頭連接。本發(fā)明還涉及制備相應(yīng)偶聯(lián)物的方法，及所述偶聯(lián)物作為藥物的用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在，術(shù)語“變態(tài)反應(yīng)”包括免疫系統(tǒng)對外源物質(zhì)過度的特異性反應(yīng)。根據(jù)Coombus和Gell的分類，變態(tài)反應(yīng)可以被分為I-IV型，它們可以根據(jù)參與反應(yīng)的抗體類型、所識別的抗原和誘導(dǎo)的效應(yīng)機(jī)制加以區(qū)別。
因此，被稱為變應(yīng)原的化合物是能夠在皮膚和粘膜誘導(dǎo)變應(yīng)性免疫應(yīng)答(狹義地指速發(fā)型變應(yīng)性免疫應(yīng)答(I型))的化合物。變應(yīng)原通常是分子量約為5000Da-約80000Da的多肽或蛋白質(zhì)。這種多肽可以來源于植物、動物或微生物。另外，這種多肽也可以是室塵的組成成分。
變應(yīng)原誘導(dǎo)IgE抗體，該抗體通過恒定區(qū)與肥大細(xì)胞表面結(jié)合，從而使肥大細(xì)胞脫顆粒。肥大細(xì)胞釋放的物質(zhì)(組胺、蛋白水解酶和炎癥介質(zhì))直接和間接地引起變態(tài)反應(yīng)的癥狀，通常是鼻炎、結(jié)膜炎和/或支氣管哮喘。
IgE介導(dǎo)的速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(I型)是目前為止最普遍的變態(tài)反應(yīng)類型。在發(fā)達(dá)國家，高達(dá)20％的人口患有I型變態(tài)反應(yīng)癥狀。當(dāng)前除了用藥物治療變態(tài)反應(yīng)患者外還利用被稱為脫敏的特異性免疫療法治療(Kleine-Tebbe等人，Pneumologie，Vol.5(2001)，438-444)。
在常規(guī)脫敏中，皮下施用含量逐漸增加的特定變應(yīng)原提取物，直到達(dá)到個體維持劑量。繼續(xù)治療時，使用不同的治療方案，重復(fù)施用這個劑量(Klimek等人，Allergologie und Umweltmedizin，Schattauer Verlag，158等等)。
在這種情況下，治療結(jié)果似乎與維持階段使用的變應(yīng)原的量密切相關(guān)。然而，如果增加施用的變應(yīng)原的量，變態(tài)反應(yīng)患者發(fā)生IgE介導(dǎo)的反應(yīng)的危險也總是增加。換句話說，對于過敏性休克患者，患者的變態(tài)反應(yīng)和與之相關(guān)的危險也限制了該療法的使用。
如果變態(tài)反應(yīng)癥狀緩解，個體不再需要藥物并且對變應(yīng)原的耐受增加，則認(rèn)為治療是成功的。
已經(jīng)提出，某些變應(yīng)性多肽可以通過重組表達(dá)產(chǎn)生，并且可用于脫敏(DE 100 41 541)。
為了獲得IgE結(jié)合特性降低的變應(yīng)原，用聚乙二醇(PEG)修飾變應(yīng)原，并用于脫敏。有大量出版物描述了通過變應(yīng)原與聚乙二醇共價鍵合制備PEG-變應(yīng)原偶聯(lián)物。例如，Mosbech等人(Allergy，1990，Vol.45(2)130-141)報告了使用PEG-室塵偶聯(lián)物治療患有哮喘的過敏成人，以及治療后的免疫應(yīng)答。作者發(fā)現(xiàn)，只要變應(yīng)原劑量足以減少特異性IgE的量，并且/或者誘導(dǎo)IgG應(yīng)答特別是IgG4應(yīng)答，則臨床效果改善。
類似地，Schafer等人(Ann.Allergie，1992，Vol.68(4)334-339)報告了一項(xiàng)研究，其中用PEG-修飾的青草花粉混合物的變應(yīng)原組合物對成人進(jìn)行脫敏。該治療結(jié)果與使用部分純化的青草花粉混合物脫敏的治療結(jié)果相比較。治療以雙盲法進(jìn)行。PEG修飾使副作用的發(fā)生頻率和程度下降約50％。在兩個治療組中都發(fā)現(xiàn)超敏反應(yīng)顯著改善。
然而，PEG偶聯(lián)物不含已經(jīng)了解其體內(nèi)降解途徑的任何天然存在的結(jié)構(gòu)。
除了PEG偶聯(lián)物之外，也曾經(jīng)制備并研究了其它一些變應(yīng)原衍生物。已知與羧甲基葡聚糖偶聯(lián)產(chǎn)生的葡聚糖修飾的變應(yīng)原。使用β-乳球蛋白進(jìn)行的一些研究表明，與未修飾的化合物相比，對葡聚糖偶聯(lián)物的抗體應(yīng)答顯著減弱(Kobayashi等人，J Agric Food Chem 2001 Feb；49(2)823-31；Hattori等人，Bioconjug Chem 2000 Jan-Feb；11(1)84-93)。
另外，也已經(jīng)生產(chǎn)了交聯(lián)的高分子量變應(yīng)原，被稱為類變應(yīng)原。例如，可以通過用甲醛或戊二醛修飾變應(yīng)原獲得這些產(chǎn)物。相應(yīng)的產(chǎn)品可以從Allergopharma，Joachim Ganser KG，21462Reinbek；HALAllergie GmbH，40554 Düsseldorf；和SmithKline Beecham PharmaGmbH，Benckard，80716 München獲得。
G.T.Hermanson(Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego 1996)對制備生物偶聯(lián)物的不同方法進(jìn)行了全面綜述。對此，寡糖和多糖與蛋白質(zhì)的連接主要通過賴氨酸(-NH2)或半胱氨酸(-SH)側(cè)鏈發(fā)生，較少通過天冬氨酸或谷氨酸(-COOH)或者酪氨酸(芳基-OH)側(cè)鏈發(fā)生。然而到目前為止，還沒有使用淀粉衍生物修飾變應(yīng)原。
例如，羥乙基淀粉是碳水化合物聚合物支鏈淀粉的一種取代的衍生物，后者占玉米淀粉的95％。HES具有有利的流變學(xué)性質(zhì)，目前在臨床上用于容量替代和血液稀釋治療(Sommermeyer等人，Krankenhauspharmazie，Vol.8(8)，(1987)，271-278；和Weidler等人，Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，(1991)494-498)。
支鏈淀粉由葡萄糖單元組成，其中主鏈中存在α-1，4-糖苷鍵，在分支位點(diǎn)處可見α-1，6-糖苷鍵。該分子的物理化學(xué)性質(zhì)主要取決于糖苷鍵的類型。由于α-1，4-糖苷鍵有角度，形成每圈大約有6個葡萄糖單體的螺旋結(jié)構(gòu)。
HES聚合物的物理化學(xué)和生物化學(xué)性質(zhì)能夠通過取代而改變。可以通過堿性羥乙基化作用引入羥乙基。通過改變反應(yīng)條件，可以利用非取代葡萄糖單體中各羥基對于羥乙基化的不同反應(yīng)性，從而影響取代模式。
HES的特征主要在于分子量分布和取代水平。在這方面，取代水平可以用DS(取代度)或MS(“摩爾取代”)描述，DS指取代的葡萄糖單體在所有葡萄糖單元中的比例，MS指每葡萄糖單元的羥乙基數(shù)。
HES溶液是多分散組合物，每個分子在聚合程度、分支點(diǎn)的數(shù)量和排列以及取代型式方面彼此不同。因此HES是分子量不同的化合物的混合物。因此，以統(tǒng)計學(xué)變量為基礎(chǔ)，用平均分子量定義具體的HES溶液。就此而言，Mn被計算為取決于分子數(shù)(平均數(shù))的簡單算術(shù)平均值，而重量平均值Mw代表取決于質(zhì)量的變量。
因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供改進(jìn)的變應(yīng)原衍生物，特別是達(dá)到貯存效應(yīng)從而不需頻繁施用的變應(yīng)原衍生物。
這一目標(biāo)現(xiàn)在用羥烷基淀粉(HAS)與變應(yīng)原的偶聯(lián)物實(shí)現(xiàn)，其中至少一個羥烷基淀粉與變應(yīng)原共價偶聯(lián)。
因此，根據(jù)本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)，HAS-變應(yīng)原偶聯(lián)物可以特別有利地用于特異性免疫治療。本發(fā)明偶聯(lián)物的應(yīng)用提高了脫敏的安全性。同時，本發(fā)明偶聯(lián)物具有更長的體內(nèi)半衰期，因此與HAS偶聯(lián)獲得貯存效應(yīng)，這對臨床效果具有有利的影響。特別是與水性變應(yīng)原提取物相比，本發(fā)明偶聯(lián)物的貯存效應(yīng)具有只需頻率較低地施用偶聯(lián)物即可達(dá)到治療效果的的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明HAS-變應(yīng)原偶聯(lián)物可以這樣制備，使得它們與未修飾的變應(yīng)原相比，與變應(yīng)原特異性IgE的結(jié)合減少。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，HAS-變應(yīng)原偶聯(lián)物只顯示與變應(yīng)原特異性IgE極低的結(jié)合或者根本沒有特異性結(jié)合。因此，本發(fā)明偶聯(lián)物能夠以更高的劑量施用，從而提高了成功脫敏的可能性。
與交聯(lián)的類變應(yīng)原相比，本發(fā)明HAS-變應(yīng)原偶聯(lián)物具有能夠提供與天然變應(yīng)原相當(dāng)之表位特征的優(yōu)點(diǎn)。因此能夠提高免疫治療的效果。相反，使用甲醛或戊二醛聚合變應(yīng)原產(chǎn)生確定性較差的高分子量化合物(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1990；6(4)315-65)，這可能產(chǎn)生非天然的表位，因此它們的效果必須視具體情況而定。
在該偶聯(lián)物中，至少一個羥烷基淀粉與變應(yīng)原偶聯(lián)。本發(fā)明范圍當(dāng)然也包括含有多個羥烷基淀粉分子和一個變應(yīng)原或者含有多個變應(yīng)原分子和一個羥烷基淀粉分子的偶聯(lián)產(chǎn)物。
在與變應(yīng)原直接偶聯(lián)或者通過接頭與變應(yīng)原偶聯(lián)的偶聯(lián)物中可以含有羥烷基淀粉。羥烷基淀粉也可以與多肽鏈偶聯(lián)，或者與變應(yīng)原糖蛋白的一條或多條糖鏈偶聯(lián)。
羥烷基淀粉(HAS)對于本發(fā)明，術(shù)語“羥烷基淀粉”指被羥烷基取代的淀粉衍生物。羥烷基優(yōu)選地含有2-4個碳原子。因此被稱為“羥烷基淀粉”的這類分子優(yōu)選地包括羥乙基淀粉、羥丙基淀粉和羥丁基淀粉。對于本發(fā)明的所有實(shí)施方案，使用羥乙基淀粉(HES)作為偶聯(lián)配偶體是特別優(yōu)選的。
根據(jù)本發(fā)明，用來制備偶聯(lián)物的羥乙基淀粉的平均分子量優(yōu)選是1-300kDa，5-200kDa的平均分子量是特別優(yōu)選的。在所有情況下，對于羥乙基，羥乙基淀粉可以具有0.1-0.8的摩爾取代水平，和2-20的C2∶C6取代比。
變應(yīng)原對于本發(fā)明，被稱為變應(yīng)原的化合物主要是能夠誘導(dǎo)變應(yīng)性免疫應(yīng)答(狹義地指IgE-介導(dǎo)的超敏反應(yīng)(I型))的化合物。也包括來源于變應(yīng)原序列的肽，例如酶切產(chǎn)生的酶切產(chǎn)物。特異性免疫治療使用相應(yīng)的變應(yīng)原，它們可以作為商品獲得。
變應(yīng)原能夠從天然來源中分離。因此，對于花粉變應(yīng)原，例如可以從特定花粉中獲得變應(yīng)原提取物。另外，例如也可以重組制備變應(yīng)原。
變應(yīng)原優(yōu)選是選自多肽、蛋白質(zhì)和糖蛋白的化合物。
制備方法一方面，本發(fā)明涉及制備HAS-變應(yīng)原偶聯(lián)物的方法，在該偶聯(lián)物中，HAS與變應(yīng)原直接共價偶聯(lián)或者通過接頭共價偶聯(lián)。這種偶聯(lián)能夠以多種方式進(jìn)行。

圖1顯示了使用接頭的通式結(jié)構(gòu)新糖蛋白的合成。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備HAS-變應(yīng)原偶聯(lián)物的方法，在該偶聯(lián)物中，HES與變應(yīng)原的ε-NH2基、α-NH2基、SH基、COOH基或-C(NH2)2基連接。
本發(fā)明也包括通過還原胺化將HES與蛋白質(zhì)的ε-NH2基偶聯(lián)的方法。作為它的備選方法，本發(fā)明涉及變應(yīng)原與羥乙基淀粉的還原性末端基團(tuán)偶聯(lián)的方法。
在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及為了與變應(yīng)原偶聯(lián)向HAS中引入活性基的方法。該活性基可以是例如醛基、硫醇基或氨基。
變應(yīng)原與寡糖或多糖可以直接偶聯(lián)或者通過接頭偶聯(lián)在一起?？梢允褂萌魏谓宦?lián)劑作為接頭。該接頭可以是例如雙功能接頭如同雙功能交聯(lián)劑或異雙功能交聯(lián)劑。
多種交聯(lián)劑，例如SMCC(4-(N-馬來酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯)，可以作為商品獲得并為技術(shù)人員公知(參見Perbio產(chǎn)品目錄和www.piercenet.com上按字母順序排列的“交聯(lián)劑”列表)，可以用于本發(fā)明。
在另外一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及可以通過上述方法獲得的HAS-變應(yīng)原偶聯(lián)物。
下文描述了合成HAS-變應(yīng)原偶聯(lián)物的一些方法。生物偶聯(lián)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以從所述方法中選擇特別適合達(dá)到目的(選擇的變應(yīng)原，選擇的HAS等)的方法而不會有任何問題。
通過還原胺化，未修飾的HAS與變應(yīng)原蛋白質(zhì)的直接偶聯(lián)在NaCN/BH3存在下，通過還原胺化，HAS與變應(yīng)原蛋白質(zhì)的ε-氨基直接偶聯(lián)，這代表了不需要修飾HAS即能夠進(jìn)行的一種簡單、溫和的方法(G.R.Gray，Arch.Biochem.Biophys.1974，163，426-28)(圖2.1a)。
也可以使用的還原劑有吡啶-硼烷和其它更穩(wěn)定、更易于處理的氨基-硼烷復(fù)合物(J.C.Cabacungan等人，Anal.Biochem.1982，124，272-78)。與酰化不同，蛋白質(zhì)被修飾的氨基在生理?xiàng)l件下仍然帶正電荷。因此，還原胺化對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的影響較小。然而，在該方法中，還原性糖的環(huán)結(jié)構(gòu)丟失。
修飾的HAS的偶聯(lián)方法還原性末端氧化為醛糖酸在較少使用的用碘(或溴)氧化為相應(yīng)的醛糖酸時(G.Ashwell，Methods Enzymol.1972，28，219-22)，還原性糖的環(huán)結(jié)構(gòu)丟失(圖2.1b)，另外，為了避免非特異性氧化，必須小心控制反應(yīng)。形成的羧酸官能團(tuán)能夠在EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺)存在下(J.Lnngren，I.J.Goldstein，Methods Enzymol.1994，247，116-118)與變應(yīng)原蛋白質(zhì)賴氨酸側(cè)鏈的ε-氨基偶聯(lián)，或者通過酰肼接頭偶聯(lián)(見圖3)。類似地也可以使用例如甘露糖醛酸、葡糖醛酸或唾液酸的多糖結(jié)構(gòu)中所含羧基進(jìn)行偶聯(lián)。
本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實(shí)施方案提供由HES-變應(yīng)原偶聯(lián)物組成的化合物，該偶聯(lián)物中變應(yīng)原與羥乙基淀粉的還原性末端基團(tuán)特異性連接。為此，該還原性末端基團(tuán)可以被預(yù)先選擇性氧化，例如利用Hashimoto等人(Kunststoffe，Kautschuk，F(xiàn)asern，Vol.9，(1992)S.1271-1279)所述的方法氧化糖類的還原性醛基末端。
HAS的羥基官能團(tuán)的活化非特異性活化多糖的最有用的方法之一是與溴化氰(CNBr)反應(yīng)(C.Chu等人，Infect.Immun.1983，40，245-56)(圖2.1c)?；罨牧u基?；鞍踪|(zhì)的賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸側(cè)鏈。但這種偶聯(lián)方法可能具有高pH、毒性和可操作性較差的缺點(diǎn)。
CNBr的一種替代物是CDAP(1-氰基-4-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸鹽)(A.Lees等人，Vaccine 1996，14，190-98；D.E.Shafer等人，Vaccine 2000，18，1273-81)，它可以提高氰基的反應(yīng)性，使反應(yīng)能夠在極其溫和的條件下進(jìn)行。
多糖的非特異活化通常可導(dǎo)致多重取代，因此也可導(dǎo)致多糖與蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)。然而，這可以通過適當(dāng)選擇反應(yīng)條件顯著抑制。
醛的引入通過用NaIO4切割相鄰的羥基，也可以向非還原多糖內(nèi)引入醛基官能團(tuán)(J.M.Bobbit，Ad.Carbohydr.Chem.1956，11，1-41)(圖2.1d)，通過高碘酸鈉溶液的濃度可以獲得充分的選擇性。唾液酸特別易于氧化(S.M.Chamov等人，Biol.Chem 1992，267，15916-22)。
引入不會環(huán)化為半縮醛的醛基可以提高用還原性多糖進(jìn)行的直接還原胺化的反應(yīng)速度。其可通過以下方法實(shí)現(xiàn)將還原性末端還原為糖醇，隨后選擇性氧化打開的糖醇中相鄰的二醇(Y.C.Lee，R.T.Lee，NeoglycoproteinsPreparation and Application，AcademicPress，Sant Diego 1994)(圖2.1d)。
除了醛修飾的多糖與蛋白質(zhì)的氨基官能團(tuán)通過還原胺化直接偶聯(lián)之外，也可以用雙功能酰肼接頭修飾多糖(見下文)。
氨基官能團(tuán)的引入寡糖(含有可達(dá)20個碳水化合物單體)與多糖相比，通過還原胺化使還原性糖反應(yīng)產(chǎn)生glycamine或者產(chǎn)生具有完整環(huán)結(jié)構(gòu)的糖基胺的可能性較大，因?yàn)槠浞磻?yīng)性略高(圖2.2)。
使用雙功能接頭適合偶聯(lián)氨基修飾的多糖與蛋白質(zhì)的不同側(cè)鏈官能團(tuán)(見下文)。
通過還原胺化引入氨基官能團(tuán)與使用NH3或脂族胺通過還原胺化合成glycamine(B.Kuberan等人，Glycoconj.J.1999，16，271-81)不同，在相當(dāng)?shù)臈l件下，使用芳族胺例如芐胺(T.Yoshide，Methods Enzymol.1994，247，55-64)、2-(4-氨基苯基)乙胺(APEA)(H.D.Grimmecke，H.Brade，Glycoconj.J.1998，15，555-62)或4-三氟乙酰氨基苯胺(E.Kallin，MethodsEnzymol.1994，247，119-23)，能夠獲得更高的產(chǎn)率(圖2.2a)。
對于APEA，利用脂族氨基與芳族氨基的反應(yīng)性不同進(jìn)行選擇性反應(yīng)，可獲得4-三氟乙酰氨基苯胺形式的單保護(hù)的化合物(此外，也可以使用芐氧羰基氨基苯胺(M.Barstrm等人，Carbohydr.Res.2000，328，525-31))，隨后除去三氟乙?；歪尫懦龇甲灏被倌軋F(tuán)。另外也表明，在除去TFA保護(hù)基之前，用乙酸酐進(jìn)行簡單的N-乙酰化能夠穩(wěn)定glycamine。
通過N-糖基化引入氨基官能團(tuán)
N-糖基化(圖2.2b)提供了保留還原性糖之環(huán)狀環(huán)結(jié)構(gòu)的可能性。與碳酸氫銨反應(yīng)獲得的不穩(wěn)定的β-糖基胺(I.D.Manger等人，Biochemistry 1992，31，10724-32；I.D.Manger等人，Biochemistry1992，31，10733-40；S.Y.C.Wong等人，Biochem.J.1993，296，817-25，E.Meinjohannes等人，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，1998，549-60)，可以通過隨后用氯乙酸酐?；瘉矸€(wěn)定，并且通過氨解轉(zhuǎn)化為含有游離氨基的1-N-甘氨酰化合物。類似也可以用烯丙胺進(jìn)行N-糖基化，并且在通過N-酰化穩(wěn)定后，可以向雙鍵上光化學(xué)添加半胱胺(D.Ramos等人，Angew.Chem.2000，112，406-8)。
由醛糖酸制備氨基官能團(tuán)通過與二胺反應(yīng)，可以向氧化還原性多糖獲得的醛糖酸中引入游離氨基官能團(tuán)。這可以通過酸與碳二亞胺和二胺反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。此外，醛糖酸脫水獲得的內(nèi)酯也可以與二胺反應(yīng)(S.Frie，畢業(yè)論文，F(xiàn)achhochschule Hamburg，1998)。
使用雙功能接頭，修飾的HES與變應(yīng)原蛋白質(zhì)的偶聯(lián)反應(yīng)通過接頭連接在一起的修飾的HES和蛋白質(zhì)側(cè)鏈的官能團(tuán)多樣性與可以進(jìn)行的反應(yīng)可能性相對應(yīng)(圖3顯示普通的接頭活化)。
可以區(qū)別反應(yīng)基團(tuán)對氨基(NHS酯、酰亞胺酯和芳基疊氮化物)、醛和(在EDC存在下)羧酸(酰肼)或SH基(馬來酰亞胺、鹵代乙酸酯或吡啶基二硫醚)的反應(yīng)性。
具有胺反應(yīng)性的試劑最有用的偶聯(lián)劑是胺反應(yīng)性的交聯(lián)劑。而且，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯(圖3.1a)是最常見的活化形式。在這種情況下，通過除去NHS形成酰化的化合物。酰亞胺酯提供了修飾伯胺的另外一種可能性(F.C.Hartman，F(xiàn).Wold，Biochemistry 1967，6，2439-48)(圖3.1b)，形成酰亞胺酰胺(脒)。通常用酰亞胺酯作為蛋白質(zhì)交聯(lián)劑，根據(jù)對其它親核試劑的最小反應(yīng)性加以區(qū)別。另外，也可以使用不同的芳基疊氮化物接頭(光反應(yīng)性交聯(lián)劑)，它們通過光解形成短壽命的氮賓。通過環(huán)擴(kuò)展(代替非特異性插入)由其產(chǎn)生脫氫氮雜卓，它們優(yōu)選地與親核試劑特別是與胺反應(yīng)(圖3.1c)。
由于可以商業(yè)獲得大量具有氨基活性的偶聯(lián)劑和各種接頭，其它反應(yīng)的可能性(例如與異氰酸酯和異硫氰酸酯的反應(yīng))逐漸失去重要性。
具有對羰基或羧基的反應(yīng)性的試劑利用酰肼接頭偶聯(lián)含有羰基或羧基的化合物(D.J.O′Shanessy，M.Wilchek，Anal.Biochem 1990，191，1-8)(圖3.2)。醛被轉(zhuǎn)化為腙，腙可以用NaCN/BH3還原穩(wěn)定化，在EDC存在下羧基反應(yīng)形成酰亞胺鍵。酰肼活化的接頭是還原胺化和用零長度交聯(lián)劑(如羰基二咪唑(CDI))活化羧基的通用替代方案。
具有巰基反應(yīng)性的試劑具有SH反應(yīng)性的偶聯(lián)劑是第二大類交聯(lián)劑。偶聯(lián)反應(yīng)主要包括兩種反應(yīng)途徑烷化(圖3.3a-b)或二硫醚交換(圖3.3c)。除了用α-鹵代乙酸酯烷化之外，通過Michael加成，馬來酰亞胺的雙鍵能夠與SH基選擇性反應(yīng)，形成穩(wěn)定的硫醚鍵。硫醇二硫醚交換是另外一種巰基特異性反應(yīng)。在這種情況下，與吡啶基二硫醚的反應(yīng)(J.Carlsson等人，Biochem J.1978，173，723-37)證明是特別有利的，因?yàn)橥ㄟ^除去2-吡啶酮能夠完全轉(zhuǎn)化為混合的二硫醚。
交聯(lián)劑使用不同的同雙功能交聯(lián)劑和異雙功能交聯(lián)劑，利用上述偶聯(lián)反應(yīng)合成本發(fā)明的HAS-變應(yīng)原生物偶聯(lián)物。
同雙功能交聯(lián)劑對稱的同雙功能接頭(參見，例如，圖4.1所示)在兩端含有相同的反應(yīng)基，適合連接含有相同官能團(tuán)的化合物。根據(jù)可以進(jìn)行的偶聯(lián)反應(yīng)，含有例如二亞胺酯、二琥珀酰亞胺、二酰肼和二馬來酰亞胺官能團(tuán)的相應(yīng)雙功能接頭可以作為商品獲得。
使用同雙功能接頭的一個缺點(diǎn)是，即使使用過量的交聯(lián)劑也不能完全防止第一種化合物活化中的交聯(lián)(S.Bystrick等人，Glycoconj.J.1999，16，691-95)。與第二種化合物偶聯(lián)之前完全除去交聯(lián)的第一種化合物是必要的，如果活化的中間產(chǎn)物不穩(wěn)定，則可能比較困難(例如NHS活化的化合物對水解敏感)。隨著pH提高，胺反應(yīng)性和NHS酯的水解都提高，這就是為什么在生理?xiàng)l件(pH 7)下在緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)的原因(NHS酯DSP在0℃和pH 7下的半衰期為4-5小時，但是在pH 8.6下只有10分鐘；A.J.Lomant，G.Fairbanks，J.Mol.Biol.1976，104，243-261)。
異雙功能交聯(lián)劑可以利用異雙功能交聯(lián)劑(參見，例如圖4.2所示)連接含有不同官能團(tuán)的化合物。這類接頭含有兩種不同的反應(yīng)基，通過組合不同的偶聯(lián)反應(yīng)，可以在該交聯(lián)劑的一端選擇性反應(yīng)。因此，例如，該接頭的一側(cè)具有氨基活性，另一側(cè)具有巰基活性，獲得比同雙功能接頭更好的反應(yīng)控制可能性。
異雙功能接頭的更具反應(yīng)性或者更不穩(wěn)定的一側(cè)首先反應(yīng)。由于NHS酯不僅能夠與氨基反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵也可以與巰基和羥基反應(yīng)，異雙功能接頭最初與氨基化合物反應(yīng)。與之相比，馬來酰亞氨基在水溶液中不僅顯示更高的選擇性，而且顯示更高的穩(wěn)定性，因此能夠純化活化的中間物，隨后與具有巰基活性的化合物選擇性反應(yīng)。
交聯(lián)劑的選擇不僅取決于用于偶聯(lián)的官能團(tuán)的性質(zhì)，而且取決于間隔區(qū)所希望的長度和組成，被稱為交聯(lián)橋。因此，一些間隔區(qū)，特別是具有剛性環(huán)結(jié)構(gòu)的間隔區(qū)，例如SMCC或MBS，引發(fā)特異性抗體應(yīng)答(J.M.Peeters等人，J.Immunol.Methods 1989，120，133-43)，因此可能較不適于半抗原-載體免疫原和體內(nèi)使用。
圖4中的接頭中省略了可以通過二硫醚切割(例如DSP、DTME或DTBP)或高碘酸鹽切割(二醇，如BMDB或DET)打開并用于研究生物特異性相互作用、或者用于純化未知靶結(jié)構(gòu)的可特異性切割的接頭。
可作為商品獲得的偶聯(lián)劑所使用的縮寫來自這些化合物的系統(tǒng)命名，例如DMA(己二亞胺酸二甲酯(dimethyl adipimidate))、DMS(辛二亞胺酸二甲酯(dimethyl suberimidate))、GMBS(N-(γ-馬來酰亞氨基丁酰氧基)琥珀酰亞胺酯)等。
圖5中總結(jié)了例如用于巰基偶聯(lián)的各種異雙功能交聯(lián)劑。
馬來酰亞胺活化的接頭在此提供了最大的通用性，通常與NHS酯活化相結(jié)合。具有巰基和氨基反應(yīng)性的這些接頭是不溶于水的烷基橋接的線性接頭，例如AMAS、GMBS和EMCS，或者象SMCC、SMPB或MBS一樣含有剛性環(huán)結(jié)構(gòu)。免疫化學(xué)方法如ELISA檢測通常使用兩種UV活性接頭，SMPB和MBS。
另外，M2C2H也是一種接頭，它具有與SMCC相同的剛性橋，但是用酰肼活化，以便連接含有巰基和羰基或羧基活性的化合物。
不溶于水的接頭在反應(yīng)之前首先需要溶解于一種有機(jī)溶劑如DMF或DMSO中，與之不同，另外還有一些接頭的水溶性變體如親水性磺基-NHS酯(J.V.Staros，Biochemistry 1982，21，3950-55)，例如磺基-GMBS、磺基-EMCS和磺基-SMCC。
除了馬來酰亞胺活化的異雙功能接頭之外，巰基偶聯(lián)也可以使用多種鹵代乙酸酯，例如SIA(以及溴類似物)、SIAB和SBAP(圖5.2)，和吡啶基二硫醚，如SPDP和LC-SPDP和磺基-LC-SPDP(圖5.3)，也與NHS酯活化相結(jié)合進(jìn)行氨基偶聯(lián)。通過與游離酸和水溶性碳二亞胺反應(yīng)(N.J.Davies，S.L.Flitsch，Tetrahedron Lett.1991，32，6793-6796)，或者與相應(yīng)的酸酐反應(yīng)(I.D.Manger等人，Biochemistry 1992，31，10733-40；S.Y.C.Wong等人，Biochem.J.1994，300，843-850)，也可以將鹵代乙酸酯引入胺化的多糖中(見圖2.2b)。
合成寡糖與蛋白質(zhì)的SH側(cè)鏈通過異雙功能馬來酰亞胺接頭偶聯(lián)的許多例子在文獻(xiàn)中可見(V.Fernandez-Santana等人，Glycoconj.J.1998，15，549-53；G.Ragupathi等人，Glycoconj.J.1998，15，217-21；W.Zou等人，Glycoconj.J.1999，16，507-15；R.Gonzalez-Lio，J.Thiem，Carbohydr.Res.1999，317，180-90)。另外，寡糖之碘乙酰胺衍生物的直接偶聯(lián)也可以用于蛋白質(zhì)的特異性糖基化(N.J.Davies，S.L.Flitsch，Tetrahedron Lett.1991，32，6793-679645；S.Y.C.Wong等人，Biochem.J.1994，300，843-850)。
用多糖和寡糖在糖部分修飾糖蛋白對于糖蛋白，連接的寡糖也為形成本發(fā)明的偶聯(lián)物提供了更多的連接點(diǎn)，作為蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的替代途徑(J.J.Zara等人，Anal.Biochem.1991，194，156-62)。
通過高碘酸鈉氧化引入醛通過用高碘酸鈉氧化，可以向非還原性寡糖內(nèi)引入醛。根據(jù)選擇的氧化條件，存在的唾液酸可以被選擇性氧化，或者巖藻糖、甘露糖、半乳糖和N-乙酰葡糖胺殘基較低選擇性地被氧化(S.M.Chamov等人，J.Biol.Chem.1992，267，15916-22)。一種可能的副反應(yīng)是由N-端絲氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸形成醛(D.J.O′Shanessy，M.Wilchek，Anal.Biochem.1990，191，1-8)。
酶法引入醛用半乳糖氧化酶氧化糖蛋白導(dǎo)致在末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺處形成C6醛。然而，這些糖不是末端，特別是在來自動物細(xì)胞的糖蛋白中，因此它們必須首先在前一個步驟中被釋放出來(D.J.O′Shanessy，M.Wilchek，Anal.Biochem.1990，191，1-8)。
藥物組合物本發(fā)明最后涉及含有本發(fā)明HAS-變應(yīng)原偶聯(lián)物的藥物組合物。本發(fā)明的偶聯(lián)物特別適于生產(chǎn)可以用于變態(tài)反應(yīng)患者脫敏的藥物組合物。這些藥物組合物特別適于治療檢測到IgE-介導(dǎo)的致敏并且觀察到相應(yīng)臨床癥狀的變態(tài)反應(yīng)患者。
因此，本發(fā)明的偶聯(lián)物尤其可以用于生產(chǎn)對如下患者進(jìn)行特異性免疫治療的藥物組合物對速發(fā)型變應(yīng)原有臨床相關(guān)反應(yīng)的患者，例如對花粉、螨、哺乳動物毛發(fā)(唾液)、真菌、昆蟲、食物和天然橡膠/乳膠過敏者。因此該免疫治療特別適合哮喘患者和枯草熱患者的治療。
本發(fā)明的組合物可以用于各種形式的特異性免疫治療，特別是脫敏。因此，可以通過皮下、粘膜、口服、經(jīng)口或舌下施用本發(fā)明的HES偶聯(lián)物進(jìn)行脫敏。脫敏也可以以各種治療方案進(jìn)行(季節(jié)前/常年)。
通過rush或ultra-rush方法進(jìn)行的治療可能特別適合對于昆蟲過敏的人(參見，Kleine-Tebbe等人，Pneumologie，Vol.5(2001)，438-444)。
通過將本發(fā)明的偶聯(lián)物與適用于脫敏的載體和/或賦形劑混合，產(chǎn)生藥物組合物。
HES與變應(yīng)性糖蛋白的偶聯(lián)物能夠用于偶聯(lián)制備HES-糖蛋白偶聯(lián)物的糖蛋白化學(xué)官能團(tuán)類型的例子包括A半胱氨酸側(cè)鏈的硫醇基B氧化的半乳糖殘基的醛基。
因此，B不適合未糖基化的蛋白質(zhì)。
可以根據(jù)單個還原性末端區(qū)別HES。由于這種結(jié)構(gòu)特征，HES特別適合本發(fā)明靶向區(qū)域選擇性連接。
能夠用于HES-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物合成的化學(xué)連接方法是那些為了由未受保護(hù)的肽片段構(gòu)建較大蛋白質(zhì)而發(fā)展出的方法。這些方法以在各種情況下在將要連接的片段中選擇獨(dú)特的反應(yīng)官能團(tuán)為基礎(chǔ)，在天然蛋白質(zhì)中含有大量其它官能團(tuán)的情況下，這些反應(yīng)官能團(tuán)彼此選擇性作用，產(chǎn)生穩(wěn)定的終產(chǎn)物。
HES制品通常首先被轉(zhuǎn)化為確定的、高度純化的且良好表征的中間物(反應(yīng)性HES)，然后在生理?xiàng)l件下能夠自發(fā)地、區(qū)域選擇性地與變應(yīng)原的靶官能團(tuán)反應(yīng)。
HES的還原性末端選擇性轉(zhuǎn)化為伯氨基(1-氨基-HES)官能團(tuán)是優(yōu)選的。這種“1-氨基-HES”可以靈活地適應(yīng)與蛋白質(zhì)的連接反應(yīng)，可以按照不同的合成途徑，并且通過預(yù)制的試劑(接頭)將多個反應(yīng)步驟組合為一步。
HS-反應(yīng)性HES下文示意性描述并評價了制備HS-反應(yīng)性HES的備選方法
1.-用雙功能接頭M2C2H(圖5.1.b)還原胺化HES，產(chǎn)生HS反應(yīng)性HES(A)；-通過透析和凍干純化；-通過Michael加成來偶聯(lián)HS-蛋白質(zhì)。
這種合成具有特別的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樗浅：唵?1步)，而且與靶蛋白質(zhì)的反應(yīng)有極高的選擇性。如果由于肼衍生物的毒性而發(fā)生問題，則必須隨后用本領(lǐng)域公知的純化方法純化。
2.-HES內(nèi)酯(氧化的HES)與雙功能接頭M2C2H反應(yīng)(圖5.1.b)，產(chǎn)生HS反應(yīng)性HES(B)；-通過透析和凍干純化；-通過Michael加成來偶聯(lián)HS-蛋白質(zhì)。
該反應(yīng)與以上1所述的反應(yīng)不同，因?yàn)榱硗膺€需要制備HES內(nèi)酯。
3.-HES與碳酸氫銨反應(yīng)，產(chǎn)生1-氨基-HES(C)；-通過凍干純化；-不需要堿催化，用溴/碘乙酸酐酰化1-氨基，產(chǎn)生溴/碘乙酰胺(HS-反應(yīng)性HES D)；-通過透析和凍干純化；通過烷基化與HS-蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
該方法也是有利的；它只包括兩步，并且只使用非常簡單的試劑。因此該方法的成本效率非常高。合成規(guī)模易于放大。與靶蛋白質(zhì)的反應(yīng)具有很高的選擇性。
4.-如Frie(S.Frie，Diplomarbeit，F(xiàn)achhochschule Hamburg，1998)所述，HES內(nèi)酯(氧化的HES)與二胺(1，4-二氨基丁烷)反應(yīng)，產(chǎn)生氨基-HES(E)；-不需要堿催化，用溴/碘乙酸酐?；被?HES，產(chǎn)生溴/碘乙酰胺(HS-反應(yīng)性HES F)；-通過透析和凍干純化；通過烷基化與HS-蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
該合成途徑與以上3所述不同，因?yàn)榱硗膺€需要制備HES內(nèi)酯。
CHO-反應(yīng)性HES
下文示意性描述并評價了制備CHO-反應(yīng)性HES的備選方法1.-使用氨基-HES(E)作為CHO-反應(yīng)性HES G；-通過還原胺化與CHO-蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
這種合成非常簡單且成本效率高。與內(nèi)部賴氨酸的競爭可能產(chǎn)生問題，可以通過選擇反應(yīng)條件來控制。
2.-HAS內(nèi)酯(氧化的HES)與肼反應(yīng)，產(chǎn)生酰肼(CHO-反應(yīng)性HESH)；-通過透析和凍干純化；-在pH 5-6下通過形成腙與CHO-蛋白質(zhì)偶聯(lián)；在由半乳糖殘基氧化形成(酶或化學(xué))過程中，偶聯(lián)反應(yīng)優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)就地進(jìn)行；隨后任選地用NaCN/BH3進(jìn)行還原穩(wěn)定化；-半乳糖的酶氧化優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)用與聚合物結(jié)合的酶進(jìn)行，以利于酶的去除。
這種合成非常簡單且具有選擇性(與內(nèi)部賴氨酸沒有競爭)。由于肼衍生物的毒性可能產(chǎn)生問題。
3.-D或F進(jìn)一步與碳酸氫銨反應(yīng)，產(chǎn)生甘氨酰胺(CHO-反應(yīng)性HES H和I)；-通過透析和凍干純化；-通過還原胺化與CHO-蛋白質(zhì)偶聯(lián)。
該方法分三步進(jìn)行，但是只使用非常簡單的試劑，因此成本效率高。合成的規(guī)模易于放大。然而，可能發(fā)生與內(nèi)部賴氨酸的競爭(見上文)。
4.-用cBz-氨基氧乙酸酰化氨基-HES C或E，隨后氫化為氨基氧-HES(CHO-反應(yīng)性HES K)；-在pH 5-6下通過形成肟與CHO-蛋白質(zhì)偶聯(lián)；在由半乳糖殘基氧化形成(酶或化學(xué))過程中，偶聯(lián)反應(yīng)優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)就地進(jìn)行；-半乳糖的酶氧化優(yōu)選地應(yīng)當(dāng)用與聚合物結(jié)合的酶進(jìn)行，以利于酶的去除。
這種合成復(fù)雜，但是與靶蛋白質(zhì)的偶聯(lián)與2所述的反應(yīng)一樣具有選擇性(與內(nèi)部賴氨酸沒有競爭)。
權(quán)利要求
1.一種羥烷基淀粉與變應(yīng)原的偶聯(lián)物，其中至少一個羥烷基淀粉與變應(yīng)原共價偶聯(lián)。
2.如權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其中所述羥烷基淀粉與變應(yīng)原直接偶聯(lián)或者通過接頭偶聯(lián)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的偶聯(lián)物，其中所述羥烷基淀粉是羥乙基淀粉、羥丙基淀粉或羥丁基淀粉。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，其中所述羥乙基淀粉的平均分子量為1-300kDa，優(yōu)選平均分子量為5-200kDa。
5.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，其中在所有情況下，對于羥乙基所述羥乙基淀粉具有0.1-0.8的摩爾取代水平，和2-20的C2∶C6取代比。
6.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，其中所述變應(yīng)原選自多肽或蛋白質(zhì)。
7.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，其中所述變應(yīng)原是糖蛋白。
8.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，其中所述羥烷基淀粉與多肽鏈偶聯(lián)，或者與糖蛋白的一條或多條糖鏈偶聯(lián)。
9.一種藥物組合物，其含有如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物。
10.如權(quán)利要求9所述的藥物組合物，它還含有藥學(xué)可接受的載體。
11.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的化合物在特異性免疫治療、特別是脫敏中的用途。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其用于特異性免疫治療檢測到IgE-介導(dǎo)的致敏、觀察到相應(yīng)臨床癥狀的變態(tài)反應(yīng)患者。
13.如權(quán)利要求11或12所述的用途，其中所述特異性免疫療法用于治療對花粉、螨、哺乳動物毛發(fā)(唾液)、真菌、昆蟲、食物和天然橡膠/乳膠的變態(tài)反應(yīng)。
14.如權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的用途，其中這種療法用于治療哮喘患者、枯草熱患者和顯示與速發(fā)型變應(yīng)原臨床相關(guān)的其它類型反應(yīng)的患者。
15.如權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)所述的用途，其中經(jīng)皮下、粘膜、口服、經(jīng)口或舌下施用。
16.如權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)所述的用途，其中在季節(jié)前或常年進(jìn)行針對空氣傳播變應(yīng)原的免疫治療。
17.如權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)所述的用途，其中用rush或ultra-rush法對昆蟲過敏者進(jìn)行免疫治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及羥烷基淀粉與變應(yīng)原的偶聯(lián)化合物，其中至少一個羥烷基淀粉與變應(yīng)原共價偶聯(lián)。
文檔編號A61K39/35GK1681535SQ03821463
公開日2005年10月12日 申請日期2003年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月11日
發(fā)明者沃爾弗拉姆·艾克納, 德克·多爾曼 申請人:弗雷澤紐斯卡比德國有限公司