專利名稱：羅氏沼蝦諾達(dá)病毒核酸rt－pcr檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蝦類病害檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羅氏沼蝦諾達(dá)病毒核酸RT-PCR檢測的方法，適用于羅氏沼蝦肌肉白濁病病毒病原的診斷。
參考文獻(xiàn)(1)Arcier J.M.，Herman F.，Lightner D.V.，Redman R.M.，MariJ.& Bonami J.R.(1999).A viral disease associated withmortalities in hachery-reared postlarvae of the giantfreshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.Diseases ofAquatic Organisms，38，177-181.
(2)Bonami J.R.(2002)A new viral disease in the giantfreshwater prawn Macrobrachium rosenbergii.WorldAquaculture 2002.Annual Meetings of the World AquacultureSociety and the China Society of Fisheries，April 23-27，2002.Beijing Convention Center，Beijing China.Abstract，p.79.
(3)錢冬楊國梁劉問等。羅氏沼蝦苗肌肉白濁病病原研究。水生生物學(xué)報(bào)，2002，26472-476(4)Romestand B.& Bonami J.R.(2002)Asandwich enzyme linkedimmunosorbent assay(S-ELISA)for detection of MrNV in thegiant fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii.Journalof Fish Diseases，(in press).
(5)Tung C.W.，Wang C.S.& Chen S.N.(1999)Histological andelectron microscopic study on Macrobrachium muscle virus(MMV)infection in the giant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii(de Man)，cultured in Taiwan.Journal of Fish Diseases，22，1-5.
參考資料(1)、(2)(3)和(5)主要側(cè)重于羅氏沼蝦肌肉白濁病的病原研究，在組織病理、病毒的超微結(jié)構(gòu)和生化特征的水平上對病毒進(jìn)行描述。資料(4)報(bào)道了一種羅氏沼蝦諾達(dá)病毒的免疫檢測方法，該方法操作簡便快速，但靈敏度低。
為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案A、制備檢測試劑盒試劑盒含有所有檢測程序中的必要成分，包括總RNA提取試劑(4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉pH7.0，0.5％月桂基肌氨酸鈉鹽，0.1M巰基乙醇，0.2M醋酸鈉)、病毒特異引物(設(shè)計(jì)上游引物ccacgttcttagtggatcct；下游引物cgtccgcctggtagttcc)、擴(kuò)增系統(tǒng)成分(在50μl反應(yīng)體系內(nèi)，加入4μl 10mM脫氧核糖核甘酸混合物，2.5μl 100mM DTT，1μl RNA酶抑制劑5U/μl，10μl 5x RT-PCR緩沖液，2μl的上下游引物(10pmol/μl)，1μl酶混合物，底物為從組織提取的總RNA)。
B、建立DNA擴(kuò)增的最佳條件(55℃ 30min，1個(gè)循環(huán)；94℃，30s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 7min，1個(gè)循環(huán)。1.2％瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有以下優(yōu)點(diǎn)靈敏度高，能檢測出少于2.5pg的病蝦組織總RNA；樣品處理程序簡單；檢測時(shí)間短；可以同時(shí)檢測多個(gè)樣品。
(2)組織總RNA提取稱取10-50mg的病蝦苗或成蝦組織，用1ml樣品處理液研磨，樣品處理液為4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸鈉鹽，0.1M巰基乙醇，0.2M醋酸鈉，3000g離心10min。取上清加入0.2ml的氯仿，混合30秒，12000g離心10分鐘，取水相0.6ml加入0.5ml的異戊醇混勻，放置10分鐘后，12000g離心10分鐘，75％乙醇洗2次，干燥后用焦碳酸二乙酯處理的雙蒸水溶解。
(3)反應(yīng)體系在50μl反應(yīng)體系內(nèi)，加入4μl 10mM dNTP，2.5μl 100mMDTT，1μl RNA酶抑制劑5U/μl，10μl 5x RT-PCR buffer，2μl的上下游引物(10pmol/μl)，1μl酶混合物，底物為從組織提取的總RNA.
(4)擴(kuò)增條件55℃ 30min，1個(gè)循環(huán)；94℃，30s，55℃ 30s，72℃ 1min30s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 7min，1個(gè)循環(huán)。1.2％瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種羅氏沼蝦諾達(dá)病毒核酸RT-PCR檢測的方法，包括下列步驟(1)設(shè)計(jì)病毒特異引物，上游引物ccacgttcttagtggatcct；下游引物cgtccgcctggtagttcc；(2)組織總RNA提取稱取10-50mg的病蝦苗或成蝦組織，用1ml樣品處理液研磨，3000g離心10min，取上清加入0.2ml的氯仿，混合30秒，12000g離心10分鐘，取水相0.6ml加入0.5ml的異戊醇混勻，放置10分鐘，12000g離心10分鐘，75％乙醇洗2次，干燥后用焦碳酸二乙酯處理的雙蒸水溶解；(3)反應(yīng)體系在50μl反應(yīng)體系內(nèi)，加入4μl 10mM dNTP，2.5μl 100mMDTT，1μl RNA酶抑制劑5U/μl，10μl 5x RT-PCR buffer，2μl的上下游引物，1μl酶混合物，底物為從組織提取的總RNA；(4)擴(kuò)增條件55℃ 30min，1個(gè)循環(huán)；94℃，30s，55℃ 30s，72℃1min30s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 7min，1個(gè)循環(huán)，1.2％瓊脂糖電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種羅氏沼蝦諾達(dá)病毒核酸RT-PCR檢測的方法，其特征在于樣品處理液為4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸鈉鹽，0.1M巰基乙醇，0.2M醋酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羅氏沼蝦諾達(dá)病毒核酸RT－PCR檢測的方法，其步驟是首先設(shè)計(jì)病毒特異引物；其次是組織RNA提取；第三是反應(yīng)體系；第四是擴(kuò)增體系。本發(fā)明靈敏度高，檢測時(shí)間短，適合于羅氏沼蝦肌肉白濁病的病原診斷及親蝦、幼苗和成蝦的健康監(jiān)測。
文檔編號C12Q1/70GK1443855SQ0311873
公開日2003年9月24日 申請日期2003年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月6日
發(fā)明者石正麗, 寶納米·簡·羅伯特 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所