專利名稱：禽白血病雙抗體夾心elisa抗原檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種檢測禽白血病病毒的雙抗體夾心ELISA抗原檢測試劑盒。
背景技術：
禽白血病(Avian leukosis，AL)是由反轉錄病毒科中的禽白血病病毒(Avianleukosis virus，ALV)引起的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，呈世界性分布。根據(jù)病毒宿主范圍、囊膜特性和交叉中和反應的不同，將ALV分為A-JlO個亞群，其中E亞群為內源性ALV，A、B、C、D和J亞群為外源性ALV。由于誘發(fā)腫瘤、患雞胴體廢棄、產蛋性能下降和對雞群生產性能的影響，ALV給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。然而，迄今為止，針對該病尚無可供預防的疫苗和有效藥物，檢測淘汰陽性雞，進而建立無禽白血病種雞群是控制本病的有效途徑。培育無ALV感染雞群時，首先對母雞血清分離病毒，檢測其中的p27抗原，同時檢測泄殖腔棉拭子的P27抗原，選擇ALV陰性和不排泄ALV的母雞的種蛋孵化，然后對孵出的雛雞檢測其泄殖腔拭子中的P27抗原。選用陰性的雛雞分成小群隔離飼養(yǎng)，至6周和25周齡時再檢測ALV,淘汰陽性雞，連續(xù)3-4個世代，可逐步建立起無ALV感染雞群，達到凈化ALV的目的。目前常用的檢測ALV的方法主要包括:病毒分離，免疫熒光檢測(IFA)，瓊脂擴散試驗，ELISA，RT-PCR等。不同方法各有優(yōu)缺點。ELISA抗原檢測方法以其敏感、特異、易于操作而被廣泛使用，適用于大量樣品的快速檢測，更適合基層對該病的檢測。ALV核衣殼蛋白p27由ALV gag基因保守序列編碼，p27蛋白是核衣殼蛋白的主要成分，有許多易于檢測的抗原位點，外源性ALV各亞群間同源性高達90%，在病毒粒子中含量高，占總蛋白成分的30%以上。本專利應用兩株抗ALV p27蛋白的特異性單克隆抗體ALVP27-5D3和ALV P27-4F12研制出了禽白血病病毒雙抗體夾心ELISA抗原檢測試劑盒，能夠快速、準確地檢測ALV病毒，具有很好的特異性和敏感性。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供的禽白血病病毒雙抗體夾心ELISA抗原檢測試劑盒，其包括:(I)包被抗ALVp27蛋白單克隆抗體(捕獲抗原的抗體)的酶標板；(2)酶標記ALVp27蛋白單克隆抗體(檢測抗體)；其中，包被在酶標板的ALVp27蛋白單克隆抗體與酶標記ALVp27蛋白單克隆抗體分別針對ALVp27蛋白不同的抗原決定簇。本發(fā)明以GST-p27純化的蛋白作為抗原制備ALV病毒核衣殼蛋白p27單克隆抗體，得到多個不同抗原決定簇的單克隆抗體，進一步篩選發(fā)現(xiàn)其中2株針對不同表位的雜交瘤細胞株分泌抗體效價高。在本發(fā)明實施例中，包被在酶標板的抗ALV p27蛋白單克隆抗體為雜交瘤細胞株ALVP27-5D3 (保藏號:CGMCCN0.7106)分泌獲得，酶標記ALVp27蛋白單克隆抗體為雜交瘤細胞株ALV P27-4F12 (保藏號:CGMCC N0.7107)分泌獲得。
本發(fā)明所述酶標記抗ALV P27蛋白單克隆抗體的標記酶是辣根過氧化物酶，具體標記方法包括如下步驟:將5mg HRP溶于0.5mL0.lmol/L NaHCO3溶液中；加0.5mlIOmmol/L NaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時。(2)加0.75mL0.lmol/L Na2CO3混勻。(3)加入0.75mL小鼠已處理的腹水，或純化單克隆抗體等(15mg/mL)，混勻。(4)稱取SephadexG-25干粉0.3g,加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用(避光)3小時或4°C過夜。(5)用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20體積新鮮配制的5mg/mL NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20體積的NaBH4溶液，混勻，室溫作用I小時(或4°C過夜)。(6)用等體積的飽和硫酸銨沉淀交聯(lián)物，收集沉淀并用PBS溶解。(7)用Protein G柱純化，4°C過夜透析24_36h，即得純化酶標記抗體。單克隆抗體可按照如下方法包被到酶標板:將3.5yg/mL的單克隆抗體按100 μ L/孔加入到酶標板中，4°C放置12-16h，用PBST洗滌后，用5%脫脂乳封閉，350 μ L/孔，于37 °C放置2h，再用PBST洗滌。此外，本發(fā)明試劑盒還包括以下試劑中的一種或多種:稀釋液、酶標抗體、IOX洗滌液、陽性對照、陰性對照、底物緩沖液、TMB粉劑、TMB溶解液、H2O2溶液、終止液。運用本發(fā)明檢測試劑盒可檢測天然的ALV病毒p27蛋白，以及重組的ALVp27蛋白。本發(fā)明運用雜交瘤細胞技術制備了多株針對ALVp27蛋白的單克隆抗體，篩選出其中可分別識別P27蛋白上2個不同線性表位的2株單克隆抗體(即ALV P27-5D3, ALVP27-4F12)進行了相應的特性鑒定。經(jīng)間接免疫熒光和ELISA方法鑒定，2株單克隆抗體與ALV分離株ALV(GY3)具有良好的反應性。其腹水效價均可達1: 1.5x10s或以上，且分泌抗體的雜交瘤細胞株活性 穩(wěn)定。本發(fā)明用分別針對p27蛋白不同線性表位的2株單克隆抗體對抗原進行捕獲和檢測，相對于僅用一株單克隆抗體建立的抗體夾心ELISA方法來說，敏感性大大提高，更適用于臨床樣本中微量抗原的檢測。本發(fā)明還有一個重要的環(huán)節(jié)就是需要高純度的酶標記抗體，優(yōu)質的酶標記抗體既能保留抗體的免疫學活性，又能保留酶的活性?？贵w的標記率越高，則方法的敏感性越高，所以這就需要摸索出比較成熟的HRP標記抗體的方法；本發(fā)明利用免疫學上的過碘酸鈉法進行標記，并進行了一些細節(jié)上的改進。這有效地保證了本方法的高敏感性。與目前常用于ALV檢測的RT-PCR等方法相比，本發(fā)明建立的雙抗體夾心ELISA抗原檢測法成本低、操作簡便、重復性好，適用于基層臨床推廣應用，具有巨大的經(jīng)濟效益和廣闊的應用前景。本試劑盒的建立為ALV流行病學研究及疫病防控、凈化提供了實用、快速、有效的檢測工具。


圖1顯示的是本發(fā)明ELISA抗原檢測建立的技術路線。.
圖2顯示的是兩株單克隆抗體分別與ALVp27蛋白反應性的Westernblotting鑒定，M.蛋白marker，1.DF-1細胞裂解產物，2，3.感染ALV-J的DF-1細胞裂解產物，4.感染ALV-A的DF-1細胞裂解產物。
圖3顯示的是單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定ALV-J，A.ALV P27-4F12 ；B.ALVP27-5D3 ；C.ALV P27-3C6 ；D.ALV P27-5B10 ；E.ALV P27-1C5。圖4顯示的是兩株腹水純化后的SDS-PAGE，M.Marker ; 1.純化后的ALVP27-5D3IgG ；2.純化后的 ALV P27_4F12IgG。本發(fā)明中雜交瘤細胞株ALV P27-5D3于2013年I月21日保藏到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC N0.7106。雜交瘤細胞株ALV P27-4F12于2013年I月21日保藏到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC N0.7107。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟 或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1雙抗夾心ELISA抗原檢測方法的建立一、單克隆杭體的制備1.單克隆抗體的制備(技術路線見圖1)根據(jù)已發(fā)表的ALV JS-nt株的基因序列(登錄號:HM235667)，設計合成了一對針對P27的特異性引物，在上下游分別添加了 BamHI和XhoI酶切位點，由上海英駿公司合成。引物序列如下:上游引物 5' -GCGGATCCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG-3' (SEQ ID N0.1)；下游引物5' -GCCTCGAGTTAGGCCGCGGCTATGCCT-3' (SEQ ID N0.2) 用PCR的方法從ALV基因組中擴增出了 p27基因，并將擴增片段克隆至pGEX-6P-l表達載體(GE公司產品)中，篩選重組菌pGEX-6p-l-P27/BL21，用IPTG誘導蛋白表達GST-p27，并利用GE公司蛋白預裝柱純化蛋白，得到純化的GST-p27融合蛋白。用上述純化的GST-p27融合蛋白腹腔注射6周齡雌性BALB/C小鼠，共三次，每次間隔14天，劑量分別為50、100、150 μ g/只。融合前加強免疫，200 μ g/只，加強免疫后72-96h按常規(guī)方法進行細胞融合，融合后第10天用預冷丙酮乙醇(3:2，v/v)固定感染ALV-J的DF-1細胞，經(jīng)間接免疫熒光(IFA)檢測融合細胞上清中的抗體，篩選陽性雜交瘤細胞；同時用包被GST-p27蛋白，間接ELISA檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清中的抗體，用非重組菌裂解上清GST作對照，篩選陽性雜交瘤細胞。所有檢測強陽性孔的融合細胞轉到24孔板，進行擴大培養(yǎng)，同時選擇5個熒光亮度強并且ELISA值高的孔進行亞克隆。最終獲得了 5株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的細胞株，分別命名為ALV P27-5D3、ALV P27_4F12、ALV P27-5B10、ALV P27-1C5 和 ALV P27-3C6。參照Barton F等(1983)的方法制備單克隆抗體的腹水:主要步驟是挑選雌性或者個體大的雄性BALB/c小鼠，每只腹腔注射滅菌石蠟油0.5mL, 10-14天后，將狀態(tài)良好的雜交瘤細胞從細胞培養(yǎng)瓶內輕輕吹下，1000rpm/min離心lOmin，棄上清，用無菌PBS懸浮，計數(shù)；每只小鼠腹腔注射雜交瘤細胞5χ105-1χ106個，注射后輕柔小鼠腹部，使細胞均勻分散于小鼠的腹腔中；7_10天后，可見小鼠腹部明顯增大，采集腹水；將腹水5000rpm/min離心lOmin，收集上清，即為單克隆抗體腹水，-20°C保存?zhèn)溆谩?.單克隆抗體的鑒定2.1單克隆抗體的間接免疫熒光鑒定將單克隆抗體ALV P27-5D3, ALV P27-4F12、ALV P27-5B10、ALV P27-1C5 和ALVP27-3C6 分別用 ALV-J GY3 (ffu X,2010Vet Res Commun, 2010.34 (7):ρ.619-32)感染DFl細胞進行間接免疫熒光檢測，同時設SP2/0細胞培養(yǎng)上清液對照。結果顯示獲得的5株單克隆抗體對ALV-J的感染的細胞都具有特異性熒光，SP2/0細胞上清液沒有熒光，為陰性(如圖3)。2.1單克隆抗體識別表位的分析采用相加指數(shù)法測定單克隆抗體的抗原識別表位。即用ρ27蛋白以3.5 μ g/mL濃度ΙΟΟμ L包被酶標板，封閉、洗滌后分別加入飽和稀釋度的單克隆抗體，37°C作用60min，再洗滌后每孔分別兩兩組合加入另一株單克隆抗體，37°C作用60min，同樣洗滌后加入工作濃度的HRP標記山羊抗小鼠二抗(Sigma公司產品),37°C作用60min,最后再洗漆,底物顯色測定0D450nm值。按如下公式計算兩種單克隆抗體疊加后的Al值:Al= (Al.2-Α1)/Α2χ100%(Α1.2:表示2株單克隆抗體疊加后的OD值；Al:表示第I株單克隆抗體自身疊加的OD值;A2:表示第2株單克隆抗體自身疊加的OD值)。當兩兩抗體疊加之后的Al值大于30%，判為兩株單克隆抗體識別不同位點。經(jīng)過相加指數(shù)計算，并結合單克隆抗體腹水效價和間接免疫熒光結果，確定識別2個不同表位的單克隆抗體代表株分別為ALV P27-5D3和ALV P27-4F12。2.2雜交瘤細胞上清及腹水中單克隆抗體效價的測定雜交瘤細胞培養(yǎng)上清從1:100開始作2倍比稀釋，純化的腹水從1:1000開始作2倍比稀釋，按間接ELISA方法測定其效價。細胞培養(yǎng)上清和純化的腹水的效價測定結果分別見表1、表2。表I兩株單克隆雜交瘤細胞培養(yǎng)上清抗體ELISA效價
權利要求
1.禽白血病雙抗體夾心ELISA抗原檢測試劑盒，其包括: (1)包被抗ALVp27蛋白單克隆抗體的酶標板； (2)酶標記抗ALVp27蛋白單克隆抗體； 其中，包被在酶標板的抗ALV p27蛋白單克隆抗體與酶標記抗ALV p27蛋白單克隆抗體分別針對ALV p27蛋白不同的抗原決定簇；包被在酶標板的抗ALV p27蛋白單克隆抗體為保藏號CGMCC N0.7106的雜交瘤細胞株ALV P27-5D3分泌獲得，酶標記抗ALV p27蛋白單克隆抗體為保藏號CGMCC N0.7107的雜交瘤細胞株ALV P27-4F12分泌獲得。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標記ALVp27蛋白單克隆抗體的標記酶為辣根過氧化物酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種禽白血病雙抗體夾心ELISA抗原檢測試劑盒，其中包括包被抗ALVp27蛋白單克隆抗體的酶標板、酶標記抗ALVp27蛋白單克隆抗體等。捕獲抗體和檢測抗體分別針對p27蛋白不同的抗原決定簇；包被在酶標板的抗ALVp27蛋白單克隆抗體由雜交瘤細胞株ALVP27-5D3分泌獲得，酶標記抗ALVp27蛋白單克隆抗體由雜交瘤細胞株ALVP27-4F12分泌獲得。本發(fā)明試劑盒操作簡便、快速，可以用于ALV所有亞群病毒的檢測，適用于基層各級獸醫(yī)部門和出入境禽白血病的快速大量篩選檢測。該方法所需成本低廉，經(jīng)濟效益顯著、應用前景廣泛。
文檔編號G01N33/577GK103163299SQ201310046928
公開日2013年6月19日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權日2013年2月5日
發(fā)明者秦愛建, 錢琨, 尹麗平, 韶紅霞, 金文杰 申請人:揚州大學