完成后加熱； (2-5)按照S-Zn-S-Zn逐層對其進(jìn)行ZnS殼層包覆，形成ZnO/ZnS量子點(diǎn)，反應(yīng)4~8小 時(shí)后終止，再次使用乙酸乙醋沉淀出不同粒徑的ZnO/ZnS核殼納米顆粒，離心分離出ZnO/ ZnS核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)。3. -種基于天然產(chǎn)物單體和納米探針的納米藥物的制備方法，其特征在于，通過酰胺 化反應(yīng)，將天然產(chǎn)物單體與氨基化PEG連接成藥物分子-PEG的聚合物，然后通過相轉(zhuǎn)移的 方法將該聚合物連接到量子點(diǎn)表面，進(jìn)而形成具有靶向性的熒光納米藥物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的納米藥物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (3-1)以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)為載體，通過表面修飾單抗GC-33制備靶向腫瘤 標(biāo)志物GPC-3的熒光納米探針GC-QDs 1~10 ml ; (3-2)取天然產(chǎn)物單體配置成I. 0~10. 0 mg/ml的藥物溶液，備用； (3-3)取5~15mg的碳化二亞胺、1~5 mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺加水I. 0~5. Oml溶解； (3-4)取步驟（3-3)所制溶液0. 5 ml，加入到0. 3~1.0ml按步驟（3-2)配置的藥物溶 液中，定容至I. 0 ml，37°C搖床反應(yīng)1~3小時(shí)； (3-5)向上述混合溶液中以1~2滴/秒滴加2mg/ml的氨基化PEG溶液l~5ml，然后在 37°C的恒溫下反應(yīng)2~4小時(shí)，攪拌速度200~1000轉(zhuǎn)/min，制備成藥物分子-PEG的聚合物， 純化后用PBS重新溶解，備用； (3-6)將藥物分子-PEG的聚合物溶液與步驟（3-1)配置的納米探針GC-QDs溶液，按照 等質(zhì)量濃度混合，室溫下攪拌反應(yīng)3~6小時(shí)，將藥物分子連接到納米探針的表面； (3-7)15000 rpm離心30~50分鐘，收集上清液，并將沉淀物重新溶于PBS中，制成靶向 GPC-3的熒光納米藥物GC-QDs-Drug。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的納米藥物的制備方法，其特征在于，所述步驟（3-1)中納米探 針GC-QDs的制備步驟如下： (4-1)制備以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)； (4-2)取2~10 ml以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)溶液超生分散，15000 rpm轉(zhuǎn)離心 30~50 min，加超純水0. 5 ml，備用； (4-3)取5~20 mg的碳化二亞胺，l~10mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺加水I. 0 ml溶解； (4-4)取上述溶液0. 3~1. 0 ml加入以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)溶液中，定容至 I. 0~5. 0 ml，37°C搖床反應(yīng)1~2小時(shí)； (4-5) 15000 rpm高速離心30~50分鐘，棄上清，用pH 8. 5的PBS溶液250~1000 y 1 重新溶解； (4-6)加5~20 y 1的靶向GPC-3的單抗GC-33溶液，37°C的恒溫下，搖床反應(yīng)2~3小 時(shí)，將單抗GC-33修飾到以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)的表面； (4-7)15000 rpm離心30~50分鐘，溶于pH 7. 2的PBS溶液中，分離提純得到靶向腫瘤 標(biāo)志物GPC-3的熒光納米探針。6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的納米藥物的制備方法，其特征在于，所述天然產(chǎn)物單體為 具藥效作用的天然活性單體，所述天然活性單體選用分子結(jié)構(gòu)帶羧基且為非活性基團(tuán)的單 體。7. -種如權(quán)利要求4~6中任一項(xiàng)所述的納米藥物的應(yīng)用，其特征在于，包括納米藥物 體外藥物控制釋放曲線的測定、納米藥物對體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞H印G2生長抑制率的測 定、納米藥物促進(jìn)肝癌細(xì)胞H印G2凋亡的體外測試實(shí)驗(yàn)、納米藥物對肝癌細(xì)胞的標(biāo)記。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米藥物的應(yīng)用，其特征在于，納米藥物對體外培養(yǎng)的肝癌 細(xì)胞H印G2生長抑制率的測定，步驟如下： (5-1)胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞IfepG2,制成密度為IXlO5個(gè)/mL單 細(xì)胞懸液，接種于96孔板中； (5-2)細(xì)胞處于37 °C，含有5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng) 液，用濃度分別為〇? 0625 y g/mL、0. 125 y g/mL、0. 25 y g/mL、0. 50 y g/mL、L 00 y g/mL、2. 00 yg/mL的藥物分子溶液干預(yù)肝癌細(xì)胞，作為陰性對照組；以相當(dāng)于藥物分子溶液濃度的納 米藥物干預(yù)肝癌細(xì)胞并作為陽性組；并設(shè)立空白對照組， (5-3)細(xì)胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每個(gè)濃度點(diǎn)設(shè)三個(gè)復(fù)孔； (5-4)培養(yǎng)時(shí)間終止后每孔加入5 mg/mL的噻唑藍(lán)MTT溶液20 ML繼續(xù)培養(yǎng)4 h ; (5-5)吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 ML，終止反應(yīng)； (5-6)將96孔板移入平板震蕩器，避光水平震蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，然 后用酶聯(lián)免疫檢測儀于492 nm波長處測定每孔吸光度OD值，并以空白對照孔的OD值調(diào)零， 結(jié)果以每組3復(fù)孔的均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次； 細(xì)胞生長抑制率用下式計(jì)算： 細(xì)胞生長抑制率（％) = [I- (OD實(shí)驗(yàn)值/OD對照值）]X 100%。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米藥物的應(yīng)用，其特征在于，納米藥物促進(jìn)肝癌細(xì)胞IfepG2 凋亡的體外測試實(shí)驗(yàn)，包括如下步驟： (6-1)胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞H印G2,制成密度為IXlO5個(gè)/mL單 細(xì)胞懸液，接種于96孔板中； (6-2)細(xì)胞處于37 °C，含有5% CO2的濕潤培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)液， 分別用I yg/mL的天然產(chǎn)物單體和納米藥物與肝癌細(xì)胞H印G2共孵育； (6-3)孵育24h之后，棄去培養(yǎng)基，用pH7.4的PBS溶液沖洗2~3次之后，甲醇固定IOmin； (6-4)棄去甲醇，晾干后，加DAPI工作液洗染色5~10 min ; (6-5)棄去染色液，用PBS溶液沖洗背景2~3次，再用蒸餾水沖洗，晾干后觀察，熒光顯 微鏡以340/380 nm紫外光激發(fā)，觀察、拍照。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米藥物的應(yīng)用，其特征在于，納米藥物對肝癌細(xì)胞的標(biāo) 記，步驟如下： (7-1)胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞IfepG2,制成密度為IXlO5個(gè)/mL單 細(xì)胞懸液，接種于35 mm的薄層玻底培養(yǎng)皿中； (7-2)培養(yǎng)24 h之后更換新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞分別用I y g/mL的天然產(chǎn)物單體、5 y g/mL 的納米探針GC-QDs和5 y g/mL的納米藥物GC-QDs-Drug進(jìn)行共孵育； (7-3)孵育6 h后棄掉培養(yǎng)基，用pH值7. 4的PBS溶液輕輕洗滌細(xì)胞2次，最后將細(xì) 胞置于PBS緩沖液環(huán)境中； (7-4)將培養(yǎng)皿直接置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，拍照，通過激光共聚焦熒光顯 微鏡觀察不同肝癌細(xì)胞，對肝癌細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種納米探針的制備方法、基于天然產(chǎn)物單體和納米探針的納米藥物的制備方法及應(yīng)用，所述納米藥物的制備方法為通過酰胺化反應(yīng)，將天然產(chǎn)物單體與氨基化PEG連接成藥物分子-PEG的聚合物，然后通過相轉(zhuǎn)移的方法將該聚合物連接到量子點(diǎn)表面，進(jìn)而形成具有靶向性的熒光納米藥物。本發(fā)明通過簡單可行的方法將天然產(chǎn)物單體負(fù)載到納米探針的表面，相比于常用的口服自微乳、固體脂質(zhì)納米粒等幾種劑型，該微納結(jié)構(gòu)的納米藥物更有利于藥物的釋放，提高藥物利用率，并且表面修飾之后，納米探針的熒光特性沒有影響。
【IPC分類】A61K47/02, A61P35/00, A61K9/00, A61K47/42, A61K47/48, A61K31/56, A61K49/00
【公開號】CN105126123
【申請?zhí)枴緾N201510630962
【發(fā)明人】李景源, 邵義祥, 姚登福, 朱順星, 蔣茂榮, 劉春
【申請人】南通大學(xué)
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月29日