專(zhuān)利名稱(chēng)：一種能減輕色變的大豆蛋白酶解方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶催化技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種在不外加堿的pH值漸變條件下酶解大豆蛋白制備小于10個(gè)氨基酸的寡肽混合物，同時(shí)抑制酶解液色變的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)的研究表明，大豆蛋白肽除具有與大豆蛋白一樣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值之外，還具有多種生理保健功能。因此，研究大豆蛋白轉(zhuǎn)化為大豆蛋白肽的方法受到人們的關(guān)注。
用酶解法獲得大豆蛋白肽具有條件緩和，環(huán)境友好和不破壞營(yíng)養(yǎng)等好處，是大豆蛋白水解技術(shù)開(kāi)發(fā)的方向。專(zhuān)利CN1151848A、CN1168770A、CN1323535A和CN1344138中披露了酶解大豆蛋白的具體方法，其中均要求在酶解過(guò)程中不斷向酶解液中補(bǔ)加強(qiáng)堿溶液，通過(guò)維持酶解液pH值來(lái)保持堿性蛋白酶的酶解活性，進(jìn)而得到滿意的原料(底物)降解率和寡肽含量。這些方法的問(wèn)題在于，維持pH值的堿溶液在酶解物中會(huì)產(chǎn)生明顯的堿性異味并引入鹽類(lèi)雜質(zhì)，因此在下游處理中必須采用復(fù)雜的脫鹽除雜操作。為此，我們?cè)谇捌谏陥?bào)的中國(guó)專(zhuān)利(03110987.X)中，提出了一種利用堿性蛋白酶與酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的協(xié)同酶解作用，在不外加堿的pH值漸變條件下酶解大豆蛋白制備寡肽的方法。但該方法的不足之處在于，大豆蛋白酶解轉(zhuǎn)化為寡肽的過(guò)程中往往伴隨有色素物質(zhì)生成，導(dǎo)致酶解物呈現(xiàn)深褐色乃至黑褐色，限制了其在食品中的應(yīng)用。
實(shí)際上，在發(fā)酵工業(yè)中，發(fā)酵液的色變問(wèn)題帶有一定普遍性。以下專(zhuān)利文獻(xiàn)和公開(kāi)文獻(xiàn)提供了一些脫色方法公開(kāi)文獻(xiàn)氨基酸和生物資源，18，1(1996)18-19中報(bào)道了對(duì)豬血粉水解制得的氨基酸混合物用活性炭方法脫色的條件和效果；食品科學(xué)，19，7(1998)17-20中報(bào)道了對(duì)魚(yú)蛋白水解制得的魚(yú)蛋白水解液用活性炭脫色的條件和效果；食品工業(yè)科技，20，3(1999)27-28中報(bào)道了對(duì)新鮮豬血水解制得的食用蛋白酶解物用活性炭脫色的條件和效果；糧食與油脂，3(2001)5-7中報(bào)道了對(duì)大豆蛋白水解制得的大豆蛋白肽水解物用活性炭脫色的條件和效果。專(zhuān)利文獻(xiàn)CN 1291449A中披露了對(duì)用豆粕、麩皮和小麥制得的醬油產(chǎn)品用活性炭處理的方法；專(zhuān)利文獻(xiàn)CN 1336441A中披露了離子交換樹(shù)脂用于糖漿吸附脫色的方法；專(zhuān)利文獻(xiàn)CN 1397192A中披露了對(duì)脫脂蠶蛹粉水解制得的蛋白水解液用H2O2氧化脫色的方法。以上專(zhuān)利文獻(xiàn)和公開(kāi)文獻(xiàn)所批露的脫色方法均屬于后處理脫色方法，在實(shí)施工藝上需要至少一個(gè)專(zhuān)門(mén)的設(shè)備和一個(gè)獨(dú)立的單元操作。不僅如此，以上各種方法的脫色能力有限。其中，用各種吸附法脫色還會(huì)降低目的產(chǎn)物的產(chǎn)率。
顯然，在蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中抑制色素物質(zhì)生成，是解決蛋白質(zhì)酶解物顏色問(wèn)題的最佳辦法。但是，迄今尚未見(jiàn)到公開(kāi)或?qū)＠墨I(xiàn)涉及在蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中進(jìn)行色素抑制的細(xì)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在不外加堿的pH值漸變條件下酶解大豆蛋白制備小于10個(gè)氨基酸的寡肽混合物時(shí)抑制酶解液色變的方法。
經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在不外加堿的PH值漸變條件下，當(dāng)大豆蛋白在堿性蛋白酶與酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的協(xié)同作用下酶解時(shí)，酶解液的色變主要與美拉德副反應(yīng)(Maillard reaction)有關(guān)。美拉德反應(yīng)亦即羰氨反應(yīng)，是指氨基酸及蛋白質(zhì)中的氨基和還原糖或還原糖分解物中的羰基之間發(fā)生的反應(yīng)。該反應(yīng)最終生成棕色甚至黑色的大分子物質(zhì)類(lèi)黑精或稱(chēng)擬黑素。在大豆蛋白酶解中，參與美拉德反應(yīng)的還原糖及還原糖分解物來(lái)自于大豆蛋白中含有的低聚糖。因此，本發(fā)明利用事先加入到酶解罐中的少量色變抑制劑(氧化劑或還原劑)將大豆蛋白在酶解過(guò)程中釋放出的低聚糖的羰基分解或轉(zhuǎn)化為羥基，達(dá)到抑制美拉德反應(yīng)，進(jìn)而抑制酶解液色變的目的。
本發(fā)明的技術(shù)方案和實(shí)施步驟是向帶有機(jī)械攪拌裝置的普通發(fā)酵罐中加入適量自來(lái)水，并按照底物濃度要求向其中加入一定量的大豆蛋白。啟動(dòng)機(jī)械攪拌漿，使之以適當(dāng)?shù)乃俣葦噭?dòng)漿液，同時(shí)通過(guò)水夾套或/和水蒸汽直接接觸將反應(yīng)漿液溫度提到指定溫度。用pH計(jì)和固定于發(fā)酵器內(nèi)的pH計(jì)電極測(cè)定酶解反應(yīng)之前的漿液酸堿度。然后，向發(fā)酵罐中加入計(jì)量的蛋白酶和色變抑制劑(氧化劑或還原劑)，開(kāi)始酶解反應(yīng)。最后，用pH計(jì)監(jiān)測(cè)酶解液酸堿度的變化，并通過(guò)采樣(攪拌均勻的酶解液)分析不同時(shí)刻的原料降解率、蛋白質(zhì)水解度。酶解反應(yīng)結(jié)束之后，將酶解液在95℃煮沸5-10分鐘滅活。
適合本發(fā)明的堿性蛋白酶如堿性霉菌蛋白酶(來(lái)源于米曲霉，使用pH值6.5-8.5，使用溫度45-60℃)，堿性細(xì)菌蛋白酶(來(lái)源于地衣芽孢桿菌，使用pH值6.5-8.5，使用溫度55-70℃)，Alcalase堿性細(xì)菌蛋白酶(來(lái)源于枯草桿菌，使用pH值6.5-8.5，使用溫度55-70℃)。
適合本發(fā)明的酸性蛋白酶如酸性霉菌蛋白酶(來(lái)源于黑曲霉，使用pH值2-5.0，使用溫度45-55℃)，胃蛋白酶(來(lái)源于動(dòng)物胃，使用pH值1.0-3.0，使用溫度30-40℃)。
適合本發(fā)明的中性蛋白酶如中性霉菌蛋白酶(來(lái)源于米曲霉，使用pH值5.0-7.5，使用溫度50-65℃)、中性細(xì)菌蛋白酶(來(lái)源于枯草芽孢桿菌，使用pH值4.5-7.0，使用溫度45-60℃)、ProtamexTM細(xì)菌蛋白酶(屬于桿菌蛋白酶復(fù)合體，使用pH值5.5-7.5，使用溫度55-60℃)。
在本發(fā)明中，堿性蛋白酶要與酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶配合使用。如果允許使用溫度范圍相近，則酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶可以與堿性蛋白酶同時(shí)加入酶解罐。如果酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的允許使用溫度低于堿性蛋白酶的使用溫度，則應(yīng)在堿性蛋白酶的酶解活性基本消失之后(即酶解液的pH值停止下降之后)再向發(fā)酵罐中加入酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶。并將酶解溫度調(diào)整到酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的適宜使用溫度。
在以上所說(shuō)的堿性蛋白酶與酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶配合使用方案中，堿性蛋白酶可以是一種酶，也可以是復(fù)合堿性蛋白酶。同樣，酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶可以是一種酶，也可以是復(fù)合酸性蛋白酶或/和復(fù)合中性蛋白酶。
為了充分發(fā)揮堿性蛋白酶與酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的協(xié)同酶解作用，堿性蛋白酶、酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的投放量(在本發(fā)明中表示為酶溶液與底物比，或酶固體占底物重量的百分率)可根據(jù)其活力不同，由這一領(lǐng)域中的工程師用慣用的方法確定。酶解溫度的選擇主要取決于酶的使用溫度。在堿性蛋白酶與酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶同時(shí)加入的方式中，酶解溫度應(yīng)根據(jù)使用溫度最低的酶來(lái)定。在堿性蛋白酶與酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶分步加入的方式中，酶解溫度可根據(jù)不同酶解階段所使用的酶的允許使用溫度來(lái)調(diào)整。根據(jù)本發(fā)明，酶解反應(yīng)溫度的選擇范圍為30-70℃。
適合本發(fā)明的大豆蛋白原料(底物)如大豆分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白、脫脂大豆粉、大豆粕和豆餅等。其中，優(yōu)選大豆分離蛋白和大豆?jié)饪s蛋白。根據(jù)本發(fā)明，底物濃度的選擇范圍為20-100克/升。底物濃度太高時(shí)，酶的酶解活性低，難以得到滿意的底物降解率。另一方面，底物濃度太低，雖然酶的酶解活性高，但會(huì)增加下游處理過(guò)程中蒸發(fā)、濃縮酶解液的難度。當(dāng)把適量的大豆分離蛋白或脫脂大豆粉在攪拌下加入自來(lái)水中并加熱到如上所述的酶解溫度范圍時(shí)，大豆蛋白漿液的初始pH值能達(dá)到7-7.5，能夠滿足堿性蛋白酶對(duì)酸堿度的要求。
大豆蛋白在以上所述的條件下酶解的適宜時(shí)間范圍為2-24小時(shí)。在酶解過(guò)程中，底物降解率和蛋白質(zhì)水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但酶解物的顏色也隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而轉(zhuǎn)深。酶解時(shí)間太短時(shí)，不利于得到滿意的底物降解率和蛋白質(zhì)水解度。相反，如果酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則不但無(wú)益于抑制酶解液的色變，而且酶解液容易在微生物作用下變質(zhì)。
關(guān)于在不外加堿的pH值漸變條件下利用堿性蛋白酶與酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的協(xié)同酶解作用從大豆蛋白獲得寡肽酶解物的實(shí)施方法和效果已經(jīng)在我們前期發(fā)明專(zhuān)利中做了闡述(中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?3110987.X)。因此，本發(fā)明的關(guān)鍵是色變抑制劑的選擇與使用。尤其重要的是，色變抑制劑應(yīng)屬于食品加工中允許使用的藥劑，其用量應(yīng)不影響所使用酶的活性，更不能高于食品法規(guī)的限量(按干燥后的酶解物考慮)。
本發(fā)明采用的色變抑制劑屬于氧化劑和還原劑。其中氧化劑指H2O2，還原劑指Na2SO3、Na2S2O5和NaHSO3。以上藥劑在食品中使用已獲得中國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB2760-1996)許可如Na2S2O5(焦亞硫酸鈉)，Na2SO3(亞硫酸鈉)和NaHSO3(亞硫酸氫鈉)可用于蜜餞、餅干、葡萄糖、食糖、冰糖、飴糖、糖果、液體葡萄糖、竹筍、蘑菇，蘑菇罐頭，蜜餞等液體和固體產(chǎn)品，加入限量不高于千分之零點(diǎn)六，一般在千分之零點(diǎn)四五以下。而過(guò)氧化氫(H2O2)已用于生牛乳保鮮，加入限量為0.03％過(guò)氧化氫2.0毫升/升。
由于根據(jù)用本發(fā)明所得的酶解液將不做脫鹽處理，因此將色變抑制劑Na2SO3、Na2S2O5和NaHSO3的用量限定在千分之零點(diǎn)五以下。對(duì)于過(guò)氧化氫，限定用量為千分之二以下，因?yàn)檫^(guò)氧化氫在酶解及酶解后的下游處理過(guò)程中能借受熱條件自行分解掉。在上述用量范圍內(nèi)，各種色變抑制劑均不影響酶活性。
本發(fā)明的實(shí)施效果是可用底物降解率，蛋白質(zhì)水解度和色變抑制率來(lái)衡量。
底物降解率定義為被酶解的大豆蛋白原料重量占投料的大豆蛋白原料重量的百分比；水解度定義為在酶解過(guò)程中打開(kāi)的肽鍵數(shù)量占蛋白質(zhì)分子總肽鍵數(shù)量的百分比。
降解率的測(cè)定方法如下酶解液在4000r/min下離心10min，把上層清液和固體物分離，將固體不溶物在110℃下干燥至恒重，稱(chēng)重。然后按下式計(jì)算底物降解率 其中，大豆蛋白投料量折算成干基。大豆蛋白的含水量是在110℃下干燥至恒重后測(cè)定的。底物降解率越高，表示原料的單程利用率高。
蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定采用甲醛滴定法，具體測(cè)定方法如下將酶解液在4000r/min下離心10min，取5ml上層清液，用0.1M的NaOH溶液滴定到pH＝8.2，加入5ml 37％的甲醛溶液(所用甲醛溶液先用NaOH滴定到pH＝8.2)，再用0.1M的NaOH滴定到pH＝8.2。記錄加入甲醛后把溶液滴定到pH＝8.2所耗堿量。pH值測(cè)量使用精密pH計(jì)。然后按照下式計(jì)算蛋白質(zhì)的酶解度 其中，大豆蛋白徹底水解的方法是將大豆蛋白在6M HCl中于105-110℃下水解24個(gè)小時(shí)。蛋白質(zhì)的水解度高，表示酶解物的平均分子量小。
在本發(fā)明中，色變抑制效果用色變抑制率表示，色變抑制率采用分光光度法測(cè)定。具體測(cè)定方法如下取酶解液的離心上清液用0.22微米的微孔濾膜過(guò)濾，然后用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)400nm處測(cè)其吸光度值。色素抑制率用下式計(jì)算 式中A0為未加色變抑制劑的酶解液吸光度；A為加色變抑制劑后的酶解液吸光度。
本發(fā)明的益處是，利用堿性蛋白酶與酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的協(xié)同酶解作用，在不外加堿的pH值漸變條件下可使大豆蛋白原料的降解率達(dá)到70％以上，蛋白質(zhì)的酶解度達(dá)到20％以上。同時(shí)，利用色變抑制劑可使酶解液的色變抑制率達(dá)到50％以上。利用本發(fā)明，可以省去酶解物下游處理過(guò)程中的脫鹽和脫色工序，有利于降低寡肽酶解物的生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式
以下詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例。
實(shí)施例1(對(duì)比實(shí)施例)將8g大豆分離蛋白(干基重量)和200ml自來(lái)水加入帶有水夾套的酶解罐中，在攪拌下將酶解罐內(nèi)的溫度提高到60℃。通過(guò)pH計(jì)測(cè)得酶解罐內(nèi)料液的pH值約為7.0。然后，向酶解罐內(nèi)加入120μl Alcalase堿性蛋白酶(2.4L，標(biāo)示活力為2.4AU/克，丹麥NOVO公司出品)和0.48克黑曲霉酸性蛋白酶(酶活力3000u/g)，在不斷攪拌下開(kāi)始酶解。在本例中，底物濃度為40克大豆分離蛋白/升水，Alcalase溶液與底物的比為15μl/克大豆分離蛋白，黑曲霉酸性蛋白酶占底物6％(以底物干基重量為基準(zhǔn))，總酶解時(shí)間為6小時(shí)，底物降解率約71％，蛋白質(zhì)水解度約22％。酶解清液為深褐色。
實(shí)施例2(根據(jù)本發(fā)明)重復(fù)實(shí)施例1，但向酶解罐中加入Alcalase和黑曲霉酸性蛋白酶的同時(shí)，向其中加入相當(dāng)于大豆蛋白原料干基重0.12‰的過(guò)氧化氫(即30％雙氧水4.8毫克)。則底物降解率仍為約71％，蛋白質(zhì)水解度仍為約22％，但酶解清液顏色明顯變淺，色變抑制率達(dá)到29.3％。
實(shí)施例3(根據(jù)本發(fā)明)重復(fù)實(shí)施例2，但加入的過(guò)氧化氫依次為大豆蛋白原料干基重的0.06‰、0.25‰、0.50‰和1.9‰。則在此四種情況下，底物降解率和蛋白質(zhì)水解度仍然都保持在71％和22％左右，但酶解清液顏色隨著過(guò)氧化氫加入量的增加而變淺，色變抑制率依次為25％、32.4％、35％和51.8％。用碘滴定法在過(guò)氧化氫加入量為1.9‰的酶解液中未檢測(cè)出殘存過(guò)氧化氫。說(shuō)明過(guò)氧化氫經(jīng)過(guò)95℃的高溫滅活已經(jīng)分解。
實(shí)施例4(根據(jù)本發(fā)明)重復(fù)實(shí)施例2，但用Na2SO3(亞硫酸鈉)代替過(guò)氧化氫作為色變抑制劑。Na2SO3的加入量依次相當(dāng)于大豆蛋白原料干基重的0.12‰、0.25‰、0.48‰。則在此三種情況下，底物降解率和蛋白質(zhì)水解度均保持在71％和22％左右，但酶解清液顏色隨著Na2SO3加入量的增加而變淺，色變抑制率依次為18.4％、22.0％和24.2％。
實(shí)施例5(根據(jù)本發(fā)明)重復(fù)實(shí)施例2，但用NaHSO3(亞硫酸氫鈉)代替過(guò)氧化氫作為色變抑制劑。NaHSO3的加入量依次相當(dāng)于大豆蛋白原料干基重的0.06‰、0.12‰、0.25‰和0.50‰。則在此四種情況下，底物降解率和蛋白質(zhì)水解度均保持在71％和22％左右，但酶解清液顏色隨著NaHSO3加入量的增加而變淺，色變抑制率依次為19.0％、20.6％和22.0％和27.1％。
實(shí)施例6(根據(jù)本發(fā)明)重復(fù)實(shí)施例2，但用Na2S2O5(焦亞硫酸鈉)代替過(guò)氧化氫作為色變抑制劑。Na2S2O5的加入量依次相當(dāng)于大豆蛋白原料干基重的0.06‰、0.12‰、0.25‰和0.48‰。則在此四種情況下，底物降解率和蛋白質(zhì)水解度均保持在71％和22％左右，但酶解清液顏色隨著Na2S2O5加入量的增加而變淺，色變抑制率依次為15.2％、17.9％、21.4％和25.8％。
權(quán)利要求
1.一種能減輕色變的大豆蛋白酶解方法，是當(dāng)酶解反應(yīng)在堿性蛋白酶與酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的協(xié)同作用下，在不外加堿的pH值漸變環(huán)境中進(jìn)行時(shí)，酶解罐中還加有能抑制有色物質(zhì)產(chǎn)生的氧化劑或還原劑，其特征在于，所說(shuō)的氧化劑是H2O2，還原劑是Na2SO3、Na2S2O5和NaHSO3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能減輕色變的大豆蛋白酶解方法，其特征在于，堿性蛋白酶指堿性霉菌酶，堿性細(xì)菌酶及其任意復(fù)合物，酸性蛋白酶指酸性霉菌酶，胃蛋白酶及其任意復(fù)合物，中性蛋白酶指中性霉菌酶，中性細(xì)菌酶及其任意復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能減輕色變的大豆蛋白酶解方法，其特征在于，作為酶解原料的大豆蛋白指大豆?jié)饪s蛋白，大豆分離蛋白，脫脂大豆粉，大豆粕和豆餅中的任何一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種能減輕色變的大豆蛋白酶解方法，其特征在于，酶解反應(yīng)在30-70℃，底物濃度20-100克/升，水解時(shí)間2-24小時(shí)條件下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶催化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種能減輕色變的酶水解大豆蛋白制備小于10個(gè)氨基酸的寡肽混合物的方法。其主要技術(shù)特征是，在不外加堿的pH值漸變條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)水解的同時(shí)，向水解罐中引入能阻止還原糖與氨基酸及蛋白質(zhì)的氨基之間發(fā)生美拉德反應(yīng)的抑制劑。本發(fā)明的效果和益處是，可以使大豆蛋白水解物的下游處理既省去脫鹽步驟，又省去脫色步驟。
文檔編號(hào)A23J3/34GK1491572SQ03134188
公開(kāi)日2004年4月28日 申請(qǐng)日期2003年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月28日
發(fā)明者郭洪臣, 班玉鳳, 李巖, 毛生貴, 陳黎行, 王祥生 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)