本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種丁香葉忍冬組培快繁的方法。

背景技術(shù)：

丁香葉忍冬(學(xué)名：Lonicera oblata)是忍冬科忍冬屬的植物，是中國的特有植物。分布在中國大陸的河北等地，生長于海拔1,200米的地區(qū)，一般生于多石山坡上，目前尚未由人工引種栽培。

在2008年3月公布的《北京市重點保護野生植物名錄》中，丁香葉忍冬位列其中，為北京市二級重點保護野生植物。目前可以見到的丁香葉忍冬位于延慶松山百瀑泉西北約200m處在海拔1100m以上的林下，上層喬木有油松、華北五角楓等，僅有兩株。因此，保護丁香葉忍冬，擴大其存在數(shù)量達(dá)到了刻不容緩的地步。而組培由于其性狀穩(wěn)定、繁殖速度快等優(yōu)點，是擴大其存在數(shù)量的一種有效的手段，但是目前對于丁香葉忍冬的研究較少，更沒有關(guān)于丁香葉忍冬組織培養(yǎng)方面的研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種丁香葉忍冬組培快繁的方法，能夠快速建立起丁香葉忍冬的組培快繁體系，可以實現(xiàn)丁香葉忍冬的快速增殖。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種丁香葉忍冬組培快繁的方法，包括如下步驟：

(1)外植體的選擇及處理：外植體用野外植株莖段的腋芽，野外采集外植體應(yīng)避免二次污染，用剪刀剪下莖段以干凈封口袋保存，外植體不超過兩天，并且不能沾水；

(2)外植體的消毒：用剪刀把外植體剪成帶兩三個腋芽的莖段放燒杯中，先加入幾滴洗潔精，再加水沖洗，并重復(fù)一次，用自來水洗到基本無泡沫時，自來水沖洗時間不易過長以免造成外植體二次污染，在超凈臺中先用70％的酒精浸1分鐘，無菌水沖洗2次，用加入兩滴吐溫的質(zhì)量濃度為5％的次氯酸鈉溶液消毒5分鐘，用無菌水洗5次；再用加入兩滴吐溫的質(zhì)量濃度為0.1％的升汞消毒10分鐘，后用無菌水洗6次；

(3)接種培養(yǎng)：將莖段剪成1cm左右，每段帶兩個腋芽，接種到接種培養(yǎng)基中，所述接種培養(yǎng)基為GS的大量元素+去除大量元素的MS+6-BA 0.05mg\L+IBA 0.0025mg\L+糖30g/L，每瓶只接一段外植體，培養(yǎng)2-3天開始生長，每30天接轉(zhuǎn)一次；

(4)生根培養(yǎng)：將經(jīng)過繼代培養(yǎng)的分化芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，所述生根培養(yǎng)基為：GS的大量元素+去除大量元素的MS+IBA 0.0025-0.0035mg\L+糖20g/L，誘導(dǎo)生根約25天開始生根，當(dāng)根生長到3cm左右出瓶。

優(yōu)選地，步驟(3)的培養(yǎng)條件為：溫度23±1℃，光照時間12小時，光照強度1000Lx左右，培養(yǎng)介質(zhì)pH值為6.2。

優(yōu)選地，步驟(4)的培養(yǎng)條件為：23±1℃，光照時間12小時/天，光照強度2000Lx左右，pH值為6.2。

優(yōu)選地，還包括組培苗移栽，具體如下：出瓶前練苗一周，先將培養(yǎng)瓶移至溫室，自然條件下煉苗2d，然后解開封口膜，煉苗5d，煉苗完成后取出小苗洗凈根部附著的培養(yǎng)基，用多菌靈或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，后移栽到經(jīng)消毒的基質(zhì)中，溫度控制在24-26℃，濕度控制在70％左右，15d以后逐漸降低濕度，直至將移栽苗置于自然條件下，煉苗移栽期間適當(dāng)遮光，使光照強度為自然光的50％。

優(yōu)選地，所述的栽培基質(zhì)用腐殖土、園土和沙按照1∶1∶1的體積比混合而成。

本發(fā)明的有益效果是：

申請人在組培過程中發(fā)現(xiàn)，將常規(guī)的MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在接種后，外植體出現(xiàn)了變黑壞死的情況，為了克服上述問題，申請人創(chuàng)造性得引入GS培養(yǎng)基，并且僅采用其大量元素，同時去除MS的大量元素，將其合并組成基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，可以克服上述變黑壞死的情況；另外，申請人還發(fā)現(xiàn)丁香葉忍冬的外植體對激素濃度較敏感，激素濃度按照本領(lǐng)域常規(guī)的濃度設(shè)定后，外植體出現(xiàn)大量愈傷組織，而并沒有出現(xiàn)分化，因此，本申請大大降低了激素的濃度，從而克服上述缺陷。按照本申請的組培方法，丁香葉忍冬的成活率在90％左右。

本發(fā)明通過系統(tǒng)的研究，對丁香葉忍冬各個培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基進行了優(yōu)選，首次建立了丁香葉忍冬的組織培養(yǎng)體系，提供了一整套的采用丁香葉忍冬的腋芽作為外植體進行培養(yǎng)的方法，可以生產(chǎn)整齊一致的丁香葉忍冬幼苗，為丁香葉忍冬的快速繁殖提供了有效的支持，為丁香葉忍冬的開發(fā)利用提供了技術(shù)保證，也為進一步探索丁香葉忍冬的基因工程、拓寬外植體材料等奠定了基礎(chǔ)。

并且本發(fā)明培養(yǎng)過程速度快，再生頻率較高，并且變異率較低，周期相對較短，能較好地保持丁香葉忍冬的遺傳穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1丁香葉忍冬經(jīng)過繼代增殖培養(yǎng)出來的苗生長狀況。

圖2是對比例1的苗生長狀況。

圖3是對比例2的苗生長狀況。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

一種丁香葉忍冬組培快繁的方法，包括如下步驟：

(1)外植體的選擇及處理：外植體用野外植株莖段的腋芽，野外采集外植體應(yīng)避免二次污染，用剪刀剪下莖段以干凈封口袋保存，外植體不超過兩天，并且不能沾水；

(2)外植體的消毒：用剪刀把外植體剪成帶兩三個腋芽的莖段放燒杯中，先加入幾滴洗潔精，再加水沖洗，并重復(fù)一次，用自來水洗到基本無泡沫時，自來水沖洗時間不易過長以免造成外植體二次污染，在超凈臺中先用70％的酒精浸1分鐘，無菌水沖洗2次，用加入兩滴吐溫的質(zhì)量濃度為5％的次氯酸鈉溶液消毒5分鐘，用無菌水洗5次；再用加入兩滴吐溫的質(zhì)量濃度為0.1％的升汞消毒10分鐘，后用無菌水洗6次；

(3)接種培養(yǎng)：將莖段剪成1cm左右，每段帶兩個腋芽，接種到接種培養(yǎng)基中，所述接種培養(yǎng)基為GS的大量元素+去除大量元素的MS+6-BA 0.05mg\L+IBA 0.0025mg\L+糖30g/L，每瓶只接一段外植體，培養(yǎng)2-3天開始生長，每30天接轉(zhuǎn)一次；培養(yǎng)條件為：溫度23+1℃，光照時間12小時，光照強度1000Lx左右，培養(yǎng)介質(zhì)pH值為6.2

(4)生根培養(yǎng)：將經(jīng)過繼代培養(yǎng)的分化芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，所述生根培養(yǎng)基為：GS的大量元素+去除大量元素的MS+IBA 0.003mg\L+糖20g/L，誘導(dǎo)生根約25天開始生根，當(dāng)根生長到3cm左右出瓶，培養(yǎng)條件為：23±1℃，光照時間12小時/天，光照強度2000Lx左右，pH值為6.2。

(5)組培苗移栽，具體如下：出瓶前練苗一周，先將培養(yǎng)瓶移至溫室，自然條件下煉苗2d，然后解開封口膜，煉苗5d，煉苗完成后取出小苗洗凈根部附著的培養(yǎng)基，用多菌靈或百菌清1000倍液清洗并浸泡幼苗根部，后移栽到經(jīng)消毒的基質(zhì)中，溫度控制在25℃，濕度控制在70％左右，15d以后逐漸降低濕度，直至將移栽苗置于自然條件下，煉苗移栽期間適當(dāng)遮光，使光照強度為自然光的50％。所述的栽培基質(zhì)用腐殖土、園土和沙按照1∶1∶1的體積比混合而成。

對比例1

接種和生根培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基均改為MS，其余同實施例1。最終培養(yǎng)得到的組培苗生長狀況見圖2。

對比例2

生根培養(yǎng)基的IBA濃度改為0.01mg\L，其余同實施例1。最終培養(yǎng)得到的組培苗生長狀況見圖3。

發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，使用MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的，出現(xiàn)了變黑壞死的現(xiàn)象，且濃度調(diào)高之后，出現(xiàn)了大量的愈傷組織，而將MS培養(yǎng)基換為本申請的培養(yǎng)基，且濃度降低之后，上述問題均未出現(xiàn)。