本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，更確切地說涉及一種低酚類含量植物培養(yǎng)基的快速制備方法。

背景技術(shù)：
：

自20世紀(jì)30年代美國植物生理學(xué)家White建立第一個已知成分的人工合成培養(yǎng)基以來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)迅速發(fā)展并廣泛應(yīng)用于植物快速繁殖、基因功能驗證及分子育種等領(lǐng)域。組織培養(yǎng)技術(shù)是利用細(xì)胞的全能性，將細(xì)胞或器官培育成完整植株的過程。在離體條件下，細(xì)胞或器官的培養(yǎng)必須在無菌環(huán)境下進行。因此，培養(yǎng)基必須經(jīng)過嚴(yán)格的消毒以保持無菌環(huán)境。

目前，培養(yǎng)基消毒主要通過高溫高壓滅菌法(壓力102.9kPa，溫度121～126℃，維持20～30分鐘)完成。該滅菌方法依然存在如下弊端：(1)高溫高壓滅菌消耗電能占整個培養(yǎng)基配制成本(包括試劑、耗能和人員費)的50％左右；(2)大幅增加了培養(yǎng)基制備時長，整個滅菌時間從升溫開始至降到安全溫度需1～2小時，大型滅菌器所耗時間更長；(3)滅菌后容器內(nèi)壁和培養(yǎng)基表面存在蒸汽冷凝水，通常需在無菌通風(fēng)條件下1～2天以上待水分揮發(fā)至干；(4)高溫高壓滅菌過程中某些培養(yǎng)基成分可能發(fā)生反應(yīng)或降解，導(dǎo)致某些元素含量不足甚至缺乏，同時可能生產(chǎn)一些無益甚至有害的物質(zhì)，如FeNa-EDTA在高溫滅菌過程中可能催化蔗糖產(chǎn)生醛類或酚類物質(zhì)，影響植物生長；(5)該滅菌方法對培養(yǎng)基容器材質(zhì)選擇性較強，并且經(jīng)過幾次滅菌后容器透光度會顯著降低，影響培養(yǎng)效果，而透光性較好的PVC-聚氯乙烯等材質(zhì)通常不能進行高溫高壓滅菌，需采用環(huán)氧乙烷滅菌，一次性用后扔棄，致使價格昂貴且造成巨大浪費。此外，在不具備滅菌鍋等儀器設(shè)備及條件的基層機構(gòu)，尤其是大規(guī)模組織培養(yǎng)脫毒領(lǐng)域，難以實現(xiàn)無菌培養(yǎng)基的配制與操作。

探索其他滅菌方法替代高溫高壓滅菌法成為植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域的研究熱點之一。Thepsithar等(2013)以植物精油對菊花培養(yǎng)基進行滅菌并成功用于組織培養(yǎng)研究。專利CN104307007A公布了一種工廠化生產(chǎn)組培苗培養(yǎng)基快速滅菌的方法，以通過在培養(yǎng)基中添加臭氧達到滅活微生物的目的。然而，至今尚無一種方法能取代高溫高壓滅菌的效果。

二氧化氯是一種新型的對環(huán)境無害的消毒劑，在使用過程中不會產(chǎn)生毒性物質(zhì)。二氧化氯已被廣泛應(yīng)用于自來水消毒、農(nóng)產(chǎn)品保鮮和空氣消毒等諸多領(lǐng)域。發(fā)明人評價了液體二氧化氯在植物外植體消毒上的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)二氧化氯能有效殺滅植物外植體表面的微生物，但滅菌處理后外植體活性與植物內(nèi)源酚類物質(zhì)含量有關(guān)；二氧化氯消毒處理外植體后，低酚含量植物外植體生長良好，而高酚含量植物外植體迅速死亡。上述二氧化氯的廣泛應(yīng)用表明了其殺滅不同來源和種類微生物的有效性，也揭示了其應(yīng)用于組成成分較為復(fù)雜的低酚類含量植物培養(yǎng)基滅菌的可能。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種低酚類含量植物培養(yǎng)基的快速制備方法，縮短培養(yǎng)基配制時間、大幅降低能耗費用。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：以液體二氧化氯作為消毒劑在室溫下實現(xiàn)對低酚類含量植物培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和激素表面微生物的徹底滅活、消毒，快速獲得無菌培養(yǎng)基。

其包括如下步驟：

(1)制備二氧化氯溶液：

采用亞氯酸鈉和食品級鹽酸反應(yīng)實現(xiàn)二氧化氯的快速制備，不需要二氧化氯發(fā)生器。稱取1.5g亞氯酸鈉于棕色瓶中，加入50mL去離子水，待其完全溶解后，加入5mL食品級鹽酸，反應(yīng)10分鐘后，再加入450mL去離子水，混勻即獲得1000mg/L二氧化氯水溶液。使用前根據(jù)需要將其稀釋10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、200倍、500倍、1000倍至所需濃度。

(2)稱取適量植物MS培養(yǎng)基成分及激素置于步驟(1)所制備的1～100mg/L二氧化氯水溶液，加入1.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤和0.5mg/L吲哚-3-乙酸，以每分鐘100轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速于磁力攪拌器上攪拌消毒20分鐘，同時加熱10分鐘至培養(yǎng)基溫度為50～60℃。

(3)將凝固劑瓊脂或植物凝膠于微波爐或電爐加熱至完全溶解清澈。

(4)將步驟(2)的培養(yǎng)基成分與溶解的凝固劑混勻，調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0，用培養(yǎng)基分裝容器分裝冷卻后即可使用。

所述的低酚類含量植物包括半夏、白芨、瓜蔞、水稻、酸漿、煙草等對二氧化氯有較好耐受性的植物。

所述的培養(yǎng)基分裝容器可為不耐高溫高壓滅菌但透光性好材質(zhì)的器皿。培養(yǎng)基配制完成后容器及培養(yǎng)基表面不會產(chǎn)生蒸汽水，可立即使用。

所述的MS培養(yǎng)基包括1900mg/L硝酸鉀、1，650mg/L硝酸銨、170mg/L磷酸二氫鉀、370mg/L七水硫酸鎂、440mg/L二水氯化鈣、27.85mg/L七水硫酸鐵、37.25mg/L乙二胺四乙酸二鈉、22.3mg/L四水合硫酸錳、8.6mg/L七水硫酸鋅、6.2mg/L硼酸、0.83mg/L碘化鉀、0.025mg/L五水硫酸銅、0.25mg/L二水合鉬酸鈉、0.025mg/L六水氯化鈷、2.0mg/L甘氨酸、0.1mg/L鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸吡哆辛、0.5mg/L煙酸、100mg/L肌醇。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：不需要高溫高壓滅菌鍋、縮短培養(yǎng)基配制時間、大幅降低能耗費用、對培養(yǎng)容器材質(zhì)無特殊需求，培養(yǎng)基容器中消毒劑二氧化氯的消毒作用可持續(xù)3周左右，消毒時間由傳統(tǒng)高溫高壓滅菌的20～30分鐘延長至約20天，長勢優(yōu)于高溫高壓滅菌培養(yǎng)基，適用于低酚類含量植物的組織培養(yǎng)尤其是大規(guī)模快速繁殖產(chǎn)業(yè)。

附圖說明

圖1是三種培養(yǎng)基對照照片，均為配制10天后拍攝。圖1中A為傳統(tǒng)高溫高壓滅菌培養(yǎng)基；B為10mg/L二氧化氯消毒配制培養(yǎng)基；C為去離子水配制培養(yǎng)基。

圖2是二氧化氯消毒培養(yǎng)基誘導(dǎo)半夏離體塊莖照片。

圖3是二氧化氯消毒培養(yǎng)基誘導(dǎo)半夏再生芽照片。

圖4是二氧化氯消毒培養(yǎng)基對半夏生根的影響照片。

圖5是二氧化氯消毒培養(yǎng)基再生后移栽成活的半夏植株照片。

圖6是二氧化氯消毒培養(yǎng)基誘導(dǎo)白芨離體塊莖照片。

圖7是二氧化氯消毒培養(yǎng)基誘導(dǎo)白芨再生芽照片。

圖8是二氧化氯消毒培養(yǎng)基誘導(dǎo)瓜蔞愈傷組織照片。

圖9是二氧化氯消毒培養(yǎng)基誘導(dǎo)瓜蔞再生芽照片。

圖10是二氧化氯消毒培養(yǎng)基誘導(dǎo)瓜蔞再生芽生根照片。

圖11、12是二氧化氯消毒培養(yǎng)基培養(yǎng)瓜蔞再生植株移栽成活照片。

具體實施方式

實施例一 二氧化氯制備及其對培養(yǎng)基的消毒效果

采用亞氯酸鈉和食品級鹽酸反應(yīng)實現(xiàn)二氧化氯的快速制備。適用化學(xué)方程式為：5NaClO+4HCl＝4ClO₂+5NaCl+2H₂O。

稱取1.5g亞氯酸鈉于棕色瓶中，加入50mL去離子水，待其完全溶解后，加入5mL食品級鹽酸，反應(yīng)10分鐘后，再加入450mL去離子水，混勻即獲得1000mg/L二氧化氯水溶液。臨用前將其稀釋10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、200倍、500倍、1000倍等供試濃度即可。

稱取適量植物MS培養(yǎng)基成分、激素置于所配制培養(yǎng)基體積60％的1～100mg/L二氧化氯水溶液，加入1.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤和0.5mg/L吲哚-3-乙酸，以每分鐘100轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速于磁力攪拌器上攪拌消毒20分鐘，同時加熱10分鐘至培養(yǎng)基溫度為50～60℃。將凝固劑瓊脂或植物凝膠溶于所配制培養(yǎng)基體積40％的相應(yīng)濃度二氧化氯水溶液，微波爐或電爐加熱至完全溶解清澈，調(diào)節(jié)pH值至5.8～6.0。將培養(yǎng)基成分與溶解的凝固劑混勻，分裝冷卻后即可使用。同時制備不含二氧化氯的高溫高壓消毒的培養(yǎng)基和未經(jīng)二氧化氯消毒也不經(jīng)高溫高壓消毒培養(yǎng)基。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如圖1所示，室溫條件7天后，1～100mg/L二氧化氯消毒培養(yǎng)基即圖1的B和高溫高壓滅菌消毒培養(yǎng)基即圖1的A未出現(xiàn)污染情況，而未經(jīng)滅菌培養(yǎng)基即圖1的C則嚴(yán)重污染。同時，如圖1的A所示高溫高壓滅菌培養(yǎng)瓶壁有大量蒸汽水分，而如圖1的B所示二氧化氯消毒培養(yǎng)基瓶壁和表面均較為干燥。表明1～100mg/L二氧化氯能較好實現(xiàn)培養(yǎng)基的測定消毒。

實施例二 半夏再生培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)

取室外種植半夏葉柄，自來水沖洗1小時后于超凈工作臺內(nèi)用10mg/L二氧化氯消毒20分鐘，吸干水分后剪成約1cm長，插入實施例一配制的培養(yǎng)基。在25±1℃條件下培養(yǎng)，15天后成功誘導(dǎo)離體塊莖(圖2)，誘導(dǎo)率為100％。在超凈臺內(nèi)將離體塊莖，接種至新配制的二氧化氯消毒的含有1.0mg/L6-芐氨基腺嘌呤和0.5mg/L吲哚-3-乙酸的MS培養(yǎng)基，25±1℃條件下培養(yǎng)10天后即長出嫩芽(圖3)，出芽率為100％。將嫩芽轉(zhuǎn)至新配制的二氧化氯消毒的含有0.5mg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基，25±1℃條件下培養(yǎng)10天后即可生根(圖4)，生根率為100％。待根長至約3cm長時即可移栽(圖5)。

實施例三 白芨再生培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)

取室外種植白芨幼苗，自來水沖洗1小時后于超凈工作臺內(nèi)用10mg/L二氧化氯消毒20分鐘，吸干水分后接種至實施例一配制的培養(yǎng)基。在25±1℃條件下培養(yǎng)，15天后長出叢生芽(圖6)，誘導(dǎo)率為100％。在超凈臺內(nèi)將嫩芽轉(zhuǎn)至新配制的二氧化氯消毒的含有0.5mg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基，25±1℃條件下培養(yǎng)10天后即可生根(圖7)，生根率為100％。

實施例四 瓜蔞再生培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)

取室外種植瓜蔞幼莖，自來水沖洗1小時后于超凈工作臺內(nèi)用10～25mg/L二氧化氯消毒20分鐘，吸干水分后剪成約1cm長段，接入實施例一配制的培養(yǎng)基。在25±1℃條件下培養(yǎng)，15天后成功誘導(dǎo)愈傷組織(圖8)，誘導(dǎo)率為100％。在超凈臺內(nèi)將愈傷組織接種至新配制的二氧化氯消毒的含有1.0mg/L呋喃甲基腺嘌呤和0.5mg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基，25±1℃條件下培養(yǎng)15天后即長出嫩芽(圖9)，出芽率為46％。將嫩芽轉(zhuǎn)至新配制的二氧化氯消毒的含有0.5mg/L萘乙酸的MS培養(yǎng)基，25±1℃條件下培養(yǎng)10天后即可生根(圖10)，生根率為100％。待根長至約5cm長時即可移栽(圖11，圖12)。