專利名稱：激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于光學顯微成像及光譜測量技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種激光差 動共焦圖譜顯微層析成像裝置，可用于樣品的高精度三維形貌測量和 樣品微區(qū)材料組分的光譜分析。
背景技術(shù)：
1990年G J. Puppels等學者在觀測單細胞和染色體的形態(tài)與 組成時首先發(fā)明了共焦拉曼光譜顯微技術(shù)并成功用于實驗。共焦 拉曼光譜顯微鏡的光譜成像原理是將點光源、點被測物和光譜點 探測器三者放置在彼此對應的共軛的位置，構(gòu)成了光學成像中的 點照明和點探測的具有層析功能的顯微成像系統(tǒng)。典型的共焦顯 微鏡的基本結(jié)構(gòu)如圖1所示，激光器發(fā)出的光經(jīng)過擴束物鏡擴束 后經(jīng)過第一分光鏡、軸向驅(qū)動裝置、物鏡匯聚，在被測物表面聚 焦成光斑并被反射，反射光中含有被入射激光激發(fā)出來的含有被 測樣品材料光譜信息的拉曼光，反射光沿原路返回，被第一分光 鏡反射后經(jīng)過濾光片濾除瑞利光和熒光等后經(jīng)過匯集透鏡匯聚， 經(jīng)過一個位于匯聚透鏡的焦點處的針孔后由針孔后的光譜探測器 接收處理。由于共焦拉曼顯微鏡采用的是一種點對點的探測方式 因此決定了其具有較高的空間分辨能力并且具有層析探測能力。
共焦顯微鏡因為具有光譜層析成像的能力而被廣泛應用于生 物醫(yī)學、材料科學和高能物理等前沿學科和領(lǐng)域，并且由于其分 辨率很高，可以對生物活體樣本和微小工業(yè)產(chǎn)品進行微細成像， 提供樣品的微觀幾何形貌信息和材料光譜信息而成為醫(yī)學觀察和 制造業(yè)檢測的有力工具；但是若要提高共焦拉曼光譜顯微系統(tǒng)的 微區(qū)探測能力，就必須對樣品進行精確定焦，使樣品位于焦點O 附近，然而焦點O附近的共焦顯微特性曲線的響應靈敏度卻極低， 其結(jié)果使現(xiàn)有的共焦拉曼光譜顯微技術(shù)在"微區(qū)光譜"探測能力和 "微區(qū)幾何位置"探測能力之間不可兼得，即現(xiàn)有的共焦拉曼光譜 顯微技術(shù)存在以下原理性缺陷1. 焦點O處光譜探測能力強，但幾何位置探測能力卻差；
2. 難以準確捕獲焦點O處的激發(fā)拉曼光譜，實現(xiàn)微區(qū)光譜探測；
3. 受衍射極限的限制，焦點O處光斑及焦深大小都將制約共焦 拉曼光譜顯微系統(tǒng)的軸向及橫向分辨能力等。
顯見，上述共焦拉曼光譜顯微技術(shù)的原理性缺陷，制約了其 微區(qū)光譜與幾何位置的探測能力，使其無法用于更微小區(qū)域的光 譜與幾何位置的測試與分析等場合。
目前，國際上有關(guān)共焦拉曼光譜顯微鏡的性能的改善的研究 飛速發(fā)展，出現(xiàn)了超短脈沖激光法、油浸物鏡法、光纖探測法、 圖像改進法等方法，但是上述研究，主要集中在共焦拉曼光譜顯 微系統(tǒng)涉及的光源系統(tǒng)、光譜探測系統(tǒng)、聚焦物鏡系統(tǒng)、光譜信 息處理等方面，盡管其對共焦拉曼光譜顯微系統(tǒng)的總體性能有所 改進，但在共焦拉曼光譜顯微系統(tǒng)空間分辨能力的改善方面卻沒 有顯著進展。
差動共焦技術(shù)具有靈敏度高，線性好，測量具有絕對跟蹤能 力和雙極性跟蹤特性，可以實現(xiàn)幾何位置的絕對測量等特點，今 年來得到廣泛的應用；并且隨著光瞳濾波技術(shù)的發(fā)展，差動共焦 技術(shù)與光瞳濾波技術(shù)的結(jié)合可以大大的壓縮系統(tǒng)焦深，提高定焦 靈敏度，改善系統(tǒng)的分辨力。如《光學快遞》的《Effect of an annular pupil filter on differential confocal microscopy》報道了使用光瞳濾 波技術(shù)提高差動共焦顯微鏡的軸向靈敏度和擴展線性響應區(qū)間的 實驗。而使用差動共焦技術(shù)與共焦拉曼光譜探測技術(shù)相結(jié)合繼而 同時得到樣品的納米級微區(qū)幾何形貌與組分信息的圖譜成像技術(shù) 的報道，至今尚未見到。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有技術(shù)用于微觀三維形貌和材料光譜測 量時存在的上述不足，融合拉曼光譜探測技術(shù)和差動共焦顯微技術(shù)， 提出激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置。該探測裝置可以測量樣品 納米級微區(qū)的光譜信息，同時得到樣品的微觀幾何形貌和材料組分信 息，并且具有極高的空間分辨力；本發(fā)明裝置中同時包含二維掃描驅(qū)動裝置，可以驅(qū)動樣品使裝置可以對樣品進行二維的掃描，從而生成 樣品的圖譜照片，為生物醫(yī)學、材料科學和高能物理等前沿學科提供 了有力的觀測手段。
本發(fā)明的目的是通過下述裝置實現(xiàn)的。
激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置，包括拉曼光譜探測部分
(25)，沿光路依次放置的物鏡(6)、第一分光鏡(7)、位于第一分光 鏡(7)透射方向的測量物鏡(9)和用于驅(qū)動測量物鏡(9)在軸向移 動的軸向驅(qū)動裝置(8)和二維驅(qū)動裝置(28);還包括放置在第一分 光鏡(7)反射方向反方向的差動共焦探測部分；還包括一個激光器(1) 和一個數(shù)據(jù)融合處理系統(tǒng)(24);其中激光器(1)通過單模保偏光纖 與拉曼光譜分析部分(25)連接，用于給系統(tǒng)提供測試用的照明和激 發(fā)光源；數(shù)據(jù)融合處理系統(tǒng)(24)與拉曼光譜探測部分(25)和差動 共焦探測部分(26)相連，用于融合處理兩個部分探測接收到的光譜 信息和位置信息，得到樣品的微區(qū)圖譜信息；
拉曼光譜探測部分(25)包括一個焦點位于與激光器相連的光纖 輸出端頭用于將光纖輸出的光進行擴束的光源物鏡(2)和沿光路依次 排列的窄帶濾光片(3)、 二向色濾光片(4)、位于二向色濾光片(4) 的透射方向的匯聚物鏡(5)、位于二向色濾光片的反射方向反射鏡 (20)、放在反射鏡的反射方向的濾光片(21)、在濾光片(21)透射 方向的耦合透鏡(22)和通過單模保偏光纖采集耦合透鏡(22)焦點 處的光譜信號的拉曼光譜探測器(23);差動共焦系統(tǒng)(26)包括第 二分光鏡(11)，依次放置在第二分光鏡的透射方向的第一聚光鏡(12)、 第一針孔(13)和貼近針孔的第一探測器(18);依次放置在第二分光 鏡(11)的反射方向的第二聚光鏡(16)、第二針孔(17)和貼近針孔 的第二探測器(18)。
本發(fā)明裝置中的軸向驅(qū)動裝置(8)和測量物鏡(9)還可以位于 偏振分光鏡(7)的反射方向。
本發(fā)明裝置還可以包括衍射光整形器件(27)用于壓縮測量物鏡 (9)的焦深，提高定焦精度；衍射光整形器件(27)可以位于擴束物 鏡(6)與第一分光鏡(7)之間，也可以位于第一分光鏡(7)與測量 物鏡(9)之間或第一分光鏡(7)與第二分光鏡(11)之間，還可以
6使用兩個衍射光整形器件，分別位于第二分光鏡(11)與第一匯聚鏡
(12)和第二匯聚鏡(16)之間。
本發(fā)明裝置還可以包括第一濾波放大電路(15)和第二濾波放 大電路(19)，兩個放大電路分別與第一探測器(14)和第二探測器(18) 相連，用于對兩個探測器探測到的信號進行濾波和放大處理。
本發(fā)明裝置還可以包括一個數(shù)據(jù)融合處理系統(tǒng)(24)，數(shù)據(jù)處理系 統(tǒng)(24)與第一濾波放大電路(15)、第二濾波放大電路(19)相連和 拉曼光譜探測器(23)相連，用于對三者的輸出信號進行整合處理， 實現(xiàn)測量的自動化，得到被測樣品的微區(qū)圖譜信息。
本發(fā)明對比已有的技術(shù)裝置具有以下顯著優(yōu)點
1) 可以對樣品進行二維掃描光譜成像，同時得到樣品的幾何形貌 信息和材料組分信息，得到樣品的圖譜合一的信息；
2) 使共焦拉曼光譜顯微鏡的微區(qū)光譜和幾何位置探測能力顯著提
高；
3) 可同時實現(xiàn)微區(qū)圖譜層析成像、三維尺度層析成像、光譜測試 三種成像模式；
4) 具有絕對跟蹤零點和雙極性跟蹤特性，可實現(xiàn)幾何位置絕對測
5) 利用衍射光學器件整形和壓縮聚焦物鏡光斑，其即可起到壓縮 光斑的作用又可減少激發(fā)能量的損失，從而使拉曼光譜強度減小不致 太大等。


圖1為已有的共焦拉曼光譜顯微鏡原理圖和成像區(qū)域示意圖2為本發(fā)明納米級激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置原理圖3為本裝置差動響應曲線圖。
其中l(wèi)-激光器、2-光源物鏡、3-窄帶濾波片、4-二向色濾光片、 5-匯聚物鏡、6-擴束物鏡、7-第一分光鏡、8-軸向驅(qū)動裝置、9-測量物 鏡、10-被測樣品、11-第二分光鏡、12-第一匯聚鏡、13-第一針孔、14-第一探測器、15-第一濾波放大電路、16-第二匯聚鏡、17-第二針孔、18-第二探測器、19-第二濾波放大電路、20-反射鏡、21-濾光片、22-耦合物鏡、23-拉曼光譜探測器、24-數(shù)據(jù)融合處理系統(tǒng)、25-拉曼光譜 分析部分、26-差動共焦系統(tǒng)、27-衍射光整形器件、28二維驅(qū)動裝置。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明技術(shù)原理為采用差動共焦顯微成像技術(shù)將共焦顯微鏡接 收光路布置為焦前和焦后兩路探測光路，通過兩路探測器探測到的具 有不同位相的兩路強度響應信號差動相減達到改善軸向分辨力和提高 抗千擾能力的目的，同時系統(tǒng)包含拉曼光譜分析系統(tǒng)，使系統(tǒng)可同時 測量樣品的微觀區(qū)域的材料光譜信號，可以對樣品的材料組分盡心分 析；另外，引入衍射光整形器件，對測量光束進行限制壓縮系統(tǒng)焦深， 達到了提高系統(tǒng)分辨能力的目的；最后通過對樣品進行掃描探測，利 用測得的樣品的微區(qū)光譜信息和形貌信息結(jié)合樣品的二維坐標，重構(gòu) 出反應樣品三維形貌和材料組分的圖譜。
本發(fā)明兼有激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置結(jié)構(gòu)圖如圖2所 示，包括拉曼光譜探測部分25，沿光路依次放置的物鏡6、第一分 光鏡7、位于第一分光鏡7透射方向的測量物鏡9、用于驅(qū)動測量物鏡 在軸向運動的軸向驅(qū)動裝置8、驅(qū)動樣品在二維垂周平面運動的二維 驅(qū)動裝置28;還包括放置在第一分光鏡7反射方向反方向的差動共焦 探測部分；還包括一個通過單模保偏光纖與拉曼光譜分析部分25連接 的激光器1和一個與拉曼光譜探測部分25和差動共焦探測部分26相 連的數(shù)據(jù)融合處理系統(tǒng)24。其中，拉曼光譜探測部分25包括一個焦 點位于與激光器相連的光纖輸出端頭用于將光纖輸出的光擴束光源物 鏡2和沿光路依次排列的窄帶濾光片3、 二向色濾光片4、位于二向色 濾光片4的透射方向的匯聚物鏡5、位于二向色濾光片的反射方向反 射鏡20、放在反射鏡的反射方向的濾光片21、在濾光片21透射方向 的耦合透鏡22和通過單模保偏光纖采集耦合透鏡22焦點處的光譜信 號的拉曼光譜探測器23;差動共焦系統(tǒng)26包括第二分光鏡ll，依次放置在第二分光鏡的透射方向的第一聚光鏡12、第一針孔13和貼
近針孔的第一探測器18;依次放置在第二分光鏡11的反射方向的第二
聚光鏡16、第二針孔17和貼近針孔的第二探測器18。
本發(fā)明裝置中的軸向驅(qū)動裝置8和測量物鏡9還可以位于第一分 光鏡7的反射方向。
本發(fā)明裝置中還可以包括衍射光整形器件27用于壓縮測量物鏡9 的焦深，提高定焦精度；衍射光整形器件27可以位于擴束物鏡6與第 一分光鏡7之間，也可以位于第一分光鏡7與測量物鏡9之間或第一 分光鏡7與第二分光鏡11之間，還可以使用兩個衍射光整形器件，分 別位于第二分光鏡11與第一匯聚鏡12和第二匯聚鏡16之間。還可以 包括第一濾波放大電路15和第二濾波放大電路19，兩個放大電路 分別與第一探測器14和第二探測器18相連，用于對兩個探測器探測 到的信號進行濾波和放大處理；還可以包括一個數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)24，數(shù) 據(jù)處理系統(tǒng)24與第一濾波放大電路15、第二濾波放大電路19相連和 拉曼光譜探測器23相連，用于對三者的輸出信號進行整合處理，實現(xiàn) 測量的自動化，得到被測樣品的微區(qū)圖譜信息。
本發(fā)明兼有激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置測量原理如圖2 所示打開激光器1，激光器1發(fā)出的激光經(jīng)過單模保偏光纖傳輸?shù)?光源物鏡的焦點處，經(jīng)過光源物鏡2匯聚后通過窄帶濾波片3濾波， 濾除激光通過光纖激發(fā)出的拉曼光譜成分；通過窄帶濾波片3后的光 束經(jīng)過二項色性濾光片4，光能幾乎全部通過，后經(jīng)過匯聚物鏡5和 擴束物鏡6后通過衍射光整形裝置27，將光束調(diào)制為所需要的形式后 經(jīng)過第一分光鏡7、測量物鏡9后在樣品10的表面匯聚成為一個小光 斑后被反射，反射光中包含瑞利散射光、激發(fā)熒光和拉曼光譜，在這 個過程中可一使用軸向驅(qū)動裝置8驅(qū)動測量物鏡9在軸向運動實現(xiàn)定 焦或控制光斑大小；反射光原路返回光路，經(jīng)過測量物鏡9、后被第 一分光鏡分光，其中一路被反射進入差動共焦探測裝置26，光束進入 差動共焦探測裝置26后第二分光鏡11分成兩束， 一束被第一匯聚鏡 12匯聚后進入位于第一匯聚鏡12焦點前距離為M的位置的第一針孔13，被第一探測器14接收；另一束被第二匯聚鏡16匯聚后進入位于 第二匯聚鏡16焦點后距離為M的位置的第二針孔17，被第二探測器 18接收。另一路透射后通過衍射光整形裝置27、擴束物鏡6、匯聚物 鏡5后被二向色性濾光片發(fā)射到反射鏡20;在這個過程中光線中的直 接由被測樣品反射回的光將直接通過二項色濾光片而被濾除，反射的 光再次經(jīng)過反射鏡20的反射后通過濾光片21，消除光束中的熒光成 分，然后經(jīng)過耦合透鏡22將光線耦合進入單模保偏光纖后進入拉曼光 譜探測器23探測得到樣品的材料組分光譜信息。拉曼光譜探測器23、 第一濾波放大電路15和第二濾波放大電路19將測得的信號傳輸給數(shù) 據(jù)融合處理系統(tǒng)24處理后得到包涵被測樣品三維幾何信息和組分光 譜信息的四維信號。
在測量過程中當被測樣品表面處于焦平面或者離焦時，激光器1、 光源物鏡2、第一分光鏡7、測量物鏡9、第一匯聚鏡12、第一針孔 13和第一探測器14構(gòu)成"準共焦顯微鏡"，第一探測器14探測到的 強度響應力(w，)為:
sin" / 2)
其中w為軸向歸一化坐標，，/c為入射光強，。
激光器l、光源物鏡2、第一分光鏡7、測量物鏡9、第二匯聚鏡 16、第二針孔17和第二探測器18構(gòu)成"準共焦顯微鏡"，第二探測器 18探測到的強度響應/2 ("2)為
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將力("》和/2 ("2)做差后得到:
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計算機依據(jù)/e^進行實時處理和計算，由&#強度曲線光強大小和
從二維驅(qū)動裝置(28)中獲得的樣品位置的二位坐標(Jc,力，重構(gòu)出被 測樣品的微區(qū)三維形貌信息/ (x，y,。激光器l、光源物鏡2、 二向色濾光片4、測量物鏡9、耦合物鏡 22、拉曼光譜探測器23構(gòu)成共焦拉曼顯微鏡，拉曼光譜探測器23探 測到的光譜響應為/(A)。
拉曼光譜探測器23、第一探測器14和第二探測器18將輸出信號 傳輸?shù)綌?shù)據(jù)融合處理系統(tǒng)23中得到樣品10的四維信息/ (;c，j;,; 2 )
以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作了說明，但這些說明不 能被理解為限制了本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的保護范圍由隨附的權(quán)利要 求書限定，任何在本發(fā)明權(quán)利要求基礎(chǔ)上的改動都是本發(fā)明的保護范 圍。
權(quán)利要求
1.一種激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置，其特征在于包括拉曼光譜探測部分(25)，沿光路依次放置的物鏡(6)、第一分光鏡(7)、位于第一分光鏡(7)透射方向的測量物鏡(9)和用于驅(qū)動測量物鏡(9)在軸向移動的軸向驅(qū)動裝置(8)，和二維掃描驅(qū)動裝置(28)；還包括放置在第一分光鏡(7)反射方向反方向的差動共焦探測部分；還包括一個激光器(1)和一個數(shù)據(jù)融合處理系統(tǒng)(24)；其中激光器(1)通過單模保偏光纖與拉曼光譜分析部分(25)連接，用于給系統(tǒng)提供測試用的照明和激發(fā)光源；數(shù)據(jù)融合處理系統(tǒng)(24)與拉曼光譜探測部分(25)和差動共焦探測部分(26)相連，用于融合處理兩個部分探測接收到的光譜信息和位置信息，得到樣品的微區(qū)圖譜信息；
2.根據(jù)權(quán)利1所述的激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置，其 特征在于拉曼光譜探測部分(25)包括一個焦點位于與激光器相連 的光纖輸出端頭用于將光纖輸出的光擴束光源物鏡(2)和沿光路依 次排列的窄帶濾光片(3)、 二向色濾光片(4)、位于二向色濾光片(4) 的透射方向的匯聚物鏡(5)、位于二向色濾光片的反射方向反射鏡(20)、放在反射鏡的反射方向的濾光片(21)、在濾光片(21)透射 方向的耦合透鏡(22)和通過單模保偏光纖采集耦合透鏡(22)焦點 處的光譜信號的拉曼光譜探測器(23);差動共焦系統(tǒng)(26)包括 第二分光鏡(11)，依次放置在第二分光鏡的透射方向的第一聚光鏡(12)、第一針孔(13)和貼近針孔的第一探測器(18);依次放置在 第二分光鏡(11)的反射方向的第二聚光鏡(16)、第二針孔(17) 和貼近針孔的第二探測器(18)。
3. 根據(jù)權(quán)利1和2所述的激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置， 其特征在于軸向驅(qū)動裝置(8)和測量物鏡(9)還可以位于偏振分 光鏡(7)的反射方向。
4. 根據(jù)權(quán)利1和2所述的激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置， 其特征在于還可以包括衍射光整形器件(27)用于壓縮測量物鏡(9) 的焦深，提高定焦精度；衍射光整形器件(27)可以位于擴束物鏡(6) 與第一分光鏡(7)之間，也可以位于第一分光鏡(7)與測量物鏡(9) 之間或第一分光鏡(7)與第二分光鏡(11)之間，還可以使用兩個衍射光整形器件，分別位于第二分光鏡(11)與第一匯聚鏡(12)和 第二匯聚鏡(16)之間。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的激光差動共焦圖譜顯微層析成像 裝置，其特征在于還可以包括第一濾波放大電路(15)和第二濾波 放大電路(19)，兩個放大電路分別與第一探測器(14)和第二探測 器(18)相連，用于對兩個探測器探測到的信號進行濾波和放大處理。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的激光差動共焦圖譜顯微層析成像 裝置，其特征在于還可以包括一個數(shù)據(jù)融合處理系統(tǒng)(24)，數(shù)據(jù)處 理系統(tǒng)(24)與第一濾波放大電路(15)、第二濾波放大電路(19) 相連和拉曼光譜探測器(23)相連，用于對三者的輸出信號進行整合 處理，實現(xiàn)測量的自動化，得到被測樣品的微區(qū)圖譜信息。
全文摘要
本發(fā)明屬于光學顯微成像及光學精密測量技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種激光差動共焦圖譜顯微層析成像裝置，主要包括拉曼光譜分析部分(25)和沿光路依次放置的物鏡(6)、偏振分光鏡(7)、1/4玻片(8)、測量物鏡(9)；還包括位于偏振分光鏡反射方向反方向的差動共焦探測部分(26)。本發(fā)明中的差動共焦探測部分用于對樣品微區(qū)幾何位置的測量和對樣品定焦，得到樣品微區(qū)的圖像信息；拉曼光譜探測部分用于對樣品被探測區(qū)的材料光譜進行分析，得到樣品微區(qū)的組分信息；通過兩個部分的結(jié)合可以實現(xiàn)對樣品的納米級微區(qū)圖譜測量，同時得到樣品微區(qū)的幾何形貌和材料組分信息。本發(fā)明為生物醫(yī)學、材料科學和高能物理等前沿學科提供了有力的觀測手段。
文檔編號G02B27/09GK101526477SQ200910082248
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者允 王, 趙維謙, 邱麗榮 申請人:北京理工大學