誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法,其解決了現(xiàn)有材料生物性能不理想的技術(shù)問題，骨修復(fù)復(fù)合材料由石墨烯薄膜和生物活性玻璃構(gòu)成，生物活性玻璃均勻負載于石墨烯薄膜表面；生物活性玻璃為均勻球形形貌。本發(fā)明可用于骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備領(lǐng)域。
【專利說明】
誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及骨組織工程支架材料及其制備方法，具體地說是一種誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法。【背景技術(shù)】
[0002]理想的骨組織工程支架材料，不僅可以為成骨細胞生長提供三維空間，而且具有骨引導活性及骨誘導活性，引導成骨細胞粘附、增殖，誘導干細胞成骨分化。納米材料的眾多獨特的優(yōu)良的性質(zhì)使得其在眾多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景，而具有導電性能的納米材料更因其特殊的導電性能，受到了前所未有的重視。通過一系列加工，它可成為具有可視效果的刺激響應(yīng)性材料、帶有生物傳感器和神經(jīng)修復(fù)功能的生物識別薄膜材料、具有電刺激的藥物釋放器件以及具有生物相容性的柔性儲能材料等諸多材料體系。
[0003]作為導電納米材料中的一種，氧化石墨烯(G0)因其獨特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的力學、電學、熱學及化學特征，對其研究和應(yīng)用備受關(guān)注。以G0作為填充材料來增強復(fù)合材料的力學強度或者利用其它生物材料作為G0的修飾材料對G0進行功能化是復(fù)合材料領(lǐng)域的研究熱點。
[0004]生物玻璃(BG)與天然的骨及牙齒有著相似的組成，是較為重要的人工合成類骨無機成分，為含有硅、鈉、鈣、磷等多種元素氧化物的活性材料，最新的研究表明生物活性玻璃中釋放的S1、Ca等物質(zhì)對于調(diào)節(jié)誘發(fā)成骨細胞周期開始和進程的基因具有激活作用，從而促進了細胞的分化和增殖，促進了新骨形成，具有良好的骨誘導作用，是一類重要的骨修復(fù)材料，然而較低的斷裂韌性以及耐磨性阻礙了它的廣泛應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有材料生物性能不理想的技術(shù)問題，提供一種生物性能理想、加工方法簡單的誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法。
[0006]為此，本發(fā)明提供一種誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，骨修復(fù)復(fù)合材料由石墨烯薄膜和生物活性玻璃構(gòu)成，生物活性玻璃均勻負載于石墨烯薄膜表面;生物活性玻璃為均勻球形形貌。
[0007]優(yōu)選的，石墨烯薄膜為氧化石墨烯經(jīng)多巴胺改性而成。多巴胺為在改性過程中其表面的酚羥基與石墨烯表面官能團發(fā)生了反應(yīng)，且多巴胺對氧化石墨烯產(chǎn)生了部分的還原作用。
[0008]優(yōu)選的，生物活性玻璃的材質(zhì)為正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯和四水硝酸鈣。
[0009]優(yōu)選的，復(fù)合材料為薄膜材料，石墨烯薄膜層間距為0.39nm，生物活性玻璃的直徑為50nm?100nm〇
[0010]優(yōu)選的，復(fù)合材料中，石墨烯質(zhì)量百分數(shù)為0.5%?10%，其余為所述生物活性玻璃。
[0011]本發(fā)明同時提供一種誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方法，氧化石墨稀合成通過優(yōu)化的Hmiimers法合成;復(fù)合材料的制備采用溶膠-凝膠法結(jié)合熱處理的方法完成。[〇〇12]優(yōu)選的，得氧化石墨、超聲得到分散均勻的單層或少層氧化石墨烯、鹽酸多巴胺溶液的配制、攪拌過夜、離心、烘干。
[0013]優(yōu)選的，溶膠-凝膠法結(jié)合熱處理的方法合成復(fù)合材料的制備包括如下步驟:正硅酸乙酯-磷酸三乙酯-四水硝酸鈣溶膠-凝膠溶液的配制、多巴胺改性的氧化石墨烯懸液的配制、多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃混合液配制、燒結(jié)、碳化。
[0014]優(yōu)選的，本發(fā)明提供的誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方法，包括如下步驟:
[0015](1)氧化石墨烯的制備
[0016]采用優(yōu)化的Hummers法成功獲得氧化石墨，并通過超聲得到分散均勻的單層或少層氧化石墨烯:天然鱗片石墨與硝酸鈉按2:1的比例混合后加入230ml濃硫酸，之后冰浴條件下加入高錳酸鉀，攪拌，保持反應(yīng)溫度低于20°C;移走冰浴，在35°C水浴中保溫30分鐘后緩慢加入460ml去離子水，待反應(yīng)溫度下降到70°C，同樣溫度水浴10分鐘；隨后加入700ml雙氧水，使反應(yīng)終止;抽濾，將得到的黃褐色過濾物反復(fù)清洗、離心，至上清ph為7左右，烘干， 得到氧化石墨；[〇〇17]超聲分離:以lmg: lml的比例將氧化石墨與去離子水混合，將超聲波細胞粉碎機功率調(diào)至800W，超聲2h，得到分散均勻的氧化石墨烯；
[0018](2)氧化石墨烯的還原
[0019]還原:基于步驟(1)中制備的氧化石墨烯，將氧化石墨烯、水合肼、氨水、去離子水以100mg: 10ml: 0.lml: 100ml的比例混合后在95 °C水浴中保持2h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，清洗，最后烘干得到還原的氧化石墨烯；
[0020](3)氧化石墨烯的改性[0〇21 ]按照步驟(1)中超聲的方法將氧化石墨稀與去離子水按照165mg: 100ml進行超聲， 之后加入鹽酸多巴胺，配成濃度為〇.25mmol/L的溶液，攪拌過夜，離心，烘干，得到多巴胺改性的氧化石墨烯；
[0022](4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料[0〇23]采用溶膠-凝膠法制備0.5wt.%?10wt.%多巴胺改性的氧化石墨稀的/生物活性玻璃復(fù)合材料，制備過程為:實驗采用正硅酸乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸鈣，通過溶膠-凝膠法來制備生物活性玻璃;首先，將磷酸三乙酯溶解于蒸餾水、無水乙醇與氨水的混合液體中，80°C充分攪拌24h，獲得水解的磷酸三乙酯溶液;然后將正硅酸乙酯與四水硝酸鈣加入磷酸三乙酯水解溶液中，室溫攪拌120h，形成溶膠-凝膠溶液;事先將步驟(3)中制備好的多巴胺改性的氧化石墨烯溶解于二甲基甲酰胺，超聲2h，形成均勻的多巴胺改性的氧化石墨烯懸液;將溶膠_凝膠溶液按比緩慢加入多巴胺改性的氧化石墨烯懸液中，控制多巴胺改性的氧化石墨烯的質(zhì)量分數(shù)為〇.5wt.%?10wt.%，室溫攪拌2h，隨后將多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃混合液在80°C燒結(jié)12h，得到多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固體;多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固體在氮氣保護環(huán)境下通過系列升溫碳化方式進一步碳化，最終形成多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合物，具體程序為: 300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫；
[0024] (5)多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃基底材料制備
[0025]以蓋玻片作為基底，通過旋涂的方法形成有利于后期細胞生長的基底材料;將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無水乙醇和去離子水清洗，氮氣保護吹干，得到表面清潔的蓋玻片；隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮氣保護下干燥;將多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃溶于無水乙醇中配制成質(zhì)量體積百分比為0.5 %的懸液，通過旋涂儀上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干， 以備后期實驗使用。
[0026]本發(fā)明具有以下效果:
[0027] (1)本發(fā)明中多巴胺的改性在對氧化石墨烯(G0)有部分還原的基礎(chǔ)之上增加了氧化石墨烯在溶液中的分散性，減少了團聚效應(yīng)，并為后續(xù)生物活性玻璃(BG)功能化提供了充裕的表面官能團。通過溶膠-凝膠法可以在改性氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料 (DG0/BG)加載比例可控的條件下制備出具有獨特納米拓撲結(jié)構(gòu)的DG0/BG導電支架材料，且 BG與DG0的混合比例以及DG0/BG表面形貌都可以進行精確的調(diào)控。[〇〇28] (2)本發(fā)明所制得DG0/BG復(fù)合材料因具有合適的表面硬度、活性功能團、生物分子吸附功能而具有良好的生物相容性，可促進成骨細胞的粘附、增殖和分化;為石墨烯在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用提供了一個新的途徑。
[0029] (3)本發(fā)明所采用的制備和加工方法簡單，可控性強，能用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0030]綜上所述，本發(fā)明所提供的復(fù)合材料在具有良好的理化性能，精確控制合適配比的DG0/BG因具有理想的表面硬度、活性功能團、生物分子吸附功能而可以較好地調(diào)控 rBMSCs進行成骨分化?！靖綀D說明】
[0031]圖1為本發(fā)明實施例2所述DG0透射電子顯微鏡照片；[〇〇32]圖2a為本發(fā)明實施例2所述石墨烯在改性前后的Raman圖譜；圖2b本發(fā)明實施例2 所述石墨烯在改性前后的FTIR圖譜；[〇〇33]圖3為本發(fā)明實施例2所述lwt.%DG0/BG復(fù)合材料的掃描電子顯微鏡照片；[〇〇34] 圖4為本發(fā)明實施例2所述lwt.%DG0/BG復(fù)合材料的FTIR圖；[〇〇35]圖5為本發(fā)明實施例2所述lwt.%DG0/BG修復(fù)材料的成骨細胞培養(yǎng)1天的激光共聚焦顯示細胞骨架圖片；
[0036]圖6為本發(fā)明實施例2所述修復(fù)材料的成骨細胞培養(yǎng)7天的激光共聚焦顯示BMP2蛋白表達圖片。【具體實施方式】
[0037]本發(fā)明提供了一種誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料及其制備方法，下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進一步說明。
[0038]實施例1[〇〇39] (1)氧化石墨烯(G0)的制備
[0040]采用優(yōu)化的Hummers法成功獲得氧化石墨，并通過超聲得到分散均勻的單層或少層氧化石墨烯。具體方法為:[0041 ]天然鱗片石墨與硝酸鈉按2:1的比例混合后加入230ml濃硫酸，之后冰浴條件下加入高錳酸鉀，攪拌，保持反應(yīng)溫度低于20°C。移走冰浴，在35°C水浴中保溫30分鐘后緩慢加入460ml去離子水，待反應(yīng)溫度下降到70°C，同樣溫度水浴10分鐘。隨后加入700ml雙氧水， 使反應(yīng)終止。抽濾，將得到的黃褐色過濾物反復(fù)清洗、離心，至上清ph為7左右，烘干，得到氧化石墨。
[0042]超聲分離:以lmg: 1ml的比例將氧化石墨與去離子水混合，將超聲波細胞粉碎機功率調(diào)至800W，超聲2h，得到分散均勻的氧化石墨烯。[〇〇43](2)氧化石墨烯(G0)的還原
[0044] 還原:基于(1)中制備的G0，將G0、水合肼、氨水、去離子水以100mg: 10ml: 0.1ml: l〇〇ml的比例混合后在95°C水浴中保持2h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，清洗，最后烘干得到還原的氧化石墨稀(G)。[〇〇45](3)氧化石墨烯(G0)的改性[0〇46 ] 按照(1)中超聲的方法將G0與去離子水按照16 5mg: 10 0m 1進行超聲，之后加入鹽酸多巴胺，配成濃度為〇.25mmol/L的溶液，攪拌過夜，離心，烘干，得到多巴胺改性的氧化石墨烯(DG0)〇[〇〇47](4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料(DG0/BG)[〇〇48] 采用溶膠-凝膠法制備0.5wt.%DG0的DG0/BG復(fù)合材料，制備過程為:實驗采用正硅酸乙酯(TE0S)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)等，通過溶膠-凝膠法來制備58S的生物活性玻璃(BG)。首先，將0.36ml TEP溶解于蒸餾水、無水乙醇與氨水的混合液體中，80 °C 充分攪拌24h，獲得水解的TEP溶液。然后將0.65ml TE0S與0.35g CN加入TEP水解溶液中，室溫攪拌120h，形成溶膠-凝膠溶液。事先將(3)中制備好的DG0稱取0.0067g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超聲2h，形成均勻的DG0懸液。將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入DG0懸液中，室溫攪拌2h，隨后將DG0/BG混合液在80°C燒結(jié)12h，得到0.5wt.%DG0/BG固體。0.5wt.%DG0/BG 固體在氮氣保護環(huán)境下通過系列升溫碳化方式進一步碳化，最終形成〇.5wt.%DG0/BG復(fù)合物，具體程序為:300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫。
[0049](5)DG0/BG基底材料制備
[0050]以蓋玻片作為基底，通過旋涂的方法形成有利于后期細胞生長的基底材料。將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無水乙醇和去離子水清洗，氮氣保護吹干，得到表面清潔的蓋玻片。隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷(3-APTES)溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮氣保護下干燥。將〇.5wt.%DG0/BG溶于無水乙醇中配制成0.5% (w/v)的懸液，通過旋涂儀上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備后期實驗使用。[0051 ]通過以上步驟所得的復(fù)合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其為薄膜狀材料，改性石墨烯在復(fù)合材料中的質(zhì)量分數(shù)為〇.5wt.%。[〇〇52] 實施例2[〇〇53] 步驟(1)、(2)、(3)與實施例1相同。[〇〇54](4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料(DG0/BG)[0〇55] 米用溶|父-凝|父法制備lwt.%DG0的DG0/BG復(fù)合材料，制備過程為:實驗米用正娃酸乙酯(TEOS)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)等，通過溶膠-凝膠法來制備58S的生物活性玻璃(BG)。首先，將0.36ml TEP溶解于蒸餾水、無水乙醇與氨水的混合液體中，80 °C充分攪拌24h，獲得水解的TEP溶液。然后將0.65ml TE0S與0.35g CN加入TEP水解溶液中，室溫攪拌120h，形成溶膠-凝膠溶液。事先將(3)中制備好的DG0稱取0.0136g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超聲2h，形成均勻的DG0懸液。將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入DG0懸液中，室溫攪拌2h，隨后將DG0/BG混合液在80 °C燒結(jié)12h，得到1 wt.% DG0/BG固體。1 wt.% DG0/BG固體在氮氣保護環(huán)境下通過系列升溫碳化方式進一步碳化，最終形成lwt.%DG0/BG復(fù)合物，具體程序為:300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫。
[0056](5)DG0/BG基底材料制備[〇〇57]以蓋玻片作為基底，通過旋涂的方法形成有利于后期細胞生長的基底材料。將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無水乙醇和去離子水清洗，氮氣保護吹干，得到表面清潔的蓋玻片。隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷(3-APTES)溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮氣保護下干燥。將lwt.%DG0/BG溶于無水乙醇中配制成0.5% (w/v)的懸液，通過旋涂儀上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備后期實驗使用。[〇〇58]通過以上步驟所得的復(fù)合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其為薄膜狀材料，改性石墨烯在復(fù)合材料中的質(zhì)量分數(shù)為Iwt.%。[〇〇59] 實施例3[〇〇6〇]步驟(1)、(2)、(3)與實施例1相同。[〇〇611(4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料(DG0/BG)[0〇62] 米用溶|父-凝|父法制備3wt.%DG0的DG0/BG復(fù)合材料，制備過程為:實驗米用正娃酸乙酯(TE0S)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)等，通過溶膠-凝膠法來制備58S的生物活性玻璃(BG)。首先，將0.36ml TEP溶解于蒸餾水、無水乙醇與氨水的混合液體中，80 °C充分攪拌24h，獲得水解的TEP溶液。然后將0.65ml TE0S與0.35g CN加入TEP水解溶液中，室溫攪拌120h，形成溶膠-凝膠溶液。事先將(3)中制備好的DG0稱取0.0415g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超聲2h，形成均勻的DG0懸液。將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入DG0懸液中，室溫攪拌2h，隨后將DG0/BG混合液在80 °C燒結(jié)12h，得到3wt.% DG0/BG固體。3wt.% DG0/BG固體在氮氣保護環(huán)境下通過系列升溫碳化方式進一步碳化，最終形成3wt.%DG0/BG復(fù)合物，具體程序為:300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫。
[0063](5)DG0/BG基底材料制備[〇〇64]以蓋玻片作為基底，通過旋涂的方法形成有利于后期細胞生長的基底材料。將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無水乙醇和去離子水清洗，氮氣保護吹干，得到表面清潔的蓋玻片。隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷(3-APTES)溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮氣保護下干燥。將3wt.%DG0/BG溶于無水乙醇中配制成0.5% (w/v)的懸液，通過旋涂儀上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備后期實驗使用。[〇〇65]通過以上步驟所得的復(fù)合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其為薄膜狀材料，改性石墨烯在復(fù)合材料中的質(zhì)量分數(shù)為3wt.%。
[0066] 實施例4
[0067]步驟(1)、(2)、(3)與實施例1相同。[〇〇68](4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料(DG0/BG)[0〇69] 米用溶|父-凝|父法制備5wt.%DG0的DG0/BG復(fù)合材料，制備過程為:實驗米用正娃酸乙酯(TE0S)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)等，通過溶膠-凝膠法來制備58S的生物活性玻璃(BG)。首先，將0.36ml TEP溶解于蒸餾水、無水乙醇與氨水的混合液體中，80 °C充分攪拌24h，獲得水解的TEP溶液。然后將0.65ml TE0S與0.35g CN加入TEP水解溶液中，室溫攪拌120h，形成溶膠-凝膠溶液。事先將(3)中制備好的DG0稱取0.0706g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超聲2h，形成均勻的DG0懸液。將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入DG0懸液中，室溫攪拌2h，隨后將DG0/BG混合液在80 °C燒結(jié)12h，得到5wt.% DG0/BG固體。5wt.% DG0/BG固體在氮氣保護環(huán)境下通過系列升溫碳化方式進一步碳化，最終形成5wt.%DG0/BG復(fù)合物，具體程序為:300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫。
[0070](5)DG0/BG基底材料制備
[0071]以蓋玻片作為基底，通過旋涂的方法形成有利于后期細胞生長的基底材料。將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無水乙醇和去離子水清洗，氮氣保護吹干，得到表面清潔的蓋玻片。隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷(3-APTES)溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮氣保護下干燥。將5wt.%DG0/BG溶于無水乙醇中配制成0.5% (w/v)的懸液，通過旋涂儀上，使3〇yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備后期實驗使用。[〇〇72]通過以上步驟所得的復(fù)合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其為薄膜狀材料，改性石墨烯在復(fù)合材料中的質(zhì)量分數(shù)為5wt.%。[〇〇73] 實施例5[〇〇74]步驟(1)、(2)、(3)與實施例1相同。[〇〇75](4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料(DG0/BG)[0〇76] 米用溶|父-凝|父法制備10wt.%DG0的DG0/BG復(fù)合材料，制備過程為:實驗米用正娃酸乙酯(TE0S)、磷酸三乙酯(TEP)、四水硝酸鈣(CN)等，通過溶膠-凝膠法來制備58S的生物活性玻璃(BG)。首先，將0.36ml TEP溶解于蒸餾水、無水乙醇與氨水的混合液體中，80 °C充分攪拌24h，獲得水解的TEP溶液。然后將0.65ml TE0S與0.35g CN加入TEP水解溶液中，室溫攪拌120h，形成溶膠-凝膠溶液。事先將(3)中制備好的DG0稱取0.1491g溶解于二甲基甲酰胺(DMF)，超聲2h，形成均勻的DG0懸液。將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入DG0懸液中，室溫攪拌2h，隨后將DG0/BG混合液在80 °C燒結(jié)12h，得到10wt.% DG0/BG固體。10wt.% DG0/BG固體在氮氣保護環(huán)境下通過系列升溫碳化方式進一步碳化，最終形成l〇wt.%DG0/BG復(fù)合物，具體程序為:300°C保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫。
[0077](5)DG0/BG基底材料制備[〇〇78]以蓋玻片作為基底，通過旋涂的方法形成有利于后期細胞生長的基底材料。將直徑為14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘， 然后用無水乙醇和去離子水清洗，氮氣保護吹干，得到表面清潔的蓋玻片。隨后，將清潔的蓋玻片浸入3%的硅烷(3-APTES)溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮氣保護下干燥。將l〇wt.%DG0/BG溶于無水乙醇中配制成0.5 % (w/v)的懸液，通過旋涂儀上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備后期實驗使用。
[0079]通過以上步驟所得的復(fù)合材料含有多巴胺改性的氧化石墨烯和生物活性玻璃，其為薄膜狀材料，改性石墨烯在復(fù)合材料中的質(zhì)量分數(shù)為l〇wt.%。
【主權(quán)項】
1.一種誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，其特征是所述骨修復(fù)復(fù)合材料由石 墨烯薄膜和生物活性玻璃構(gòu)成，所述生物活性玻璃均勻負載于所述石墨烯薄膜表面;所述 生物活性玻璃為均勻球形形貌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，其特征在于所述 石墨烯薄膜為氧化石墨烯經(jīng)多巴胺改性而成。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，其特征在于所述 生物活性玻璃的材質(zhì)為正硅酸四乙酯、磷酸三乙酯和四水硝酸鈣。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，其特征在于所述 復(fù)合材料為薄膜材料，所述石墨稀薄膜層間距為〇.39nm，所述生物活性玻璃的直徑為50nm ?100nm〇5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料，其特征在于所述 復(fù)合材料中，所述石墨烯質(zhì)量百分數(shù)為0.5 %?10 %，其余為所述生物活性玻璃。6.如權(quán)利要求1?5之一項所述的誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方 法，其特征是所述氧化石墨稀合成通過優(yōu)化的Hmiimers法合成;所述復(fù)合材料的制備采用溶 膠-凝膠法結(jié)合熱處理的方法完成。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于所述多巴胺改性的氧化石墨稀的制備包括如下步驟:采用優(yōu)化的Hummers獲得氧化 石墨、超聲得到分散均勻的單層或少層氧化石墨烯、鹽酸多巴胺溶液的配制、攪拌過夜、離 心、烘干。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于所述溶膠-凝膠法結(jié)合熱處理的方法合成復(fù)合材料的制備包括如下步驟:正硅酸乙 酯-磷酸三乙酯-四水硝酸鈣溶膠-凝膠溶液的配制、多巴胺改性的氧化石墨烯懸液的配制、 多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃混合液配制、燒結(jié)、碳化。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘導間充質(zhì)干細胞分化的骨修復(fù)復(fù)合材料的制備方法，其特 征在于包括如下步驟:(1)氧化石墨烯的制備采用優(yōu)化的Hummers法成功獲得氧化石墨，并通過超聲得到分散均勻的單層或少層氧 化石墨烯:天然鱗片石墨與硝酸鈉按2:1的比例混合后加入230ml濃硫酸，之后冰浴條件下 加入高錳酸鉀，攪拌，保持反應(yīng)溫度低于20°C;移走冰浴，在35°C水浴中保溫30分鐘后緩慢 加入460ml去離子水，待反應(yīng)溫度下降到70°C，同樣溫度水浴10分鐘；隨后加入700ml雙氧 水，使反應(yīng)終止;抽濾，將得到的黃褐色過濾物反復(fù)清洗、離心，至上清ph為7左右，烘干，得 到氧化石墨；超聲分離:以lmg: lml的比例將氧化石墨與去離子水混合，將超聲波細胞粉碎機功率調(diào) 至800W，超聲2h，得到分散均勻的氧化石墨烯；(2)氧化石墨烯的還原還原:基于步驟(1)中制備的氧化石墨烯，將氧化石墨烯、水合肼、氨水、去離子水以 100mg: 10ml: 0.lml: 100ml的比例混合后在95°C水浴中保持2h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，清洗，最后 烘干得到還原的氧化石墨烯；(3)氧化石墨烯的改性按照步驟(1)中超聲的方法將氧化石墨烯與去離子水按照165mg: 100ml進行超聲，之后 加入鹽酸多巴胺，配成濃度為〇.25mmol/L的溶液，攪拌過夜，離心，烘干，得到多巴胺改性的 氧化石墨烯；(4)溶膠-凝膠法制備氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合材料采用溶膠-凝膠法制備〇.5wt.%?10wt.%多巴胺改性的氧化石墨稀的/生物活性玻璃 復(fù)合材料，制備過程為:實驗采用正硅酸乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸鈣，通過溶膠-凝膠法 來制備生物活性玻璃;首先，將磷酸三乙酯溶解于蒸餾水、無水乙醇與氨水的混合液體中， 80 °C充分攪拌24h，獲得水解的磷酸三乙酯溶液;然后將正硅酸乙酯與四水硝酸鈣加入磷酸 三乙酯水解溶液中，室溫攪拌120h，形成溶膠-凝膠溶液;事先將步驟(3)中制備好的多巴胺 改性的氧化石墨烯溶解于二甲基甲酰胺，超聲2h，形成均勻的多巴胺改性的氧化石墨烯懸 液;將溶膠-凝膠溶液按比緩慢加入多巴胺改性的氧化石墨烯懸液中，控制多巴胺改性的氧 化石墨烯的質(zhì)量分數(shù)為0.5wt.%?10wt.%，室溫攪拌2h，隨后將多巴胺改性的氧化石墨 烯/生物活性玻璃混合液在80°C燒結(jié)12h，得到多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固 體;多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃固體在氮氣保護環(huán)境下通過系列升溫碳化方 式進一步碳化，最終形成多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃復(fù)合物，具體程序為:300 。(:保持lh，750°C保持2h，1000°C保持3h，隨后自然降溫至室溫；(5)多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃基底材料制備以蓋玻片作為基底，通過旋涂的方法形成有利于后期細胞生長的基底材料;將直徑為 14mm的蓋玻片置于體積比1:3的過氧化氫/濃硫酸的混合溶液中，在120°C保持10分鐘，然后 用無水乙醇和去離子水清洗，氮氣保護吹干，得到表面清潔的蓋玻片；隨后，將清潔的蓋玻 片浸入3%的硅烷溶液中30分鐘，使其表面功能化，以便于后期材料粘附，沖洗，氮氣保護下 干燥;將多巴胺改性的氧化石墨烯/生物活性玻璃溶于無水乙醇中配制成質(zhì)量體積百分比 為0.5%的懸液，通過旋涂儀上，使30yl懸液在功能化蓋玻片上均勻覆蓋，室溫下晾干，以備 后期實驗使用。
【文檔編號】A61L27/10GK105999396SQ201610312485
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】鄧旭亮, 莫曉菊, 衛(wèi)彥, 張學慧, 沈洋, 蔡晴
【申請人】北京大學口腔醫(yī)院