7. Ο, 34. 4, 32. 2, 30. 6, 29. 7, 28. 8, 25. 5, 22. 2, 21. 1, 20. 9, 19. 4, 18. 3, 16. 5, 16. 2, 15 .9, 14. 8, 14. 2。
[0040] 實(shí)施例6 ;制備白枠脂酸-28-甲醋-3目-ο- ( α -D-甘露糖巧）
[0041]
[0042] 將白枠脂酸-28-甲醋-3目-0-(2,3, 4,6-四-0-苯甲醜基-a-D-甘露糖巧） (80. 0mg，0. 076mmol)溶于二氯甲焼和甲醇（10血）混合溶液中，加入催化量的甲醇鋼至 抑=9,室溫反應(yīng)她，化C(二氯甲焼/甲醇=10:1)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)結(jié)束后，用陽離 子樹脂中和至中性。濾除陽離子樹脂，將有機(jī)相旋蒸后經(jīng)硅膠柱層析得白枠脂酸-28-甲 醋-3 目-0-( α -D-甘露糖巧）白色固體（41. Omg, 85. 2 % )。電 NMR(400MHz，DMSO) δ 4. 74 (s, IH), 4. 71 (d, J = 4. OHz, IH), 4. 68 (s, IH), 4. 65 (d, J = 4. IHz, IH), 4. 54 (d, J =8. 9Hz, 2H)，4. 36 (t, J = 5. 6Hz, IH)，3. 61 (s, IH)，3. 57 (s, 3H)，3. 49 (s, IH)，3. 43 (s, 1 H)，3. 40(d，J = 7. 5Hz，2H)，3. 32(s，2H)，3. 13(dd，J = 11.6,3. 9Hz，lH)，2. 90(dd，J = 10. 6, 5. 6Hz, IH)，2. 12 (t, J = 12. OHz, 2H)，1. 83-1. 65 (m, 3H)，1. 63 (s, 3H)，1. 55 (dd, J = 21. 4, 10.0 Hz, 2H)，1. 45 (d, J = 8.細(xì)z, 2H)，1. 40 (s, IH)，1. 39-1. 19 (m, 7H)，1. 06 (ddd, J =43. 8, 12. 7, 3. 9Hz, 3H)，0. 91 (d, J = 4. 7Hz, 5H)，0. 82 (s, 3H)，0. 76 (s, 3H)，0. 67 (d, J = 11. 4Hz, 3H) ;"C NMRQOOMHz，DMSO) δ 176. 2, 150. 6, 110. 3, 96. 3, 80. 7, 74. 9, 71. 7, 71. 5, 67 .3, 61. 8, 56. 4, 55. 5, 51. 7, 50. 3, 49. 2, 47. 1，42. 5, 40. 7, 40. 5, 38. 5, 38. 2, 37. 2, 36. 6, ：M. 3 ,31. 9, 30. 5, 29. 6, 28. 8, 25. 5, 21. 8, 20. 9, 19. 4, 18. 3, 16. 8, 16. 4, 16. 1, 14. 9 ；ESIMS:calcd forUM+NaiTm/z 655. 4, found:655. 8.
[004引實(shí)施例7藥理實(shí)驗(yàn)
[0044] (1).化合物對(duì)冊(cè)N1高致病流感病毒感染宿主細(xì)胞的影響
[0045] 篩選模型的原理：
[0046] 血凝素是流感病毒表面的糖蛋白，其主要作用是與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合和融 合，在流感病毒對(duì)宿主細(xì)胞的分子識(shí)別和選擇性結(jié)合起決定作用?；谘靥匦?，本發(fā)明 建立了 W HIV為核必的流感病毒的重組病毒系統(tǒng)（HA/HIV)，具體方法如下。將HIV載體質(zhì) 粒（P化4-3. Luc. R-. E-.，從NIH獲得）和克隆至哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA-3的HA的質(zhì) 粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞（人胚胎腎細(xì)胞）后，細(xì)胞可產(chǎn)生W HIV為核必并包裹有HA外殼蛋 白的病毒顆粒。該病毒顆粒具有W下特點(diǎn)：1)病毒對(duì)宿主細(xì)胞的選擇性取決于血凝素的特 性；2)由于HIV載體上env、nef和vpr基因缺失，因此該病毒只能一次性進(jìn)入宿主細(xì)胞并 且不能復(fù)制，所W該病毒是安全的；3)該HIV載體上帶有一個(gè)英光素酶報(bào)告基因，因此被感 染的細(xì)胞會(huì)表達(dá)英光素酶，通過檢測(cè)英光素酶活性就可標(biāo)示細(xì)胞被病毒感染的程度；
[0047] 另外，本發(fā)明采用水泡性口炎病毒外殼蛋白（VSV-G)包裝HIV-1核必，構(gòu)建VSVG/ HIV-1重組病毒同時(shí)檢測(cè)化合物，W排除HIV-1核必對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，即化合物可抑制HA/ HIV-1的進(jìn)入，而不抑制VSVG/HIV-1的進(jìn)入時(shí)，認(rèn)為化合物是流感病毒侵入宿主細(xì)胞的特 異性抑制劑。
[0048] 實(shí)驗(yàn)方法；在本發(fā)明中應(yīng)用了冊(cè)N1流感病毒對(duì)實(shí)施例進(jìn)行藥理活性評(píng)價(jià)：
[0049] 冊(cè)N1，Influenza A/Vietnam/1203/04(簡(jiǎn)稱；Viet)
[0050] 感染前一天，按每孔6 X ΙΟ4個(gè)細(xì)胞的密度將A549細(xì)胞接種到24孔板上，用DMSO 溶解陽性對(duì)照化合物或待篩選化合物，感染前15分鐘加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，W DMS0溶劑作 空白對(duì)照，加入適宜稀釋度的病毒液（HA/HIV-1或VSV-G/HIV-1)感染細(xì)胞。感染48小時(shí) 后，被感染的細(xì)胞每孔加入50 μ L細(xì)胞裂解液（Promega)裂解細(xì)胞，將30 μ L英光素酶底物 (Promega)與20μ L細(xì)胞裂解液混合后用FB15英光檢測(cè)器（Sirius)儀器測(cè)定細(xì)胞英光素 酶的相對(duì)活性，其活性的強(qiáng)弱反映了病毒的感染的水平；結(jié)果顯示，本發(fā)明的化合物能有效 抑制冊(cè)N1高致病流感病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵入，結(jié)果如表1所示。
[0051] 表1化合物對(duì)HA(Viet)/HIV，VSVG/HIV-1感染作用的比較
[0052]
陽05引注：化合物在10 μ Μ濃度下對(duì)VSV-G/HIV-1的抑制率小于10%。
[0054] 似.細(xì)胞毒性試驗(yàn)
[00巧]應(yīng)用ΜΤΤ法測(cè)定了所涉及的化合物對(duì)Α549細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，所述的化 合物在10 μ Μ的終濃度下均無細(xì)胞毒性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 單糖單元為D-甘露糖的皂苷，其特征在于，所述皂苷的單糖單元為D-甘露糖，包括 如結(jié)構(gòu)通式（I)和（II)所示的齊墩果酸皂苷和白樺脂酸皂苷， 其中，&為C1-C18烷氧基；單糖通過α -糖苷鍵與齊墩果酸和白樺脂酸的C-3鏈接；2. 權(quán)利要求1所述的單糖單元為D-甘露糖的皂苷的制備方法，其特征在于， 以齊墩果酸和白樺脂酸作為原料，按式（I)反應(yīng)路線，通過下述步驟制備：(a) 齊墩果酸或白樺脂酸與碘甲烷或其他醇反應(yīng)，在C-28引入酯基； (b) 分別將齊墩果酸酯和白樺脂酸酯的3 β-ΟΗ與糖基供體反應(yīng)引入α-甘露糖單元； (c) 在CH30Na/CH30H條件下脫除糖單元上的?；Ｗo(hù)基分別得到3 β -0- α -甘露糖基 齊墩果酸酯和3 β -0- a -D-甘露糖基白樺脂酸酯。3. 如權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于，D-甘露糖基供體選自乙?；?、苯甲?；⑹?戊?；鶠榱u基保護(hù)基；甘露糖C-1活化基團(tuán)選自三氯乙酰亞胺酯、乙硫苷、苯硫苷或?qū)?甲 苯硫苷。4. 如權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于，構(gòu)建a -D-甘露糖苷鍵的路易斯酸催化劑 選自C3_C9的鹵代酰胺、CfC6的氟代烴基磺酸、C 2_CS的硅基氟代烴基磺酸酯、CfC6的氟代 烴基磺酸銀、三氟化硼-乙醚絡(luò)合物或三氟化硼-乙醚混合物；糖苷化反應(yīng)中的有機(jī)溶劑 選自的氯代烷烴、甲苯或乙醚；淬滅劑選自三甲胺、三乙胺或硫代硫酸鈉；分子篩優(yōu)選 自3 A -5 A型硅鋁酸鹽分子篩；柱層析純化中洗脫用的溶劑選自石油醚、二氯甲烷、乙酸乙 酯、三氯甲烷、甲醇、正己烷或環(huán)己烷中一種或多種的混合物。5. 如權(quán)利要求2的制備方法，其特征在于，脫保護(hù)基反應(yīng)中極性溶劑選自四氫呋喃、甲 醇、乙醇、二氯甲烷、水中的一種或多種的混合物；重結(jié)晶純化中的溶劑選自三氯甲烷、(；-(； 的烷基醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、石油醚、環(huán)己烷、二氯甲烷或水中一種或多種的混合物。6. 權(quán)利要求1所述的單糖單元為D-甘露糖的皂苷在制備抗流感病毒藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域。提供了單糖單元為D-甘露糖的皂苷及其制備方法和在制藥中的用途，具體涉及單糖單元為D-甘露糖的齊墩果酸皂苷和白樺脂酸皂苷及其制備方法和在制備抗流感病毒藥物中的用途。本發(fā)明以天然產(chǎn)物齊墩果酸和白樺脂酸為原料，通過結(jié)構(gòu)修飾首先在C-28位引入酯基，然后在C-3位引入α-構(gòu)型的D-甘露糖得到具有抑制高致病流感病毒H5N1感染宿主細(xì)胞的單糖單元為D-甘露糖的皂苷，本發(fā)明進(jìn)行了藥理實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，所述的皂苷類化合物對(duì)H5N1高致病流感病毒的侵入宿主細(xì)胞過程有明顯的抑制作用，可進(jìn)一步用于制備預(yù)防或治療流感病毒的藥物，以及制備與其它抗病毒藥的聯(lián)合用藥以及包含它的藥物組合物。
【IPC分類】A61P31/16, C07H1/00, C07H15/256, C07J63/00
【公開號(hào)】CN105669820
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】劉國(guó)運(yùn), 郭穎, 李英霞, 任素梅, 高頂頂
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué), 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2014年11月19日