一種抗壞血酸含量測定試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域領(lǐng)域，涉及一種試劑盒，具體涉及一種抗壞血酸含量測定試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素是人和動(dòng)物為維持正常的生理功能而必須從食物中獲得的一類微量有機(jī)物質(zhì)，在人和動(dòng)物生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。維生素大致可分為脂溶性和水溶性兩大類，水溶性維生素主要包括維生素B1、維生素B2、抗壞血酸等。
[0003]抗壞血酸(AsA)即維生素C，在生物體內(nèi)，抗壞血酸是一種抗氧化劑，保護(hù)身體免于自由基的威脅，抗壞血酸同時(shí)也是一種輔酶。目前市面已有的檢測抗壞血酸的方法為滴定法和光度分析法。
[0004]滴定法又包括2，6 -二氯靛酚滴定法和直接碘量法兩種。2，6-二氯靛酚滴定法，在滴定過程中還原型抗壞血酸還原2，6-二氯酚靛酚后，自身被氧化生成脫氫抗壞血酸，在沒有雜質(zhì)干擾時(shí)，一定量的樣品提取液還原標(biāo)準(zhǔn)2，6-二氯酚靛酚的量與樣品中所含抗壞血酸的量成正比。該法缺陷在于特異性差，許多其他還原性的化合物均可以還原2，6_二氯酚靛酚，且生成的有色化合物不穩(wěn)定，加上測定終點(diǎn)難以準(zhǔn)確判斷，給測定結(jié)果造成較大誤差。
[0005]直接碘量法的原理是利用碘的氧化性，用淀粉作指示劑，采用碘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行直接滴定，當(dāng)抗壞血酸被碘完全氧化后，過量的碘與淀粉作用而使溶液變藍(lán)，并指示滴定終點(diǎn)，依據(jù)所消耗的碘量即可計(jì)算出試樣中抗壞血酸的含量。但是碘溶液具有不穩(wěn)定性，易揮發(fā)，致使碘標(biāo)準(zhǔn)液的配制與標(biāo)定比較繁瑣。
[0006]光度分析法常選用的是2，4-二硝基苯肼法，但該法干擾因素較多，2，4-二硝基苯肼除了與抗壞血酸發(fā)生反應(yīng)外，還可以與五碳糖、六碳糖等碳水化合物反應(yīng)，從而影響了測定結(jié)果，且反應(yīng)顯色時(shí)間較長，37°C下的反應(yīng)需耗時(shí)3_4h，操作費(fèi)時(shí)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明旨在提供一種抗壞血酸含量測定試劑盒及其方法，可快速準(zhǔn)確的測算出抗壞血酸的含量。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種抗壞血酸含量測定試劑盒，包括以下試劑:
試劑一，液體X I瓶，4°c保存，由偏磷酸溶于蒸餾水后配制而成，置于120mL試劑瓶中； 試劑二，液體X I瓶，4°C保存，由磷酸組成，置于5mL試劑瓶中；
試劑三，維生素C標(biāo)準(zhǔn)品Xl支，-20°C保存，由L-抗壞血酸組成，置于1.5mL EP管中。
[0009]進(jìn)一步的，所述試劑一中，偏磷酸的質(zhì)量為0.Sg，蒸餾水的體積為80mL。
[0010]進(jìn)一步的，所述試劑二中，磷酸的體積為5mL。
[0011]進(jìn)一步的，所述試劑三中，L_抗壞血酸的質(zhì)量為0.5mg。
[0012]抗壞血酸不穩(wěn)定，在樣品處理和儲(chǔ)存過程中極易氧化，而抗壞血酸在254 nm波長下有吸收峰，故高效液相色譜為抗壞血酸的測定提供了簡單、快速且準(zhǔn)確的方法。
[0013 ] —種基于高效液相色譜法的抗壞血酸含量測定方法，包括以下步驟:
步驟I儀器和用品的準(zhǔn)備；
高效液相色譜儀、低速離心機(jī)、溶劑抽濾裝置、渦旋震蕩器、針頭式過濾器(水系，50個(gè)，
0.22μπι)、濾膜(水系和有機(jī)系各I個(gè)，0.45μπι)、C18柱(4.6X250 mm)、可調(diào)式移液器、樣品瓶(50個(gè)，2mL)、內(nèi)襯管(50個(gè)，放置在樣品瓶內(nèi)用于微量樣品進(jìn)樣)、甲醇(色譜級(jí)，200 mL)和超純水；
步驟2溶劑的除雜處理；
將500 mL超純水用0.45μπι的水系濾膜抽濾，將200 mL甲醇用0.45μπι的有機(jī)系濾膜抽濾，分別除去超純水和甲醇中的雜質(zhì)，以防止堵塞色譜柱；
步驟3流動(dòng)相的配制；
取10mL除雜后的甲醇和400mL除雜后的超純水混合(I: 4的比例)，并加入0.5mL所述試劑二，混勻，配成流動(dòng)相；
步驟4溶劑的脫泡；
將配好的流動(dòng)相超聲30分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱；
步驟5抗壞血酸的提?。?br> 稱取0.1g樣本，加入ImL所述試劑一，冰浴勾楽，采用離心率8000g離心1min，取上清液，用所述試劑一定容至lmL，混勻，使用針頭式過濾器過濾后待測；
步驟6標(biāo)準(zhǔn)品的配制；
在所述試劑三中加入ImL所述試劑一，配成500yg /mL的母液，將母液用所述試劑一分別稀釋成40yg/mL、30yg/mL、20yg /mL和1yg /mL的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別將四組不同濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用針頭式過濾器過濾后待測；
步驟7抗壞血酸含量測定操作步驟；
1)開啟電腦、檢測器和栗，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量1yL，流速
0.6 mL/min，柱溫25°C，保留時(shí)間1min，檢測波長254nm，設(shè)置完畢保存方法組；
2)啟動(dòng)輸液栗，使流動(dòng)相通過色譜柱，待基線穩(wěn)定后開始加樣；
3 )分別加入四組不同濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液I OyL，在I Omin內(nèi)可分離抗壞血酸，抗壞血酸的保留時(shí)間為5min左右，(柱子不同，保留時(shí)間有差異)，計(jì)算四組不同濃度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積；
4)加入樣品10yL，在相應(yīng)保留時(shí)間處檢測抗壞血酸的峰面積；
步驟8抗壞血酸含量的計(jì)算；
以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(yg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)計(jì)算抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品抗壞血酸的含量。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:
1、由于抗壞血酸不穩(wěn)定，因此本發(fā)明的樣本前處理過程快速，可以有效地保留樣本中抗壞血酸，而且提取液成分簡單，僅用1%的偏磷酸溶液即可，成本極低。
[0015]2、本發(fā)明的方法采用紫外檢測器，通過保留時(shí)間定性、峰面積定量，測定結(jié)果更加準(zhǔn)確。
[0016]3、本發(fā)明的測定步驟只需要在測定前簡單配制試劑一和試劑二，操作簡單，非專業(yè)人士也能實(shí)施。
[0017]4、本發(fā)明的方法在自動(dòng)進(jìn)樣器的輔助下可以連續(xù)進(jìn)樣，適用于樣本的批量測定，節(jié)省測定時(shí)間和人力。
[0018]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)說明。本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】由以下實(shí)施例詳細(xì)給出。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面將結(jié)合實(shí)施例，來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0020]一種抗壞血酸含量測定試劑盒，包括以下試劑:
試劑一，液體X I瓶，4°c保存，由0.Sg偏磷酸溶于SOmL蒸餾水后配制而成，置于120mL試劑瓶中；
試劑二，液體X I瓶，4°C保存，由5mL磷酸組成，置于5mL試劑瓶中；
試劑三，維生素C標(biāo)準(zhǔn)品X I支，-20°C保存，由0.5mg L-抗壞血酸組成，置于1.5mL EP管中。
[0021]抗壞血酸不穩(wěn)定，在樣品處理和儲(chǔ)存過程中極易氧化，而抗壞血酸在254nm波長下有吸收峰，故高效液相色譜為抗壞血酸的測定提供了簡單