糖尿病患者中的表達情況。
[0045] 具體的實施方式
[0046] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold SprIIng HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0047] 實施例1篩選與II型糖尿病相關(guān)的基因標志物
[0048] 1、樣品收集
[0049] 各收集10例正常人血液和II型糖尿病患者血液樣本，上述所有標本的取得均通過 倫理委員會的同意。
[0050] 2、RNA樣品的制備及質(zhì)量分析 [0051 ] 2.1RNA樣品的制備
[0052] (1)勻漿處理
[0053] 直接取血液，加入3倍體積紅細胞裂解液，混勻后室溫放置10min，10，000rpm離心 lmin。徹底吸棄上清，收集白細胞沉淀。每100-200μ1血液收集的白細胞沉淀加入lml Trizol〇
[0054] (2)分層
[0055] a ·樣品加入TRi zo 1后，室溫放置5min，使樣品充分裂解。4 °C 12，OOOrpm離心1 Omin， 取上清；
[0056] b.每lml Trizol加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勾后室溫放置3_5min使其自然分相。
[0057] (3)RNA 沉淀
[0058] 3.4<€12,000印111離心10-15111；[11。樣品會分成三層 :黃色的有機相，中間層和無色的 水相，RNA主要在水相中，把水相小心的轉(zhuǎn)移到新管中。
[0059] b ·在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置lOjOminjr 12，OOOrpm離心 lOmin，棄上清，RNA沉淀于管底。
[0060] (4)RNA 漂洗
[0061 ] a.RNA沉淀中加入lml 75%乙醇（用RNase-free水配制），溫和振蕩離心管，懸浮沉 淀。每lml TRizol加入lml 75%乙醇。
[0062] b · 4°C5，000-8，OOOrpm離心l-2min，棄上清；短暫快速離心，用移液器小心吸棄上 清，注意不要吸棄沉淀。室溫放置l_2min瞭干沉淀。
[0063] (5)溶解 RNA
[0064] 沉淀中加入50-100μ1 RNase-f ree水，輕彈管壁，以充分溶解RNA，-70 °C保存。
[0065] 2.2RNA樣品的質(zhì)量分析(NanoDroplOOO分光光度計）
[0066] NanoDroplOOO分光光度計檢測RNA樣品，RNA-seq測序的樣品要求:0D260/0D280為 1·8 _2·2 〇
[0067] 2.3RNA樣品的質(zhì)量分析（Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
[0068] 將上述提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，Ag i 1 ent Techno 1 og i e s 2 1 00 Bioanalyzer檢測RNA樣品質(zhì)量，觀察28S rRNA和18S rRNA主帶明顯、無降解、RNA完整性指 數(shù)合格、濃度達到要求的符合RNA-seq測序cDNA文庫構(gòu)建的要求，可以用于文庫構(gòu)建及測 序。
[0069] 3、高通量轉(zhuǎn)錄組測序
[0070] 3 · lRNA-seq讀段定位
[0071 ]首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用TopHat vl. 3.1將清潔片段與 UCSC H. sapiens參考基因組(hgl9)進行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的預先構(gòu)建的索引 從TopHat主頁下載，并作為參考基因組，利用TopHat與基因組匹配時，允許每個讀段(默認 到20)有多個匹配位點，最多2次錯配。TopHat根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號建立可能的 剪切位點庫，根據(jù)這些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用 TopHat方法的系統(tǒng)默認參數(shù)。
[0072] 3.2轉(zhuǎn)錄豐度評估
[0073] 匹配上的讀段文件通過Cufflinks vl.0.3處理，Cufflinks vl.0.3將RNA-seq片 段數(shù)目進行標準化計算轉(zhuǎn)錄本的相對豐度。FPKM值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定 基因 lkb長的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過貝葉斯推理方法計算FPKM估計值的置信區(qū)間。 Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載（Homo_ sapllens.GRCh37·63·gtf)。
[0074] 3.3差異表達基因的檢測
[0075] 將下載的Ensembl GTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdllff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達豐度，檢測差異表 達。在Cuff iDff輸出中只有q值<0.01，測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。
[0076] 4、結(jié)果
[0077] RNA-seq結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)AN1基因在II型糖尿病患者血液中的表達量顯著高于正 常人的表達量。
[0078] 實施例2 QPCR測序驗證FAN1基因的差異表達
[0079] 1、根據(jù)高通量測序的檢測結(jié)果選擇FAN1基因進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1 中的樣本收集方式選擇II型糖尿病患者血液和正常人血液各70例。
[0080] 2、RNA提取步驟同實施例1。
[0081] 3、逆轉(zhuǎn)錄:使用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行操作。具體步驟如下：
[0082] (1)取總RNA 2yg進行逆轉(zhuǎn)錄，加入01IIgo(dT)2yl，充分混勻；70°C水浴；5min后立 即冰浴2_3min;
[0083] (2)構(gòu)建25μ1反應體系，其中包括5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5yl，dNTP(2.5mM)5yl，RNasIIn 4〇υ/μ1，M-MLV 20〇υ/μ1，補無核酶水至25μ1;
[0084] (3)42°C水浴 60min 后，95°C水浴 5min 以滅活 M-MLV，-20°C儲存?zhèn)溆谩?br>[0085] 4、QPCR 擴增
[0086] (1)引物設(shè)計
[0087] 根據(jù)Genebank中FAN1基因和管家基因 GAH)H基因的編碼序列設(shè)計QPCR擴增引物， 由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。
[0088] GAPDH基因的引物序列對如下：
[0089] 正向引物序列為5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'（SEQ ID N0.3);
[0090] 反向引物序列為5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQIDN0·4)。
[0091] FAN1基因的引物對序列如下：
[0092] 正向引物序列為5'-TGAGAATGAAGATGATATGTTG-3'（SEQ ID N0.5);
[0093] 反向引物序列為5'-GTGTTAAGTCTAAGGCAATC-3'（SEQ ID N0.6)。
[0094] (2)PCR反應體系：正向引物和反向引物各lyl，SYBR Green聚合酶鏈式反應體系 12.5以1，模板2以1，加去離子水補足至25"1。
[0095] 其中，SYBR Green聚合酶鏈式反應體系購自IlnvIItrogen公司。
[0096] (3)PCR反應條件：95°C lOmin，（95°C 15s，60°C60s) X 40個循環(huán)。以SYBR Green作為 熒光標記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，△△ CT法進行相對定量。
[0097] 5、統(tǒng)計學方法
[0098]實驗采用3次重復實驗，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，使用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具有統(tǒng) 計學意義。
[0099] 6、結(jié)果
[0100] 結(jié)果如圖2所示，與正常人血液相比，F(xiàn)AN1基因在II型糖尿病患者血液中的表達上 調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P〈〇.〇5)，同RNA-sep結(jié)果一致。
[0101]上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 檢測FAN1基因表達水平的產(chǎn)品在制備診斷II型糖尿病工具中的應用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括:通過實時定量PCR、RT-PCR、 免疫檢測、原位雜交或芯片檢測FAN1基因的表達水平。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷II型糖尿病的產(chǎn) 品至少包括一對特異擴增FAN1基因的引物;所述用RT-PCR診斷II型糖尿病的產(chǎn)品至少包括 一對特異擴增FAN1基因的引物;所述用免疫檢測診斷II型糖尿病的產(chǎn)品包括:與FAN1蛋白 特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷II型糖尿病的產(chǎn)品包括:與FAN1基因的核酸序列 雜交的探針;所述用芯片診斷II型糖尿病的產(chǎn)品包括:蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯 片包括與FAN1蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與FAN1基因的核酸序列雜交的探針。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷II型糖尿病的產(chǎn) 品至少包括的一對特異擴增FAN1基因的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的應用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片和/或試劑盒； 其中所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢 測試劑盒。6. -種診斷II型糖尿病的工具，其特征在于，所述的工具能夠通過檢測樣本中FANIS 因的表達水平來診斷II型糖尿病。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的工具，其特征在于，所述工具包括芯片、或試劑盒;其中，所述 芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核 苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測FAN1基因轉(zhuǎn)錄水平的針對FAN1基因的寡核苷酸 探針;所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的FAN1蛋白的特異性抗體;所述 試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試劑盒包括用于檢測 FAN1基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括FAN1蛋白的特異性抗體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的工具，其特征在于，所述檢測FAN1基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑包括針 對FAN1基因的引物和/或探針。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的工具，其特征在于，所述基因檢測試劑盒包含SYBR Green 聚合酶鏈式反應體系、用于擴增FAN1基因和管家基因的引物對;所述SYBR Green聚合酶鏈 式反應體系包含:PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的工具，其特征在于，所述擴增FAN1基因的引物對序列包括正 向引物SEQ ID NO.5和反向引物SEQ ID NO.6。
【專利摘要】本發(fā)明公開了FAN1基因在II型糖尿病診斷中的應用，F(xiàn)AN1基因在II型糖尿病患者的血液中表達水平高于健康人血液的表達水平，通過檢測患者血液中FAN1基因的表達水平，可以診斷患者是否患有糖尿病，從而實現(xiàn)患者的早期治療。
【IPC分類】C12Q1/68, G01N33/68
【公開號】CN105648074
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】宋宏濤, 肖楓
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月29日