Fan1基因在ii型糖尿病診斷中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及FAN1基因在II型糖尿病診斷中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或 其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病時(shí)長期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、 腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。隨著全球范圍內(nèi)人們生活水平的不斷提高，糖 尿病患病人數(shù)也迅速增加。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)到2030年，全世界糖尿病患者人數(shù)將超 過3.5億。由于糖尿病的發(fā)病率不斷上升，其無法最終治愈的慢性病本質(zhì)，以及與其并發(fā)癥 (包括但不限于心血管疾病，腎衰竭，癌癥，失明，截肢)相關(guān)的嚴(yán)重的健康隱患，迫切需要有 新的、有效的方法來評(píng)估或預(yù)測個(gè)體今后可能患有糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，以便可以采取預(yù)防性措 施來預(yù)防或延遲這些個(gè)體中糖尿病的發(fā)生或降低糖尿病相關(guān)癥狀/風(fēng)險(xiǎn)的嚴(yán)重程度。
[0003] 大多數(shù)糖尿病案例分成三大類：1型、II型和妊娠糖尿病。II型糖尿病比I型糖尿病 更為常見，超過90%的糖尿病患者為II型糖尿病。后者與特征為肥胖和胰島素抵抗(降低胰 島素敏感性)的現(xiàn)代病密切相關(guān)?，F(xiàn)代研究表明II型糖尿病有很強(qiáng)的遺傳成分，目前已發(fā)現(xiàn) 20多個(gè)候選基因如胰島素基因、胰島素受體基因、胰島素受體底物-1基因、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 基因、葡萄糖激酶基因、糖原合成酶基因、β3受體基因及線粒體基因等與II型糖尿病有關(guān) 聯(lián)，上述候選基因與II型糖尿病關(guān)聯(lián)的研究為我們?cè)谌后w中進(jìn)行發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測提供了分子 生物學(xué)基礎(chǔ)，目前世界許多國家都在致力于此方面的研究。
[0004] 目前，II型糖尿病的診斷主要依靠尿糖、尿酮、尿白蛋白、血電解質(zhì)、血尿素氮和肌 酐等實(shí)驗(yàn)室檢查和各種輔助檢查，但是臨床上尚無可靠的生物標(biāo)志物可以對(duì)II型糖尿病進(jìn) 行風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測和早期診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供與II型糖尿病相關(guān)的基因標(biāo)志 物，使用基因標(biāo)志物來診斷疾病具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，使患者在糖尿病早期就能知 曉風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了檢測FAN1基因表達(dá)水平的產(chǎn)品在制備診斷II型糖尿病工具中的應(yīng) 用。
[0008] 進(jìn)一步，上面所述診斷產(chǎn)品包括:通過實(shí)時(shí)定量PCR、RT_PCR、免疫檢測、原位雜交 或芯片檢測FAN1基因的表達(dá)水平。
[0009] 進(jìn)一步，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷II型糖尿病的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增FAN1 基因的引物;所述用RT-PCR診斷II型糖尿病的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增FAN 1基因的引 物;所述用免疫檢測診斷II型糖尿病的產(chǎn)品包括:與FAN1蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原 位雜交診斷II型糖尿病的產(chǎn)品包括:與FAN1基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷 II型糖尿病的產(chǎn)品包括:蛋白芯片和基因芯片;其中，蛋白芯片包括與FAN1蛋白特異性結(jié)合 的抗體，基因芯片包括與FAN1基因的核酸序列雜交的探針。
[0010] 進(jìn)一步，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷II型糖尿病的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增 FAN1基因的引物序列如SEQIDN0.5和SEQIDN0.6所示。
[0011] 進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片和/或試劑盒;其中所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯 片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒。
[0012] 所述基因檢測試劑盒包括SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增FAN1基因和 管家基因的引物對(duì)；所述SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含：PCR緩沖液、dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0013] 本發(fā)明提供了一種診斷II型糖尿病的工具，所述工具能夠通過檢測FAN1基因的表 達(dá)水平來診斷II型糖尿病。
[0014] 進(jìn)一步，上面所述的工具包括芯片、或試劑盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白 質(zhì)芯片;所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷 酸探針包括用于檢測FAN1基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)FAN1基因的寡核苷酸探針;所述蛋白質(zhì)芯片 包括固相載體以及固定在固相載體上的FAN1蛋白的特異性抗體;所述試劑盒包括基因檢測 試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試劑盒包括用于檢測FAN1基因轉(zhuǎn)錄水平的試 劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括FAN1蛋白的特異性抗體。其中，所述基因芯片可用于檢測 包括FAN1基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與II型糖尿病相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋 白質(zhì)芯片可用于檢測包括FAN1蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與II型糖尿病相關(guān)的多個(gè)蛋白 質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個(gè)與II型糖尿病的標(biāo)志物同時(shí)檢測，可大大提高II型糖尿病診斷 的準(zhǔn)確率。
[0015] 所述固相載體包括無機(jī)載體和有機(jī)載體，所述無機(jī)載體包括但不限于有硅載體、 玻璃載體、陶瓷載體等;所述有機(jī)載體包括聚丙烯薄膜、尼龍膜等。
[0016] 進(jìn)一步，上面所述試劑包括使用實(shí)時(shí)定量PCR、RT-PCR、免疫檢測、原位雜交或芯片 方法檢測FAN1基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對(duì)FAN1基因的引 物和/或探針。
[0017] 進(jìn)一步，所述基因檢測試劑盒包含SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系、用于擴(kuò)增 FAN1基因和管家基因的引物對(duì);所述SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含:PCR緩沖液、 dNTPs、SYBR Green熒光染料。
[0018] 進(jìn)一步，所述擴(kuò)增FAN1基因的引物對(duì)序列包括正向引物SEQ ID NO.5和反向引物 SEQ ID N0.6。
[0019] 上面所述的基因檢測試劑盒可用于檢測包括FAN1基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與 II型糖尿病相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平，所述蛋白免疫檢測試劑盒可用于檢測包括FAN1 蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如，與II型糖尿病相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。
[0020] 本發(fā)明中與FAN1基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA 或其它衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性 結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長度。同樣，所述探 針的長度可長至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長度 對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長一 般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身 互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
[0021 ]本發(fā)明中所述FAN1蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述FAN1蛋 白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾，例如，嵌合抗體、scFv、Fab、 F(ab'）2、Fv等。只要所述片段能夠保留與FAN1蛋白的結(jié)合能力即可。用于檢測蛋白質(zhì)水平 的抗體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體， 如所述的片段可以通過化學(xué)法從頭合成或利用重組DNA技術(shù)合成。
[0022]在本發(fā)明的上下文中，"FAN1基因"包括人FAN1基因以及人FAN1基因的任何功能等 同物的多核苷酸。FAN1基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中FAN1基因（NC_ 000015.10)DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0023] 優(yōu)選地，F(xiàn)AN1基因的編碼序列包括以下任一種DNA分子：
[0024] (1)序列表中SEQ ID N0.1所示的DNA序列；
[0025] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0026] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0027]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述FAN1基因的編碼序列是SEQ ID N0.1所示的DNA 序列。
[0028]本發(fā)明的FAN1基因可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達(dá)FAN1的DNA 片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。所述載體所述載體包括病毒載體、真核表達(dá)載體。
[0029] 病毒載體可以是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關(guān)病毒載體、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。
[0030] 真核表達(dá)載體可以是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、 pcDNA3.0表達(dá)載體、pcDNA3.1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEF Bos表達(dá)載體、pTet表達(dá)載體、 pTRE表達(dá)載體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301 等。
[0031] 在本發(fā)明的上下文中，F(xiàn)AN1基因表達(dá)產(chǎn)物包括人FAN1蛋白以及人FAN1蛋白的部分 肽。所述FAN1蛋白的部分肽含有與II型糖尿病相關(guān)的功能域。
[0032] "FAN1蛋白"包括FAN1蛋白以及FAN1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 FAN1蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘 導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人FAN1的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0033]優(yōu)選地，F(xiàn)AN1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0034] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0035] (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地1-30 個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。
[0036] (3)與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱為序列同一性）， 優(yōu)選地，與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0037] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述FAN1蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0038] 通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0039] 氨基酸序列的修飾可以源自自發(fā)突變或遺傳后修飾，也可以人工誘導(dǎo)天然基因產(chǎn) 生。通過添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是NDUFAB1蛋白的融合蛋 白。對(duì)于與FAN1蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留FAN1蛋白的 生物學(xué)活性即可。
[0040] 本發(fā)明的FAN1蛋白也包括對(duì)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留FAN1蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類修飾蛋白質(zhì)中突變的 氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。
[0041] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0042] 本發(fā)明提供了一種II型糖尿病的分子診斷手段，與傳統(tǒng)的診斷手段相比，通過檢 測FAN1基因的表達(dá)水平來進(jìn)行診斷更及時(shí)、更特異、更靈敏，實(shí)現(xiàn)II型糖尿病患者的早期診 斷。
【附圖說明】
[0043]圖1顯示高通量測序法檢測FAN1基因在II型糖尿病患者中的表達(dá)情況。
[0044]圖2顯示QPCR法檢測FAN1基因在II型