2)。
[0093] 2.2蘋果胚原生質(zhì)體的制備
[0094] 用CPW13M浸泡步驟2.1得到的懸浮細胞lh，棄上層液體，得到CPW13M處理的懸浮細 胞;按照CPW13M處理的懸浮細胞和酶液的體積比為1:10的比例向CPW13M處理的懸浮細胞中 加入酶液，得到酶-懸浮細胞混合液，將酶-懸浮細胞混合液在弱光(500lux)、23± 1°C、40r/ min下孵育20h，得到酶解后的酶-懸浮細胞混合液（圖3);將酶解后的酶-懸浮細胞混合液用 300目尼龍網(wǎng)篩輕輕研磨過濾，釋放原生質(zhì)體，得到酶-原生質(zhì)體混合液；
[0095] 按照下述方法純化酶-原生質(zhì)體混合液中的原生質(zhì)體:將酶-原生質(zhì)體混合液輕輕 加至CPW25S上，過程輕柔緩慢，避免沖撞分界面，盡量使其保持穩(wěn)定，得到下層為CPW25S上 層為酶 -原生質(zhì)體混合液的分層液體1;將分層液體1在800rpm下離心15min，使原生質(zhì)體位 于所述分層液體1的界面處（圖4中A)，小心地將界面處的原生質(zhì)體層吸出，得到蘋果胚原生 質(zhì)體;將蘋果胚原生質(zhì)體置于新的離心管中，用W5溶液洗滌2-3次，每次洗滌均在800rpm下 離心6min，最后用W5溶液重懸蘋果胚原生質(zhì)體，得到蘋果胚原生質(zhì)體懸浮液。
[0096] 將蘋果胚原生質(zhì)體進行鏡檢，結(jié)果如圖4中B和C所示，結(jié)果顯示，純化后可得到高 質(zhì)量的由細胞膜包裹著的圓球狀蘋果胚原生質(zhì)體。
[0097]二、蘋果中目的基因的瞬時表達 [0098] 1、目的基因的準(zhǔn)備
[0099] 將載體E3025的EcoR I和Sal I識別序列間的DNA片段替換為SEQ ID No.l所示的 MsDREB2C基因（MsDREB2C基因為蘋果基因），得到重組載體E3025-MsDREB2C，E3025-MsDREB2C表達SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)。
[0100] 其中，SEQ ID No.l為MsDREB2C基因的序列，編碼SEQ ID如.2所示的]\^01^82(：蛋 白。MsDREB2C基因在細胞核中表達。
[0101] 2、蘋果中目的基因的瞬時表達
[0102] 按照下述方法完成目的基因轉(zhuǎn)化蘋果胚原生質(zhì)體，并將載體E3025作為對照：
[0103] 1)將步驟一的2.2的蘋果胚原生質(zhì)體懸浮液于冰上放置30min后，于800rpm下離心 6min，棄上清液，得到蘋果胚原生質(zhì)體；向蘋果胚原生質(zhì)體中加入500yL MMg重懸原生質(zhì)體， 得到蘋果胚原生質(zhì)體MMg懸浮液；
[0104] 2)向步驟1)的100μL蘋果胚原生質(zhì)體ΜMg懸浮液中加入10μg步驟1的重組載體 E3025-MsDREB2C-GFP，輕輕混勻，得到蘋果胚原生質(zhì)體-E3025-MsDREB2C-GFP混合液；向蘋 果胚原生質(zhì)體-E3025-MsDREB2C-GFP混合液中加入110yL PEG6000水溶液，混勻后得到待轉(zhuǎn) 化液;將待轉(zhuǎn)化液于23°C下孵育lOmin進行原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，得到原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化液；
[0105] 3)向步驟2)的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化液中加入440yL CPW13M，輕輕顛倒，得到轉(zhuǎn)化后液 體;將轉(zhuǎn)化后液體于800rpm下離心6min，棄上清液，得到轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體；
[0106] 4)向步驟3)的轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體中加入10OyL CPW13M溶液輕柔混勻后，再加入 900yL CPW13M，然后于細胞培養(yǎng)板上、23±1°C、弱光(5001ux)下孵育18h，得到轉(zhuǎn)化lOmin的 蘋果胚原生質(zhì)體。
[0107] 按照步驟1)-4)的方法，將孵育lOmin分別替換為孵育15min、孵育20min和孵育 30min，其他步驟均不變，分別得到轉(zhuǎn)化15min的蘋果胚原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)化20min的蘋果胚原生 質(zhì)體和轉(zhuǎn)化30min的蘋果胚原生質(zhì)體。
[0108] 激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化lOmin的蘋果胚原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)化15min的蘋果胚原生 質(zhì)體、轉(zhuǎn)化20min的蘋果胚原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)化30min的蘋果胚原生質(zhì)體中目的基因的瞬時表達 情況基本無差異，其中轉(zhuǎn)化20min的蘋果胚原生質(zhì)體中目的基因的瞬時表達情況如圖5所 不。
[0109] 結(jié)果顯示，對照中綠色熒光信號分布在整個原生質(zhì)體細胞中，而轉(zhuǎn)化lOmin的蘋果 胚原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)化15min的蘋果胚原生質(zhì)體、轉(zhuǎn)化20min的蘋果胚原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)化30min的蘋 果胚原生質(zhì)體中綠色熒光信號均集中在細胞核區(qū)域，表明MsDREB2C基因在細胞核區(qū)域有表 達，與MsDREB2C基因在自然情況下的表達特點一致。上述結(jié)果表明，本發(fā)明的方法可以將目 的基因在蘋果中進行瞬時表達，并可進行目的基因的功能驗證。
【主權(quán)項】
1. 蘋果轉(zhuǎn)化方法，包括以蘋果胚原生質(zhì)體為受體進行蘋果轉(zhuǎn)化； 所述蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法包括下述A1)和A2): A1)將蘋果胚性愈傷組織進行懸浮繼代培養(yǎng)，得到懸浮細胞； A2)用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細胞得到所述蘋果胚原生質(zhì)體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述用纖維素酶和果膠酶酶解所述懸浮細 胞前還包括將所述懸浮細胞用CPW13M進行處理;所述CPW13M為向細胞-原生質(zhì)體清洗液中 加入甘露醇得到的甘露醇的質(zhì)量百分比濃度為11 % -15 %的溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：用所述CPW13M處理所述懸浮細胞的時間為 0.5~2h〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述A2)包括A21)和A22): A21)用含有所述纖維素酶和所述果膠酶酶的酶液浸泡所述懸浮細胞，得到酶-原生質(zhì) 體混合液； A22)將所述酶-原生質(zhì)體混合液加至CPW25S上，得到下層為CPW25S上層為酶-原生質(zhì)體 混合液的分層液體1;將所述分層液體1進行離心，使原生質(zhì)體位于所述分層液體1的界面 處，分離原生質(zhì)體，得到所述蘋果胚原生質(zhì)體； 所述CPW25S為向所述CPW溶液中加入蔗糖得到的溶液;所述CPW25S中蔗糖質(zhì)量百分比 濃度為23 %-27 %。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述蘋果胚性愈傷組織的制備方 法包括:將蘋果胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行誘導(dǎo)培養(yǎng)得到蘋果胚性愈傷組織； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2，4-D和蔗糖得到的固體培養(yǎng)基。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述方法，其特征在于:所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法還包 括將所述蘋果胚性愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)； 所述繼代培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2，4-D和蔗糖得到的固體培養(yǎng)基。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述方法，其特征在于：所述蘋果為用于蘋果砧木的蘋果 種。8. 下述P1或P2的方法： P1、權(quán)利要求1-7中任一所述蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法； P2、權(quán)利要求5-7中任一所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法。9. 下述Ml或M2的產(chǎn)品： M1、用于制備蘋果胚原生質(zhì)體的成套試劑，為權(quán)利要求1-6中所述懸浮系繼代培養(yǎng)基、 所述CPW13M、所述CPW25S、所述細胞-原生質(zhì)體清洗液、所述纖維素酶、所述果膠酶酶、所述 誘導(dǎo)培養(yǎng)基、所述繼代培養(yǎng)基中的至少兩種； M2、用于誘導(dǎo)蘋果胚性愈傷組織的成套試劑，為權(quán)利要求5所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基和/或權(quán)利 要求6所述繼代培養(yǎng)基。10. 下述任一應(yīng)用： XI、權(quán)利要求1-7中任一所述蘋果轉(zhuǎn)化方法在蘋果中瞬時表達目的基因中的應(yīng)用； X2、權(quán)利要求1-7中任一所述蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法在蘋果中瞬時表達目的基因 中的應(yīng)用； X3、權(quán)利要求5-7中任一所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法在蘋果中瞬時表達目的基 因中的應(yīng)用； X4、權(quán)利要求9所述產(chǎn)品在蘋果中瞬時表達目的基因中的應(yīng)用； X5、權(quán)利要求1-7中任一所述蘋果轉(zhuǎn)化方法在植物基因功能驗證中的應(yīng)用； X6、權(quán)利要求1-7中任一所述蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法在植物基因功能驗證中的應(yīng) 用； X7、權(quán)利要求5-7中任一所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法在植物基因功能驗證中的 應(yīng)用； X8、權(quán)利要求9所述產(chǎn)品在植物基因功能驗證中的應(yīng)用； X9、權(quán)利要求5-7中任一所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法在制備蘋果胚原生質(zhì)體的 中的應(yīng)用； X10、權(quán)利要求5-7中任一所述蘋果胚性愈傷組織的制備方法在蘋果轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用； XII、權(quán)利要求1-7中任一所述蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法在制備蘋果胚原生質(zhì)體的中 的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了目的基因轉(zhuǎn)化蘋果的方法及其在蘋果中瞬時表達目的基因中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的蘋果轉(zhuǎn)化方法，包括用含有目的基因的侵染液侵染蘋果胚原生質(zhì)體，完成蘋果轉(zhuǎn)化；蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法包括：A1)將蘋果胚性愈傷組織在懸浮系繼代培養(yǎng)基中進行懸浮繼代培養(yǎng)，得到懸浮細胞；A2)用CPW13M處理懸浮細胞，得到CPW13M處理的懸浮細胞；A3)用纖維素酶和果膠酶酶解CPW13M處理的懸浮細胞得到所述蘋果胚原生質(zhì)體。實驗證明，本發(fā)明的蘋果轉(zhuǎn)化方法可以將目的基因在蘋果中進行瞬時表達，可以用來進行目的基因的功能驗證及蛋白質(zhì)和細胞器的定位，還可用來檢測蛋白質(zhì)互作及細胞代謝。
【IPC分類】C12N15/82, C12N5/04
【公開號】CN105647963
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李天紅, 劉冬, 郭蕭, 趙迪, 王彥濤
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月14日