傷組織的制備方法在蘋果轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用；
[0055] XII、所述蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法在制備蘋果胚原生質(zhì)體的中的應(yīng)用。
[0056] 本發(fā)明中，所述蘋果可為可用于蘋果砧木的蘋果種，如新疆野蘋果（Malus sieversii Roem)〇
[0057]本發(fā)明中，所述懸浮系繼代培養(yǎng)基可為無菌培養(yǎng)基。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基可為無菌培 養(yǎng)基。所述繼代培養(yǎng)基可為無菌培養(yǎng)基。所述CPW13M可為無菌液體。所述酶液可為無菌液 體。所述CPW25S可為無菌液體。
[0058]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的蘋果轉(zhuǎn)化方法能將目的基因在野生蘋果中進(jìn)行瞬時表達(dá)，并 使目的基因得到表達(dá):對照中綠色熒光信號分布在整個原生質(zhì)體細(xì)胞中，而轉(zhuǎn)化目的基因 MsDREB2C基因的蘋果胚原生質(zhì)體中綠色熒光信號集中在細(xì)胞核區(qū)域，表明MsDREB2C基因在 細(xì)胞核區(qū)域有表達(dá)，與MsDREB2C基因在自然情況下的表達(dá)特點(diǎn)一致。本發(fā)明的蘋果胚性愈 傷組織的制備方法能制備蘋果胚性愈傷組織:利用本發(fā)明的蘋果胚性愈傷組織的制備方法 得到的愈傷組織顏色淡黃、質(zhì)地松脆、表面有顆粒狀凸起，鏡檢觀察到細(xì)胞為圓形細(xì)胞，并 且經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后形態(tài)穩(wěn)定，增殖能力強(qiáng)。本發(fā)明的蘋果胚原生質(zhì)體的制備方法能制備 高質(zhì)量的由細(xì)胞膜包裹著的圓球狀蘋果胚原生質(zhì)體。
[0059]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的蘋果轉(zhuǎn)化方法可以將目的基因在蘋果中進(jìn)行瞬時表達(dá)，可以 用來進(jìn)行目的基因的功能驗(yàn)證及蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的定位，還可用來檢測蛋白質(zhì)互作及細(xì)胞 代謝。
【附圖說明】
[0060]圖1為蘋果胚性愈傷組織的外觀。其中，A為蘋果幼胚接種后ld;B為蘋果幼胚接種 后7d;C為蘋果幼胚接種后21d;D為繼代培養(yǎng)一次的蘋果胚性愈傷組織;E為繼代培養(yǎng)三次的 蘋果胚性愈傷組織;F為繼代培養(yǎng)五次的蘋果胚性愈傷組織。
[0061 ]圖2為懸浮細(xì)胞。
[0062] 圖3為蘋果胚性愈傷組織的酶解結(jié)果。其中A為酶解前，B為酶解后。
[0063] 圖4為蘋果胚原生質(zhì)體的純化和鏡檢。其中A為純化過程中的分層情況，1為酶解 液，2為原生質(zhì)體層，3為殘?jiān)癈PW25S;B為未經(jīng)純化的原生質(zhì)體鏡檢結(jié)果;C為純化后的原 生質(zhì)體鏡檢結(jié)果。
[0064]圖5為目的基因在蘋果胚原生質(zhì)體中的表達(dá)情況。其中，A為明場下的轉(zhuǎn)化E3025-MsDREB2C的蘋果胚原生質(zhì)體;B為暗場下的轉(zhuǎn)化E3025-MsDREB2C的蘋果胚原生質(zhì)體;C為明 暗疊加場下的轉(zhuǎn)化E3025-MsDREB2C的蘋果胚原生質(zhì)體;D為明場下的轉(zhuǎn)化E3025的蘋果胚原 生質(zhì)體;E暗場下的轉(zhuǎn)化E3025的蘋果胚原生質(zhì)體;F為明暗疊加場下的轉(zhuǎn)化E3025的蘋果胚 原生質(zhì)體。Bar = 10ym〇
【具體實(shí)施方式】
[0065]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0066] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0067] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0068]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為在室溫（23 ± 1°C )下進(jìn)行。下述實(shí) 施例中的新疆野蘋果(Malus sieversii Roem)(李育農(nóng).2001.蘋果屬植物種質(zhì)資源研究. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社:20-134.)，公眾可從申請人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的 相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0069] 下述實(shí)施例中的載體E3025為將pSAT6-RFP-Nl載體中的RFP基因替換為GFP基因， 保持其他序列不變得到的載體，載體E3025表達(dá)綠色熒光蛋白GFP。其中pSAT6-RFP-Nl載體 記載在文南犬（Sang-Min Chung et al.A versati le vector system for multiple gene expression in plants .TRENDS in Plant Science Vol.lONo.8August 2005)中。公眾可 從申請人處獲得載體E3025,該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用 途使用。
[0070] 下述實(shí)施例中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2,4_D和蔗糖得到的無菌固 體培養(yǎng)基;其中84、2,4-0和蔗糖的濃度分別為31^/1、111^/1和3%(質(zhì)量百分比濃度）。
[0071] 下述實(shí)施例中的繼代培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2，4-D和蔗糖得到的無菌固 體培養(yǎng)基;其中BA、2，4-D和蔗糖的濃度分別為4mg/L、2mg/L和3 % (質(zhì)量百分比濃度）。
[0072]下述實(shí)施例中的懸浮系繼代培養(yǎng)基為向MS培養(yǎng)基中加入BA、2,4_D、維生素 C和蔗 糖得到的無菌培養(yǎng)基，其中BA、2，4-D、維生素 C和蔗糖的濃度分別為0.5mg/L、3mg/L、2mg/L 和3% (質(zhì)量百分比濃度），pH為5.8。
[0073]下述實(shí)施例中的CPW13M為向CPW溶液中加入甘露醇得到的甘露醇質(zhì)量百分比濃度 為1 3 %的無菌溶液。CPW溶液由水和溶質(zhì)組成，CPW溶液的溶質(zhì)及其濃度分別為 KH2P〇427.2mg/L、KN〇3 101.0mg/L、CaCl2.2H20 1480.0mg/L、MgS〇4.7H20 246.0mg/L、KI 0.16mg/L及CuS〇4 · 5H20 0.025mg/L。
[0074]下述實(shí)施例中的酶液為由溶質(zhì)和溶液；溶劑為CPW13M，溶質(zhì)及其濃度分別為 100000U/L Cellulase R-10、15000U/L Pectolase Y-23、0.65mol/L D-mannitol、1.0% (質(zhì)量百分比濃度)聚乙烯啦咯烷酮(PVP)、0.1% (質(zhì)量百分比濃度)MES和0.1% (質(zhì)量百分 比濃度）85六，？!1為5.6。(^11111&%1?-10為北京優(yōu)尼康生物科技有限公司產(chǎn)品，貨號為 C8260-100;Pectolase Y-23為北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司產(chǎn)品，貨號為MMF-1069。
[0075]下述實(shí)施例中的W5溶液為由水和溶質(zhì)組成的無菌溶液，W5溶液的溶質(zhì)及其濃度分 別為CaCl2 · 2H2O 125mmol/L，NaCl 154·Ommol/L，KC1 5.0mmol/L，葡萄糖5.0mmol/L，一水 嗎啉乙磺酸(MES)5 · 0mmol/L〇
[0076] 下述實(shí)施例中的CPW25S為向CPW溶液中加入蔗糖得到的蔗糖質(zhì)量百分比濃度為 25%的無菌溶液。
[0077] 下述實(shí)施例中的MMg為由溶質(zhì)和溶劑組成的無菌溶液;溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度分 別為MgCl2 15mmol/L，MES 0.1%(質(zhì)量百分比濃度)和甘露醇(mannitol)0.4mol/L。
[0078] 下述實(shí)施例中的PEG6000水溶液為由溶質(zhì)和溶劑組成的無菌溶液;溶劑為水，溶質(zhì) 及其濃度分別為PEG6000 40% (質(zhì)量百分比濃度）。
[0079] 實(shí)施例1、蘋果中目的基因的瞬時表達(dá)
[0080] 蘋果中目的基因的瞬時表達(dá)，包括利用蘋果轉(zhuǎn)化方法將目的基因轉(zhuǎn)至蘋果中，具 體為用含有目的基因的侵染液侵染蘋果胚原生質(zhì)體，完成蘋果轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重 復(fù)實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下：
[0081] -、蘋果胚原生質(zhì)體的制備
[0082] 1、蘋果胚性愈傷組織的制備
[0083] 1.1外植體消毒
[0084] 將70DAFB(盛花后天數(shù)，Day after full bloom)新疆野蘋果（Malus sieversii Roem)的幼果清洗干凈，并用75% (體積百分比濃度）的乙醇水溶液表面消毒3min，然后用有 效氯質(zhì)量百分比為5%的次氯酸鈉水溶液消毒15min，最后用無菌水沖洗2-3次，得到無菌幼 果。
[0085] 1.2蘋果胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
[0086]取出步驟1.1的無菌幼果的種子，在無菌條件下用鑷子小心去除種皮，得到蘋果幼 胚，將蘋果幼胚切成2mm見方小塊后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，而后在23 ± TC下避光培養(yǎng)2Id， 得到蘋果胚性愈傷組織。
[0087] 1.3蘋果胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)
[0088]將步驟1.2的蘋果胚性愈傷組織接種于繼代培養(yǎng)基上，而后在23 ±1°C下避光培養(yǎng) 18d，得到繼代培養(yǎng)的蘋果胚性愈傷組織，將該繼代培養(yǎng)的蘋果胚性愈傷組織在23±1°C、黑 暗下重復(fù)繼代培養(yǎng)5次。
[0089] 觀察步驟1.2得到的蘋果胚性愈傷組織和步驟1.3的繼代培養(yǎng)的蘋果胚性愈傷組 織，蘋果幼胚接種后7-21d得到的蘋果胚性愈傷組織顏色淡黃、質(zhì)地松脆、表面有顆粒狀凸 起（圖1中B和C)，鏡檢觀察到細(xì)胞為圓形細(xì)胞，并且經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后形態(tài)穩(wěn)定，增殖能力 強(qiáng)(圖1中D-F)〇
[0090] 2、蘋果胚原生質(zhì)體的制備
[0091] 2.1懸浮細(xì)胞的制備
[0092]用40目不銹鋼網(wǎng)篩研磨步驟1得到的蘋果胚性愈傷組織，得到研磨物，該研磨物 (顆粒直徑約40μηι);將研磨物在懸浮系繼代培養(yǎng)基中懸浮繼代培養(yǎng)8d，懸浮繼代培養(yǎng)的條 件為黑暗、150r/min下，溫度為23± 1°C，重復(fù)繼代培養(yǎng)2次，得到懸浮細(xì)胞(圖