一株重組狂犬病疫苗毒株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組狂犬病疫苗毒株，尤其是一種能有效激活樹突狀細(xì)胞(DCs) 從而提高免疫原性的重組狂犬病疫苗毒株。
【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病毒(RABV)屬于彈狀病毒科，是單股負(fù)鏈RNA病毒?？袢∈侨祟愖罟爬系膫?染病之一，并且仍然對世界范圍內(nèi)的公共安全造成威脅。每年全世界有55,000人死于狂犬 病，數(shù)百萬人接受暴露后免疫。絕大多數(shù)的人類狂犬病例發(fā)生在亞洲和非洲的發(fā)展中國家， 在這些國家，犬仍然是主要的傳染源。RABV隨唾液進(jìn)入咬傷部位，在肌肉中短暫孵育后進(jìn)入 最近的神經(jīng)纖維，并逐漸向腦移行，傷口部位離腦部越近，發(fā)病的潛伏期越短，病毒進(jìn)入腦 部的時(shí)間也越快，一旦進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)，RABV復(fù)制和迀移將不易干涉。目前，疫苗免疫是預(yù)防 和控制狂犬病的有效手段，依靠疫苗免疫寵物的方式在過去的50年中大大降低了狂犬病的 發(fā)生。
[0003] 最近的研究發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞(DCs)對保護(hù)性免疫的產(chǎn)生尤為重要。DCs是最有效的 抗原遞呈細(xì)胞，被激活后能夠增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫，在聯(lián)系先天性免疫和獲得 免疫方面發(fā)揮重要作用。目前的疫苗大多是利用突變的狂犬病毒弱毒株生產(chǎn)的滅活疫苗或 者缺失疫苗，生產(chǎn)過程對病毒滴度要求嚴(yán)格，成本高。如果能在傳統(tǒng)疫苗基礎(chǔ)上進(jìn)行改良， 使其激活DCs的能力增強(qiáng)，將有望增強(qiáng)傳統(tǒng)疫苗的免疫原性，從而達(dá)到中和抗體滴度升高， 保護(hù)率上升的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種能有效激活樹突狀細(xì)胞(DCs)從而提高免疫原性的重組 狂犬病疫苗毒株。
[0005] 申請人發(fā)現(xiàn)一種通過噬菌體展示技術(shù)篩選出的小肽DCBp(FYPSYHSTPQRP)能夠與 樹突狀細(xì)胞(DCs)結(jié)合并將其有效激活。本發(fā)明將DCBp肽插入狂犬病毒SAD突變株(G194， G333)--LBNSE毒株的糖蛋白基因的信號肽后，構(gòu)建新型疫苗LBNSE-DCBp，研究發(fā)現(xiàn)該疫 苗能顯著提高疫苗激活DCs的能力，從而產(chǎn)生更多的中和抗體，更有效地為宿主提供保護(hù) 力。
[0006] DCBp肽由12個氨基酸組成，氨基酸序列為FYPSYHSTPQRP，核苷酸序列為 ttctaccccagctaccacagcaccccccagaggccc(如SEQ ID NO: 1 所不）aDCCp是一段不能與DCs結(jié) 合的對照小肽，氨基酸序列為EPIHPETTFTNN。將小肽DCBp或DCCp按照圖1所示策略PCR擴(kuò)增 出來后插入狂犬病毒疫苗株--LBNSE毒株，構(gòu)建成新型疫苗LBNSE-DCBp或LBNSE-DCCp (構(gòu) 建策略如圖2所示）。病毒拯救成功后，在BSR細(xì)胞上進(jìn)行的多步生長曲線顯示，小肽的插入 并未影響病毒的復(fù)制（圖3)。
[0007] 經(jīng)體內(nèi)試驗(yàn)表明，在LBNSE株G蛋白信號肽后加入DCBp或DCCp后，致病性不受影響。 每組10只ICR小鼠分別腦內(nèi)注射DMEM或1 ·6Χ 106FFU LBNSE或LBNSE-DCBp或LBNSE-DCCp每 天記錄小鼠體重變化，持續(xù)兩周。結(jié)果顯示在病毒G蛋白插入DCBp或DCCp小肽后小鼠體重變 化不受影響，表明重組病毒LBNSE-DCBp、LBNSE-DCCp與LBNSE的致病性無顯著差異（圖4)。
[0008] 體外試驗(yàn)顯示，由小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)GM-CSF誘導(dǎo)分化的DCs，按照病毒/細(xì)胞=1的比 率感染上述病毒，24小時(shí)后通過流式細(xì)胞儀檢測樹突狀細(xì)胞激活的表面標(biāo)志分子CD86和 CD80，計(jì)算DCs激活比例，結(jié)果表明LBNSE-DCBp與LBNSE-DCCp和LBNSE相比激活DCs的能力顯 著提高（圖5)。
[0009] 進(jìn)一步的研究表明免疫了 LBNSE-DCBp的小鼠產(chǎn)生更多的中和抗體。每組10只ICR 小鼠肌肉免疫以上疫苗，在免疫后14，21，28，35和42天眼眶取血分離血清，F(xiàn)AVN法滴定狂犬 病毒中和抗體。結(jié)果顯示，中和抗體水平在免疫后21天達(dá)到最高，并持續(xù)至35天，且LBNSE-DCBp組的中和抗體顯著高于LBNSE-DCCp和LBNSE組（圖6)。我們將新型疫苗用于保護(hù)性試 驗(yàn)，按IX l〇6FFU的劑量肌肉免疫6-8周齡ICR小鼠，免疫后21天，經(jīng)腦感染狂犬病毒強(qiáng)毒株 CVS24,感染后每天記錄小鼠死亡情況。結(jié)果顯示LBNSE-DCBp組對小鼠的保護(hù)率高于LBNSE 和LBNSE-DCCp組（圖7)。表明LBNSE-DCBp是良好的潛在疫苗。
[0010] 出于安全性考慮，目前使用的狂犬疫苗主要是滅活疫苗，所以我們把疫苗用多聚 甲醛滅活處理后肌肉免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)LBNSE-DCBp產(chǎn)生中和抗體的能力（圖8)和對小鼠的保 護(hù)率顯著高于LBNSE-DCCp和LBNSE(圖9)。同時(shí)考慮到流浪犬和野生動物免疫的可能性，將 疫苗經(jīng)口服的方式免疫小鼠，觀察小鼠產(chǎn)生中和抗體的能力（圖10)和疫苗的保護(hù)率（圖 11)。結(jié)果顯示無論是作為滅活疫苗還是口服疫苗，LBNSE-DCBp與LBNSE-DCCp和LBNSE相比， 外周血中和抗體的產(chǎn)生都有顯著升高，且保護(hù)率也明顯上升。
【附圖說明】
[0011] 圖1是PCR擴(kuò)增DCBp和DCCp的方法示意圖。
[0012] 圖2是在狂犬病毒毒株LBNSE基因組中插入DCBp和DCCp的示意圖。
[0013] 圖3是重組病毒在BSR細(xì)胞上的生長曲線。
[0014]圖4是重組病毒經(jīng)腦注射后對小鼠體重的影響。
[0015]圖5是重組病毒在體外激活樹突狀細(xì)胞(DCs)的能力檢測。
[0016] 圖6是重組病毒經(jīng)肌肉免疫小鼠后，不同時(shí)間測得的小鼠血液中和抗體的滴度。
[0017] 圖7是重組病毒經(jīng)肌肉免疫小鼠后，不同時(shí)間測得的小鼠存活率。
[0018] 圖8是重組病毒經(jīng)滅活后肌肉免疫小鼠，不同時(shí)間測得的小鼠血液中和抗體的滴 度。
[0019] 圖9是重組病毒經(jīng)滅活后肌肉免疫小鼠，不同時(shí)間測得的小鼠存活率。
[0020] 圖10是重組病毒經(jīng)口服免疫小鼠后，不同時(shí)間測得的小鼠血液中和抗體的滴度。
[0021] 圖11是重組病毒經(jīng)口服免疫小鼠后，不同時(shí)間測得的小鼠存活率。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0023]實(shí)施例1重組病毒的設(shè)計(jì)、拯救、鑒定及免疫效力初步評價(jià) [0024] 1材料和方法
[0025] 1 · 1 材料
[0026] 1.1.1 病毒
[0027] LBNSE毒株，CVS24毒株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
[0028] 1.1.2 質(zhì)粒
[0029] 用于拯救LBNSE毒株的感染性克隆pLBNSE的構(gòu)建策略及具體方法可參考有關(guān)文獻(xiàn) (Wen Y,Wang Η,ffu Η,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immune response to vaccination.J Virol 85:1634-1·)。
[0030] 1.1.3細(xì)胞和單克隆抗體
[0031] BSR細(xì)胞(BHK-21細(xì)胞的一個克隆細(xì)胞系），生長于含10%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(Gibco，Grand Island,NY,USA)的DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM) (Mediatech，Herndon，VA，USA)培養(yǎng)液。異硫氛酸焚光素 （Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的狂犬病毒核蛋白單克隆抗體購自Fu jirebio(Melvin，PA, USA)公司。
[0032] 1.1.4實(shí)驗(yàn)動物
[0033] 6-8周齡的ICR小鼠，購于湖北省疾控中心。
[0034] 1.1.5主要試劑
[0035]膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提和大提試劑盒、RNeasy mini-kit RNA提取試劑盒購于 OMEGA公司，Superfect轉(zhuǎn)染試劑盒購于QIAGEN公司，各種限制性內(nèi)切酶購于New England Biolabs公司。SuperscriptTM RT-PCR試劑盒購于Invitrogen公司。
[0036] 1.2 LBNSE-DCBP全長的構(gòu)建及檢測
[0037] 采用融合PCR的方法將DCBp和DCCp插入LBNSE全長G基因的信號肽之后，所用引物 為：
[0038] 1-F：CCGATTTAAATAAAGCATACAAGTCAGTTTTGTCAGGCATGAG；
[0039] 2-R：GTCAGGTCCTAATATTATACCATTGAAAAACACCCCGTTCACATG
[0040] Bpl-R：CTGGGGGGTGCTGTGGTAGCTGGGGTAGAAcccaaaacacaatggaaaaac；
[0041 ] Bp2~F：CCCAGCTACCACAGCACCCCCCAGAGGCCCaaattccctatttacacgatac
[0042] Cpl-R：GGTGAAGGTGGTCTCGGGGTGGATGGGCTCcccaaaacacaatggaaaaac
[0043] Cp2-F：ATCCACCCCGAGACCACCTTCACCaacaacaaattccctatttacacgatac
[0044] 引物中下劃線標(biāo)記段分別為Swal和PpuMIApl-R和Bp2-F引物序列中大寫字母代 表DCBP序列的一部分，上游引物和下游引物中的DCBP序列有24個堿基重疊，融合PCR后即可 得到插入了 DCBp的LBNSE片段。