一株低毒力重組豬腦心肌炎病毒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物動物疫苗技術領域，尤其涉及一株低毒力重組豬源腦心肌炎病 毒，還涉及所述低毒力重組豬源腦心肌炎病毒的應用。
【背景技術】
[0002] 腦心肌炎病毒（Encepha 1 omyocardi t i s virus，EMCV)屬于微RNA病毒科 (Picornaviridae)成員。EMCV對嚙齒類、豬、老虎、牛、大象、以及人在內的多種靈長類動物， 致病性差異較大。某些EMCV分離株感染仔豬可引發(fā)急性致死性心肌炎，而感染母豬則會導 致流產、死胎等繁殖障礙。該病毒已成世界性分布，阻礙了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，也對人類的健康 造成影響。目前，全世界大概有40個毒株，從2005年至今，我國已分離到大約15個EMCV毒株， 為該病毒深入研究提供豐富的材料。
[0003] EMCV為單股正鏈RNA病毒，全長為7.8kb，包括5 ' UTR、3 ' UTR和中間一個較大的開放 閱讀框(0RF)。該閱讀框編碼11個蛋白，包括4個結構蛋白￥?1、￥?2、￥?3、￥?4和7個非結構蛋 白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D以及L蛋白。其中VP1的變異性最大，是EMCV重要的保護性抗原。隨 著RNA病毒全長cDNA感染性克隆技術的建立，研究者可以有效體外轉錄出感染性RNA，以拯 救RNA病毒。目前，RNA病毒拯救系統(tǒng)至少有4種。先前報道的EMCV感染性克隆的構建都是將 全長病毒的cDNA置于T7/SP6啟動子的控制下，利用外源T7/SP6RNA聚合酶在體外轉錄RNA基 因組，再轉染易感細胞來拯救病毒，也有相關技術申請過專利。已有文獻報道可以將體外轉 錄過程轉移到細胞體內進行，將病毒全長cDNA置于真核啟動子CMV控制下，利用細胞內的 RNA聚合酶I和RNA聚合酶II轉錄成RNA拯救病毒，該種方法產生的病毒量大約是前者的100 倍?，F(xiàn)有技術中，還沒有使用此種方法拯救豬腦心肌炎病毒的報道。

【發(fā)明內容】

[0004] 為了解決以上RNA病毒拯救中拯救豬腦心肌炎病毒方法方面存在的空白，本申請 公開了一株低毒力豬源腦心肌炎病毒。
[0005] 本申請還公開了上述一株低毒力豬源腦心肌炎病毒的應用。
[0006] 本申請是通過以下措施實現(xiàn)的：
[0007] -株低毒力重組豬源腦心肌炎病毒，是通過以下步驟構建得到的：
[0008] (1)提取豬源腦心肌炎病毒株總RNA，RT_PCT擴增目的基因片段，擴增用引物如下
[0009] AF 5-GCGTTAATTAAACCGTCTTGAAAGCCGGGGGTGGGAGATC-3
[0010] AR 5-TCAGCTAGCAATGGAAGCATATTAG-3
[0011] BiF 5-GCGTTAATTAACATTGCTAGCTGATCAAAATACAGAAG-3
[0012] BiR 5-CACAAAGTCAGCAGTTGCGTCTGCGT-3
[0013] B2F 5-GAAAACGCAGACGCAACTGCTGACTTTGTG-3
[0014] B2R 5-TCTCTCGAGAGCACCCTGTGGCTCAAAG-3
[0015] CRi 5-TTCGGCTTGGGATTTAAATATGCATTTTTTTTTTTTTTT-3
[0016] CR2 5-CTCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGTAATTCGGCTTGGGATTT-3
[0017] 以豬源腦心肌炎病毒總RNA作為模板，以六1?、811?、821?、以及0?1為特異性下游引物， 構建反應體系獲得的A、、B 2、C片段的cDNA，分別以AF/AR，BiFMR，B2F/B2R，CF/CR 2為引物， 相應的cDNA為模板進行PCR反應，獲得A、Bi、B2、C四個片段，然后利用MVB2R為引物，將也和 B2片段進行融合反應，獲得B片段；
[0018] (2)將A、B、C片段分別與pEasy-simple Blunt克隆載體進行連接，轉化感受態(tài)細 胞，培養(yǎng)，提取陽性重組質粒，分別得到重組質粒pEasy-A、pEasy_B和pEasy-C;
[0019] (3)利用雙酶切的方法將C、B、A片段依次克隆至載體中，構建病毒全長cDNA克隆， 得重組質粒PCMV-NJ08;
[0020] (4)將重組質粒PCMV-NJ08轉染BHK-21細胞，經過培養(yǎng)得到豬源腦心肌炎病毒株感 染性克隆rNJ08。
[0021] 所述的低毒力豬源腦心肌炎病毒，優(yōu)選rNJ08接種BHK-21細胞，連續(xù)傳代，第3、5、 10 代拯救病毒的 TCID50 為 107·66 ~108'5TCID5〇/mL〇
[0022] 所述的低毒力豬源腦心肌炎病毒，優(yōu)選步驟(3)中利用雙酶切的方法將C、B、A片段 依次克隆至載體中步驟如下：
[0023] pEasy-C質粒用PacI和Spel雙酶切，構建連接體系利用T4連接酶將片段C克隆至用 同樣酶切處理的的載體CMV-β，22 °C連接5h，轉化Transl-Tl感受態(tài)細胞，獲得的陽性質粒命 名為pCMV-C;然后pEasy-B質粒經PacI和Xhol雙酶切，將酶切純化后的B片段與PacI和Xhol 雙酶切后的pCMV-C載體連接，獲得陽性質粒命名為pCMV-BC;pEasy-A質粒用PacI和Nhel雙 酶切，酶切純化后的A片段與PacI和Nhel雙酶切后的pCMV-BC載體連接，將A片段連入pCMV-BC載體中，獲得陽性質粒命名為pCMV-NJ08。
[0024]所述的低毒力豬源腦心肌炎病毒，優(yōu)選第6243位的T變成A，作為感染性克隆的遺 傳標記。
[0025]所述的低毒力豬源腦心肌炎病毒，優(yōu)選豬源腦心肌炎病毒為豬腦心肌炎病毒NJ08 株。
[0026] 所述的低毒力豬源腦心肌炎病毒在病毒拯救、病毒致弱機理及利用該病毒的cDNA 感染性克隆為載體插入不同病毒保護抗原基因、構建不同病毒的嵌合病毒來表達外源蛋白 以及由此開發(fā)出單價、雙價或多價疫苗中的應用。
[0027]將滅活的低毒力豬源腦心肌炎病毒使用ISA15A和ISA206佐劑分別配制成滅活疫 苗。
[0028] ISA15A佐劑與抗原體積比為1:4，ISA206佐劑與抗原體積比為1: 1。
[0029] 所述的應用，優(yōu)選使用BEI濃度0.002mol/L、28°C作用24h進行滅活。
[0030] 本研究采用體內轉錄的方法成功構建了B1CV反向遺傳操作系統(tǒng)，拯救獲得低毒力 重組病毒株rNJ08。將重組病毒進行滅活處理，加入ISA15A和ISA206佐劑分別配制成滅活疫 苗，接種小鼠后，均能有效地刺激機體產生較好的免疫反應，并能產生中和抗體。ISA15A和 ISA206佐劑對EMCV滅活抗原具有較好的佐劑作用，研制的EMCV滅活疫苗小鼠免疫保護率分 別為80 %和100 %。為該病毒致病機制及疫苗研制奠定了重要基礎。
[0031] 本發(fā)明的有益效果：
[0032] 1、本申請克服現(xiàn)有技術的不足，首次將豬腦心肌炎病毒NJ08毒株的全長cDNA置于 CMV啟動子控制下，采用DNA轉染系統(tǒng)拯救病毒，獲得重組病毒，方法簡便易行，轉染效率也 大大提尚并且更加穩(wěn)定，廣生的病毒量大；
[0033] 2、本申請采用DNA轉染系統(tǒng)，獲得豬源EMCV NJ08毒株的重組病毒，成功建立該病 毒cDNA感染性克隆，拯救獲得病毒，體外復制特性與原始病毒相似，但對小鼠致病性明顯減 弱，為該病毒致病機制及疫苗研制奠定了重要基礎；
[0034] 3、本申請得到的低毒力豬源腦心肌炎病毒經滅活后制備成疫苗，保護率達到90% 以上，是一種安全且保護率高的滅活疫苗。
【附圖說明】
[0035] 圖1為EMCV NJ08株基因組全長cDNA克隆構建示意圖；
[0036] 圖2為EMCV NJ08cDNA的擴增，M:DNA分子質量標準；1:A片段;2:B片段;3:C片段；
[0037] 圖3為重組質粒pCMV-NJ08酶切，M: DNA分子質量標準；1: pCMV-NJ08質粒；2: pCMV- NJ08質粒酶切產物；
[0038]圖4為拯救病毒和親本病毒在BHK-21細胞上產生的細胞病變；
[0039] 圖5為拯救病毒rNJ08遺傳標記的酶切鑒定，M:DNA分子質量；1 :rNJ08RT-PCR產物； 2: rNJ08RT-PCR 產物經 EcoI?酶切，3: NJ08RT-PCR 產物；4: NJ08RT-PCR 產物經 EcoR 頂每切； [0040]圖6為拯救病毒和親本病毒感染BHK-21細胞的間接免疫熒光；
[0041 ] 圖7為rNJ08和NJ08在BHK-21細胞上的增殖曲線；
[0042]圖8為拯救病毒與親本病毒在BHK-21細胞上的蝕斑形成；
[0043]圖9為同劑量（107TCID5Q)rNJ08和NJ08接種小鼠后的存活曲線；
[0044] 圖10為小鼠腦組織免疫組織化學分析；
[0045] 圖11為拯救病毒組與親本病毒組相對于對照組小鼠腦組織病毒的含量；
[0046]圖12為首免后3周小鼠 ELISA抗體滴度(p〈0.05);
[0047] 圖13為二免后3周小鼠 ELISA抗體滴度(p〈0.05);
[0048] 圖14為加強免疫后中和抗體水平(p〈0.05);
[0049] 圖15為淋巴細胞增值轉化試驗(p〈0.05);
[0050] 圖16不同佐劑滅活疫苗小鼠攻毒保護實驗存活率數(shù)據(jù)；
[0051]圖17不同抗原含量疫苗小鼠攻毒保護實驗存活率數(shù)據(jù)；
[0052]圖18攻毒后小鼠腦組織病理變化，A和C為發(fā)病小鼠腦組織，B和D為存活小鼠腦組 織；
[0053]圖19攻毒后小鼠心臟病理變化，A為發(fā)病小鼠心臟，B為存活小鼠心臟。
【具體實施方式】
[0054]下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步說明。
[0055] 1 材料
[0056] 1.1病毒與細胞
[0057] EMCV NJ08株由本實驗室分離并保存；幼倉鼠腎細胞(BHK-21)由本實驗室保存； ICR小鼠購自揚州大學實驗動物中心。
[0058] 1.2主要試劑
[0059] Dulbecco ' s Modified Eagle Medium 購自 Gibico 公司；Pfu ULtra? II Fusion HS